BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MƠI TRƯỜNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP CHUN NGÀNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT TỪ LÁ CÂY SỐNG ĐỜI (KALANCHOE PINNATA) LÊN QUÁ TRÌNH TĂNG SINH TẾ BÀO CĨ NG̀N GỐC TỪ DA CHUỘT NHẮT TRẮNG (MUS MUSCULLUS VAR.ALBINO) SƠ CẤP Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực Ths LẠI ĐÌNH BIÊN NGƠ QUỐC NGUYÊN ĐƯỜNG THANH HẠNH NGÂN Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2014 BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MƠI TRƯỜNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH CHIẾT TỪ LÁ CÂY SỐNG ĐỜI (KALANCHOE PINNATA) LÊN Q TRÌNH TĂNG SINH TẾ BÀO CĨ NG̀N GỐC TỪ DA CHUỘT NHẮT TRẮNG (MUS MUSCULLUS VAR.ALBINO) SƠ CẤP Giảng viên hướng dẫn Sinh viên thực Ths LẠI ĐÌNH BIÊN NGƠ QUỐC NGUN Mã số SV: 2008100005 ĐƯỜNG THANH HẠNH NGÂN Mã số SV: 2008100084 Lớp: 01ĐHSH1 Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2014 NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN TP HCM,tháng năm 2014 Ký tên LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập, làm việc hoàn thành khóa ḷn này, nhóm chúng tơi nhận được hướng dẫn, giúp đỡ quý báu của thầy cô, anh chị bạn Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới: Thạc sĩ – Lại Đình Biên, người Thầy kính mến hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện tḥn lợi cho nhóm chúng tơi thực khóa ḷn tốt nghiệp Tập thể thầy cô giáo khoa Công nghệ Sinh học Kĩ thuật môi trường, trang bị cho kiến thức kinh nghiệm quý giá trình học tập trường nhiệt tình giúp đỡ thực đề tài Tập thể bạn sinh viên khóa 01ĐHSH giúp đỡ động viên chúng tơi gặp khó khăn q trình làm việc Mặc dù có nhiều cố gắng, thời gian có hạn, trình độ, kỹ của bản thân còn nhiều hạn chế nên chắc chắn đề tài khóa ḷn tốt nghiệp của chúng tơi khơng tránh khỏi hạn chế, thiếu sót, mong được đóng góp, bảo, bổ sung thêm của thầy bạn LỜI CAM ĐOAN Chúng cam đoan khóa luận tốt nghiệp chính thực Các số liệu thu thập kết quả phân tích báo cáo trung thực, không chép từ đề tài nghiên cứu khoa học Tháng năm 2014 Sinh viên thực NGÔ QUỐC NGUYÊN ĐƯỜNG THANH HẠNH NGÂN MỤC LỤC Trang bìa lót Nhận xét của giáo viên hướng dẫn Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Danh mục bảng biểu sơ đồ Danh mục hình ảnh biểu đồ DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU VÀ SƠ ĐỜ Bảng 1.4.3.1: Cơng dụng chữa bệnh của sống đời 32 Bảng 1.4.4: Thành phần hóa học sống đời .33 Bảng 2.2.2.4: Thí nghiệm khảo sát nồng độ trypsin phương pháp phù hợp để tách tế bào đơn 40 Bảng 3.2.1.1: Tổng mật độ tế bào đơn ủ với trypsin ấm nồng độ khác 46 Bảng 3.2.1.2: Mật độ tế bào đơn sống ủ với trypsin ấm nồng độ khác .46 Bảng 3.2.2.1: Tổng mật độ tế bào đơn ủ với trypsin lạnh nồng độ khác .47 Bảng 3.2.2.2: Mật độ tế bào đơn sống ủ với trypsin ấm nồng độ khác .47 Bảng 3.2.2.3: Xác định phương pháp phù hợp để tách tế bào đơn 49 Sơ đồ 1.2.5: Quy