3 2. Giới thiệu một số phƣơng pháp nghiên cứu khả năng chống oxi hóa 2.1 Khái niệm về gốc tự do Oxy đƣợc xem nhƣ một nguyên tố quan trọng giúp con ngƣời duy trì sự sống, chúng tham gia vào quá trình hô hấp ở tế bào, sản sinh năng lƣợng cung cấp cho mọi hoạt động sống của con ngƣời. Khoảng vài thập niên gần đây, các nghiên cứu khoa học đã chứng tỏ rằng oxy vào cơ thể tham gia nhiều quá trình sinh hóa và trong các quá trình đó oxy tạo ra những tiểu phân trung gian gọi là các gốc tự do. Các gốc tự do có nguồn gốc oxy này có hoạt tính cao, kém bền vững và đƣợc gọi chung là các gốc dạng oxy hoạt động (ROS: Reactive oxygen species) 1,2 . Ban đầu oxygen nhận một điện tử tạo ra gốc superoxyde (O 2 •– ), đây là gốc tự do quan trọng nhất của tế bào. Từ superoxyde (O 2 •– ) nhiều gốc tự do và các phân tử khác của oxy có khả năng phản ứng cao đƣợc tạo ra nhƣ hydroxyl (HO ● ), hydroperoxyl (HOO ● ), peroxyl (ROO ● ), alkoxyl (RO ● ), lipoperoxyde (LOO • ), H 2 O 2 2,10,18 . Các dạng oxy hoạt động này do có năng lƣợng cao, kém bền nên dễ dàng phản ứng với những đại phân tử nhƣ protein, lipid, DNA, … gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể. Đồng thời, khi một phân tử sống bị các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới, tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thƣờng gọi là phản ứng dây chuyền, gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể 2,10 . Gốc tự do đƣợc tạo ra bằng nhiều cách. Nó có thể là sản phẩm của những căng thẳng tâm thần, bệnh hoạn thể xác, mệt mỏi, ô nhiễm môi trƣờng, thuốc lá, dƣợc phẩm, tia phóng xạ mặt trời, thực phẩm có chất màu tổng hợp, nƣớc có nhiều chlorine và ngay cả oxy 9,10 . 2.2 Lợi ích của gốc tự do đối với cơ thể Không phải là gốc tự do nào cũng có hại đối với cơ thể. Nếu đƣợc kiểm soát, nó là nguồn cung cấp năng lƣợng cho cơ thể, tạo ra chất màu melamine cần cho thị giác, góp phần sản xuất prostaglandins có công dụng ngăn ngừa nhiễm 4 trùng, tăng cƣờng miễn dịch, làm dễ dàng cho sự truyền đạt tín hiệu thần kinh, co bóp cơ thịt 2 . 2.3 Tác hại của gốc tự do đối với cơ thể Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con ngƣời mới sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi ngày. Nếu không đƣợc kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa nhƣ: ung thƣ, xơ vữa động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận ở ngƣời cao niên, phá rách màng tế bào khiến chất dinh dƣỡng thất thoát, tế bào không tăng trƣởng, tu bổ, rồi chết. Chúng tạo ra chất lipofuscin tích tụ dƣới da khiến ta có những vết đồi mồi trên mặt, trên mu bàn tay. Ngoài ra, chúng còn tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp các phân tử protein, đƣờng bột, lipid, enzyme trong tế bào, gây đột biến ở gene, ở DNA, RNA, làm chất collagen, và elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc 2,38 . Theo các nhà nghiên cứu, gốc tự do hủy hoại tế bào theo chu trình sau đây: Trƣớc hết, gốc tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải chất bã và tiếp nhận thực phẩm, dƣỡng khí rồi gốc tự do tấn công các ty lập thể, phá vỡ nguồn cung cấp năng lƣợng. Sau cùng, bằng cách oxy hóa gốc tự do làm suy yếu kích thích tố, enzyme khiến cơ thể không tăng trƣởng đƣợc 2,38 . Trong tiến trình hóa già, gốc tự do cũng góp phần và có thể là nguy cơ gây tử vong. Hóa già đƣợc coi nhƣ một tích tụ những đổi thay trong mô và tế bào. Theo bác sĩ Denham Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây ra sự hóa già và sự chết của các sinh vật. Ông cho là gốc tự do phản ứng lên ty lạp thể, gây tổn thƣơng các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc, khiến chúng trở nên vô dụng và mất khả năng sản xuất năng lƣợng 1,2 . Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh, đáng kể nhất gồm có: bệnh xơ vữa động mạch, ung thƣ, Alzheimer, Parkinson, đục thủy tinh thể, bệnh tiểu đƣờng, cao huyết áp không nguyên nhân, xơ gan 2 . 5 Các nghiên cứu cũng phát hiện rằng các gốc dạng oxy hóa hoạt động (ROS) sẽ đƣợc loại bỏ bằng các chất chống oxy hóa tự nhiên có sẵn trong cơ thể nhƣ enzyme superoxid dismutase (SOD), enzyme glutathion peroxidase (GSP-Px), enzyme catalase (CAT)… để tạo sự cân bằng giữa các dạng oxy hoạt động và các dạng chống oxy hóa trong cơ thể con ngƣời. Đó là một trạng thái cơ bản của cân bằng nội mô (homeostasis). Do ảnh hƣởng của nhiều yếu tố tác động từ bên ngoài hay bên trong cơ thể, làm cân bằng này di chuyển theo hƣớng gia tăng các dạng oxy hoạt động. Trạng thái sinh lý này gọi là stress oxy hóa (oxidative stress). Hay nói cách khác, stress oxy hóa là sự rối loạn cân bằng giữa các chất chống oxy hóa và các chất oxy hóa theo hƣớng tạo ra nhiều các chất oxy hóa 5,38 . Ngày nay, do ảnh hƣởng của điều kiện sống nhƣ: ô nhiễm môi trƣờng, tiếng ồn, căng thẳng, lo lắng hay sử dụng các thực phẩm chứa nhiều chất oxy hóa đã tạo điều kiện làm gia tăng gốc tự do, kéo theo sau đó là sự gia tăng các dạng oxy hoạt động. Các dạng oxy hoạt động gia tăng, gây ra nhiều phản ứng bất lợi, tổn thƣơng cho cơ thể và là nguyên nhân của nhiều căn bệnh nan y. Do đó cần có những nghiên cứu, tìm hiểu về các chất có khả năng chống oxy hóa mang lại những tác dụng tốt, có lợi cho sức khỏe của con ngƣời. Bên cạnh đó, chúng ta cũng cần khảo sát thêm những quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa tối ƣu và dễ thực hiện để phục vụ cho việc nghiên cứu. Dƣới đây chúng tôi xin giới thiệu một số phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa đơn giản, ổn định và đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong thực tế. 6 2.4 Các phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa 2.4.1 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH Năm 1922 Goldschmidt và Renn đã phát hiện ra một gốc tự do bền có màu tím đậm, hầu nhƣ không phân hủy, không nhị trùng hóa và cũng không phản ứng với oxy đó chính là gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl). DPPH • là một gốc tự do có màu tím giống nhƣ màu của dung dịch KMnO 4 , không tan trong nƣớc, tan trong dung môi hữu cơ. Dung dịch DPPH có cực đại hấp thu tại bƣớc sóng 517nm, và sản phẩm khử của nó là 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine (DPPH-H) thì có màu vàng cam 3,5,8,19,23,36,51 . Ngày nay DPPH đƣợc sử dụng để khảo sát khả năng ức chế gốc tự do. Phƣơng pháp này rất hữu hiệu đƣợc dùng phổ biến vì đơn giản, nhanh chóng và dễ ổn định. Nguyên tắc Các chất có khả năng kháng oxi hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bƣớc sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt. Phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất kháng oxy hóa đƣợc minh họa bằng phản ứng đƣợc mô tả bên dƣới: 7 Hình 1. Phản ứng trung hòa gốc DPPH 2.4.2 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do NO Trong hệ thống thần kinh trung ƣơng và ngoại biên, vai trò của NO rất quan trọng: Đóng vai trò dẫn truyền thần kinh, mang tín hiệu đến bất cứ nơi nào trong cơ thể, điều khiển cân bằng nội mô mạch não, điều hòa cảm nhận đau, điều khiển quá trình tƣ duy và trí nhớ 2,33,39 . NO đƣợc sinh ra từ NOS tổ chức (nNOS và eNOS) sẽ ảnh hƣởng lên trƣơng lực cơ bản của mạch não và góp phần điều hòa vận mạch khi bị kích thích. Vì vậy, sự rối loạn NO sẽ dẫn đến một số bệnh về não nhƣ bệnh: Alzeimer, thiếu máu não, đột quỵ 22 . NO có một vai trò vô cùng quan trọng đối với cơ thể là tác nhân góp phần điều hòa huyết