trình nuôi cấy sơ cấp 16 Sơ đồ 2.2.1: Quy trình thu dịch chiết từ sống đời 37 Sơ đồ 2.2.2: Quy trình phân lập nuôi cấy nguyên bào sợi từ da chuột .43 DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỜ Hình 1.1.1: Cấu tạo da Hình 1.1.2.1: Cấu trúc lớp biểu bì Hình 1.1.2.2: Mô liên kết trung bì Hình 1.2.4.1: Cấu trúc không gian của enzyme trypsin 13 Hình 1.3.2: Cấu trúc nguyên bào sợi 25 Hình 1.4.1: Cây sống đời 31 Hình 2.2.2.4: Buồng đếm hồng cầu loại 25 ô lớn .41 Hình 3.1: Dịch chiết sống đời tươi .45 Hình 3.2: Tế bào được nhuộm trypan blue .46 Hình 3.3.1.1: Tế bào nuôi ngày thứ 50 Hình 3.3.1.2: Tế bào nuôi ngày thứ ba .50 Hình 3.3.1.3: Tế bào nuôi ngày thứ năm 51 Hình 3.3.1.4: Tế bào nuôi ngày thứ bảy 51 Hình 3.3.1.5: Tế bào nuôi ngày thứ tám 52 Hình 3.3.2.1: Tế bào nuôi ngày thứ 52 Hình 3.3.2.2: Tế bào nuôi ngày thứ ba .53 Hình 3.3.2.3: Tế bào nuôi ngày thứ tư 53 Hình 3.3.2.4: Tế bào nuôi ngày thứ năm 54 Hình 3.4.1: Tế bào nuôi nồng độ dịch chiết 10μl 55 Hình 3.4.2: Tế bào nuôi nồng độ dịch chiết 20μl 55 Hình 3.4.3: Tế bào nuôi nồng độ dịch chiết 30μl 56 Hình 3.4.4: Tế bào nuôi nồng độ dịch chiết 60μl 56 Đồ thị 3.2.1: Mật độ tế bào đơn sống ủ với trypsin ấm nồng độ khác .47 Đồ thị 3.2.2.1: Mật độ tế bào đơn sống ủ với trypsin lạnh nồng độ khác .48 Đồ thị 3.2.2.2: So sánh mật độ tế bào đơn sống ủ với trypsin ấm trypsin lạnh nồng độ khác 49 PHẦN MỞ ĐẦU 10 - TÀI LIỆU THAM KHẢO - TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] PGS TS Trịnh Bình (2003) Mô học, NXB Y học Hà Nội [2] Phạm Phan Dịch, Trịnh Bình, Đỗ Kính (1998) Mô học, NXB Y học Hà Nội [3] Phan Thanh Hà (2002) Bước đầu nuôi cấy thử nghiệm độc tính tế bào biểu bì chuột nhắt trắng (mus musculus var Albino), Đại học Khoa học tự nhiên TP.HCM [4] PGS TS Nguyễn Như Hiền (2007), Công nghệ sinh học, tập 1: Sinh học phân tử tế bào, Cơ sở khoa học công nghệ sinh học, NXB Giáo dục [5] Trần Vân Hiền, Chu Quốc Trường (2005) Áp dụng kỹ thuật MTT để đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào lách chuột chịu stress oxy hố của dịch chiết Hà thủ ơ, Cúc hoa vàng, Tạp chí Bệnh Viện YHCT TW; Học Viện Quân Y – Viện dược liệu, Tập [6] Trần Thị Ngọc Lợi (2007), Khảo sát quy trình tạo dòng nguyên bào sợi người từ da bao quy đầu, Đại học Khoa học tự nhiên TP.HCM [7] Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2006), Công nghệ tế bào, NXB Đại học Quốc Gia TP.HCM [8] Phan Kim Ngọc (2002), Giáo trình thực tập sở Cơng nghệ sinh học Động vật, NXB Đại học Quốc Gia TP.HCM [10] Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc (2006), Công nghệ sinh học người động vật, NXH Đại học Quốc Gia TP.HCM [11] Nguyễn Ngọc Thanh Thảo (2007), Cải thiện quy trình thu hoạch bảo quản tế bào xơ phôi gà, Đại học Nông Lâm TP.HCM [12] Phạm Lê Bửu Trúc (2009), Khảo sát khả biệt hóa tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người thành tế bào tiết insulin hóa chất dịch tiết tụy chuột, Đại học Khoa học tự nhiên TP.HCM [13] Lê Thế Trung (2003) Bỏng – kiến thức chuyên ngành, NXB Y học, chi nhánh TP.HCM [14] Lê Thị Mộng Tuyền (2006), Thiết kế nguyên liệu phủ vết thương từ nguyên bào sợi màng ối người, Đại học Khoa học tự nhiên, TP.HCM [15] Tiền Văn Sến (2004), Thử nghiệm phân lập tạo dòng nguyên bào sợi từ mô phôi thai người, Đại học Khoa học tự nhiên TP.HCM [16] GS TS Vũ Văn Vụ, PGS TS Nguyễn Mộng Hùng (2006), Công nghệ sinh học, tập 2: CNSH tế bào, NXB Giáo dục TÀI LIỆU TIẾNG ANH - [17] Subrata Kumar Biswas et al (2011) Literature review on pharmacological potentials of Kalanchoe pinnata (Crassulaceae), African Journal of Pharmacy and Pharmacology Vol 5(10), pp 1258-1262 [18]Cheryl D., Helgason Cindy L., Miller (2005), Basic cell culture protocols, Jonh Wiley and Sons Inc [19] Br J Dermatol , Hume WJ (1985) Keratinocyte proliferative hierarchies confer protective mechanisms in surface epithelia, vol 112 : 493 – 502 [20] R Ian Fresney (1994) Culture of animal cells, a manual of basic techniques, Wiley-Liss Inc, page: – 16, 71 – 101, 133 – 147, 170, 328 [21] Frizell LV, Ludmila IB, Isolation, purification and cultivation of - murine and human keratinocytes, Methods in molecular biology, vol 290 : basic cell culture protocols, third edition, 187-194 [22] John D Griffin, Ph.D (2006), Fluorescense Digital Image Gallery – Cell in culture, National High Magnetic Field Laboratory, The Florida State University [23] B Joseph, S Sridhar, et al (2011) Rare Medicinal Plant-Kalanchoe Pinnata Research Journal of Microbiology, 6: 322-327 [24] Elaine N Marieb (2000), Human Anatomy and Physiology, page: 135 – 196 [25]Quazi Majaz A., PhD (2011) The Miracle plant (Kalanchoe Pinnata): A phytochemical and pharmacological review, IJRAP Journal (5), page: 1478 – 1482 [26] Shashank Matthew, K.K Khosla et al (2013) Preliminary Phytochemical Studies of Kalanchoe Pinnata (Lam.) Pers, Journal of medicinal Plants Studies, 2, vol 1, 19 – 23 [27] B Shivananda Nayak, et al (2010) Wound healing potential of ethanolic extract of Kalanchoe pinnata Lam Leaf, Indian Journal of Experimental Biology vol.48, 572 – 576 [28] Shazid M Sharker, Mohammad K Hossain et al (2012) Chemaical and biological studies of Kalanchoe pinnata (Lam.) growing in Bangladesh, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, S1317 – S1322 [29] Soosan G, Lorne BT ( 2005), Organization of stem cell and their progeny in human epidermis, Journal of Invest Dermatol, vol 124 : 367-372 [30] Susan SY ( 2003) Current Protocols in cell biology, Jonh Wiley and Sons Inc., 155-160 - - - PHỤ LỤC - Bảng 2.1.3a : công thức pha dung dich PBS - Thành phần - NaCl - - 5g KH2PO4 - 0,125g Na2HP04.12H2O - 1,803g KCL - 0,125g Nước cất lần vừa đủ - 500ml - - Hàm lượng - pH 7,4 Hấp khử trùng autoclave ( 1210c, 1atm, 15p phút), bảo quản nhiệt độ -40c Bảng 2.1.3b : công thức pha dung dịch trypsine 0,25% - Thành phần - Hàm lượng - Trypsine ( china) - - PBS - 0,25 100ml - Bảng 2.1.3c : công thức pha EDTA 1% - Thành phần Hàm lượng EDTA ( china) - - 0.05g PBS - 50ml - - Lọc qua màng lọc vơ trùng đường kính lỗ lọc 0,2µm Bảo quản lạnh - Thành phần Bảng 2.1.3d : công thức pha kháng sinh - Hàm lượng Penicillin ( 4000IU/ml) - Streptomycine ( 400µg/ml) - - - Lọc qua màng lọc vơ trùng 0,2µm Bảng 2.1.3e : cơng thức pha Trypan blue - PBS - 0,4g 100ml - Lọc lại giấy lọc Bảng 2.1.3f: công thức pha DMEM 5% huyết - Thành phần - DMEM bột - - Hàm lượng - 15,6g - NaHCO3 - Phenol red 1000ml - pH 1,2g 0,01g - Nước cất lần - - Hàm lượng - Trypan blue bột - 191,2ml - Thành phần - 4ml - PBS - 0.8ml - Gentamycine ( 400µg/ml) - 4ml - - 7,4 Lọc qua màng lọc vơ trùng đường kính lỗ lọc 0,2µm; bảo quản lạnh - - Nong Count Average Standard Source Coeff of of Minimum MeanNong F-Ratio MeanP-Value Maximum Range Stnd skewness Sum Df Count Homogeneous deviation variation Squares Square Groups 0.2 25.0 4.58258 Between 18.3303% 30.0 9.0 1148.25 21.0 382.75 0.2 4.64 0.6613 0.0367 25.0 X Bảng 3.2.1.1: Tổng mậtđộ tế bào đơn với trypsinấm cácnồng độ 21.0 .0.25 3.2.1.1: Tổng mật 10.8167 bàođơn ủủvới trypsin 33.0 ởởcác 54.0 độ khác Bảng độ tế groups 24.037% ấm nồng khác -0.814636X 45.0 0.35 27.0 0.3 46.0 10.5357 Within groups 660.0 22.9036% 36.0 57.0 21.0 0.299299 X 82.5 0.25 45.0 0.35 27.0 9.0 33.3333% 36.0 18.0 0.0 X Total (Corr.) 1808.25 18.0 11 0.3 46.0 Total 12 35.75 12.8213 35.8638% 18.0 57.0 39.0 0.512347 - - Nong Count Average Standard Coeff of Minimum Maximum Range Stnd skewness deviation variation 0.2 18.3303% 21.0 Nong Count 25.0 Average 4.58258 Standard Coeff of Minimum 30.0 Maximum 9.0 Range 0.6613 Stnd skewness 0.25 45.0 10.8167 24.037% 33.0 54.0 21.0 -0.814636 deviation variation 0.3 46.0 10.5357 22.9036% 36.0 57.0 21.0 0.299299 0.2 25.0 4.58258 18.3303% 21.0 30.0 9.0 0.6613 0.35 27.0 9.0 33.3333% 18.0 36.0 18.0 0.0 0.25 45.0 10.8167 24.037% 33.0 54.0 21.0 -0.814636 Total 12 35.75 12.8213 35.8638% 18.0 57.0 39.0 0.512347 0.3 46.0 10.5357 22.9036% 36.0 21.0 0.299299 0.35 27.0 9.0 33.3333% 18.0 36.0 18.0 0.0 Total 12 35.75 12.8213 35.8638% 18.0 57.0 39.0 0.512347 Bảng 3.2.1.2: Mật độ tế bào đơnSource ủ với trypsin ấm cácMean độ khác sống nồng Sum of Df F-Ratio P-Value Squares Square Between 1148.25 4.64 0.0367 Source Sum of Df 382.75 Mean F-Ratio P-Value groups Squares Square Within groups 660.0 82.5 Between 1148.25 382.75 4.64 0.0367 Total (Corr.) 1808.25 11 groups Count Mean Homogeneous Bảng 3.2a: Tổng mật độ tế bào Within groups 660.0 ấm Nong doNong Count Mean Homogeneous đơn ủ với trypsin 82.5 song Groups Groups Total (Corr.) 1808.25 11 nồng độ khác 0.35 0.2 8.33333 X X Nong Count 25.0 Homogeneous Mean 0.2 X 0.35 3 23.027.0 X Groups 0.3 3 34.6667 XX 0.25 45.0 XX 0.2 25.0 0.25 X 0.3 3 38.046.0 XX 0.35 27.0 X 0.25 45.0 X 0.3 46.0 - - Nong song 0.2 Nong 0.25 0.3 0.2 0.35 0.25 Total 0.3 0.35 Total Count Average Standard Coeff of Minimum Maximum Range Stnd skewness deviation variation 23.0 4.0 17.3913% 19.0 27.0 8.0 Count Average Standard Coeff of Minimum Maximum Range Stnd.0.0 skewness 38.0 deviation 8.88819 23.39% 28.0 45.0 17.0 -0.951648 variation 28.8942% 3 25.0 34.6667 10.0167 4.58258 18.3303% 21.0 27.0 30.0 46.0 9.0 19.0 1.00871 0.6613 36.6606% -0.6613 3 45.0 8.33333 3.05505 10.8167 24.037% 33.0 5.0 54.0 11.0 21.0 6.0-0.814636 13.5848 52.249% 12 46.0 26.0 10.5357 22.9036% 36.0 5.0 57.0 46.0 21.0 41.0 0.0276924 0.299299 27.0 9.0 33.3333% 18.0 36.0 18.0 0.0 12 35.75 12.8213 35.8638% 18.0 57.0 39.0 0.512347 Bảng 3.2.2.1: Tổng mật độ tế bào đơn ủ với trypsin lạnhDf nồng độ khác P-Value Mean Source Sum of F-Ratio Squares Square Between 1620.67 10.56 0.0037 Source Sum of Df 540.222 Mean F-Ratio P-Value groups Squares Square Within groups 409.333 51.1667 Between 1148.25 382.75 4.64 0.0367 Total (Corr.) 2030.0 11 groups Bảng 3.2a: Tổng mật độ tế bào Within groups 660.0 ấm C.Nong Count Mean Homogeneous đơn ủ với trypsin 82.5 Groups Total (Corr.) 1808.25 11 nồng độ khác 0.2 Count Mean Homogeneous 35.3333 X Nong X Groups 0.25 76.0 0.3 94.0 25.0 XX 0.2 0.35 0.35 96.6667 27.0 XX 0.25 0.3 3 45.0 46.0 X X - C.Nong Count Average Standard Coeff of Minimum Maximum Range Stnd skewness deviation variation 0.2 nong Count35.3333Standard 17.2927% 30.0 12.0 0.6613 Lanh Nong Count Average 6.1101 Average Standard Coeff of of Coeff Minimum Maximum Range Stnd skewness Minimum42.0 Maximum Range Stnd skewness 0.25 76.0 deviation 9.16515 12.0594% 68.0 86.0 18.0 0.6613 deviation variation variation 0.3 94.0 4.58258 7.2111 7.67139% 88.0 102.0 14.0 0.814636 0.2 3 25.027.3333 2.3094 18.3303% 8.44903% 21.026.0 30.030.0 9.0 4.0 0.6613 1.22474 0.35 96.666710.8167 8.0829 8.36162% 88.0 104.0 16.0 -0.814636 0.25 3 45.061.3333 6.1101 24.037% 9.96212% 33.056.0 54.068.0 21.012.0 -0.510608 0.6613 Total 75.5 10.5357 26.4386 35.018% 30.0 104.0 74.0 0.299299 0.3 123 46.063.3333 13.3167 22.9036% 21.0263% 36.052.0 57.078.0 21.026.0 -1.17696 0.746586 0.35 3 27.050.6667 10.0664 9.0 33.3333% 19.868% 18.040.0 36.060.0 18.020.0 -0.41407 0.0 Bảng 3.2.2.2: Mật độ tế 12.8213 sống ủ 33.126% bào đơn với trypsin lạnh26.0 57.078.0 khác nhau.-0.386119 Total 12 12 35.75 50.6667 16.7838 35.8638% 18.0 nồng độ 39.052.0 0.512347 Source Sum of Df Mean F-Ratio P-Value Squares Square Between 7211.67 40.29 0.0000 Source Sum of Df 2403.89 Mean F-Ratio P-Value P-Value groups Squares Square Within groups 477.333 59.6667 Between 2456.0 1148.25 818.667 382.75 10.19 4.64 0.0367 0.0042 Total (Corr.) 7689.0 11 groups Bảng 3.2a: Tổng mật độ tế bào Within groups 660.0 ấm Lanh nong Count Mean Homogeneous đơn ủ với 642.667 trypsin 80.3333 82.5 Groups Total (Corr.) 3098.67 1808.25 11 nồng độ khác 0.2 Count MeanX Homogeneous 27.3333 Nong 0.35 50.6667 X Groups 0.25 3 61.3333 X 0.2 25.0 X 0.3 0.35 3 63.3333 X 27.0 X 0.25 0.3 3 45.0 46.0 X X