áp, ngoài ra NO còn là yếu tố gây giãn mạch nội sinh. Nếu quá nhiều NO đƣợc sinh ra thì sự dãn mạch máu sẽ dẫn đến sự giảm huyết áp, và ngƣợc lại, nếu lƣợng NO sinh ra ít sẽ dẫn đến hiện tƣợng tăng huyết áp 18 . Sự rối loạn con đƣờng chuyển hóa L-arginin – NO làm thay đổi nồng độ NO tạo ra. Những sự rối loạn này thƣờng dẫn đến một số bệnh nhƣ: chứng tăng huyết áp, tiểu đƣờng, béo phì, suy tim, xơ vữa động mạch, lão hóa, tổn thƣơng mạch máu. Ngoài ra, khi lƣợng NO sản xuất quá nhiều thì chính nó sẽ trở thành N N NO 2 O 2 N NO 2 + N NH NO 2 O 2 N NO 2 + AAH DPPH Chất kháng oxy hóa hhoa DPPHH 8 chất nội độc tố và khi đó NO còn phản ứng với các ROS gây hại cho cơ thể, ví dụ gốc tự do ONOO - , là gốc nitrite gây hại cho cơ thể 2,7,9,18 . NO • + • O 2- ↔ ONOO - 4NO • + O 2 + H 2 O ↔ NO 2 - + H + Nguyên tắc NO phản ứng với oxi tạo ra sản phẩm bền vững là nitrite và nitrate, hoạt chất ức chế NO sẽ phản ứng cạnh tranh với oxy, kết quả là làm giảm sản phẩm nitrit tạo thành trong dung dịch nƣớc và nồng độ nitrite trong dung dịch nƣớc đƣợc xác định bằng phƣơng pháp trắc quang sử dụng thuốc thử Greiss. Trong đó, nitrite phản ứng với thuốc thử Greiss tạo thành hợp chất màu diazo bền vững và có bƣớc sóng hấp thu cực đại ở 540 nm. Dựa trên sự giảm nồng độ nitrite tạo thành, ta tính đƣợc khả năng ngăn chặn gốc tự do NO của hoạt chất (tính trên % ức chế) 5,8,33,39 . Hình 2. Cơ chế phản ứng lên màu nitrite bằng thuốc thử Greiss Thuốc thử Greiss là hỗn hợp của hai dung dịch: N-1-napthylethylene diamine dihydrochloride (NED) và sulfanilamide trong môi trƣờng H 3 PO 4 . Cơ chế của phản ứng tạo sản phẩm màu diazo hóa nhƣ trên. N H 2 H 2 N O 2 S N 2 + H 2 N O 2 S N O 2 - H 2 O NED N H C H 2 C H 2 N H 2  =540 nm H 2 N O 2 S N N H C H 2 C H 2 N H 2 N 9 2.4.3 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng MDA MDA (Malonyl dialdehyde) là sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào nên đƣợc áp dụng rộng rãi trong thực tế để nghiên cứu quá trình peroxy hóa lipid của màng tế bào. Nguyên tắc MDA đƣợc sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, khi cho phản ứng với acid thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử acid thiobarbituric tạo phức màu hồng hấp thu cực đại ở bƣớc sóng 532 nm, phản ứng đƣợc thực hiện ở môi trƣờng pH bằng 2-3, nhiệt độ là 90-100 o C trong thời gian từ 10 đến 15 phút. Dựa trên sự giảm cƣờng độ hấp thu của phức ta tính đƣợc khả năng kháng oxy hóa của chất cần nghiên cứu 3,5 . Phản ứng tạo phức giữa MDA và acid thiobarbituric đƣợc biểu diễn nhƣ sau: Hình 3. Cơ chế phản ứng lên màu của MDA và Acid thiobarbituric Malonyl dialdehyd Acid thiobarbituric Phức Trimethin HN N O S H O HN N O S O H N O SNO H CH 2 CHO HOC 2 + -2 H 2 t o 10 2.4.4 Phƣơng pháp đánh giá khả năng kết hợp với ion sắt II (Iron chelating activity) Nguyên tắc: Ion sắt hay đồng ở trạng thái tự do dễ dàng xúc tác sinh ra gốc tự do. Khi cho ion Fe 2+ tác dụng với thuốc thử Ferrozin sẽ sinh ra phức màu có cực đại hấp thu tại bƣớc sóng  = 562nm 5,7,28 . Mẫu thử sẽ khóa các kim loại vào dạng phức, không cho kim loại tồn tại ở dạng tự do nên làm mất khả năng xúc tác của kim loại. Hoạt tính chống oxy hóa của mẫu thử sẽ đƣợc thể hiện qua việc ngăn chặn tạo thành phức chất có màu giữa ion Fe 2+ với thuốc thử Ferrozin. 2.4.5 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế enzyme Xanthine oxidase (XO) 2.4.5.1 Giới thiệu Xanthine oxidase (XO) là một loại enzyme giữ vai trò quan trọng trong quá trình thoái hóa của purine, nó đóng vai trò là chất xúc tác cho phản ứng oxy hóa hypoxanthine thành xanthine và sau đó tiếp tục xúc tác cho phản ứng oxy hóa xanthine thành acid uric 5,7,38,51 . 2.4.5.2 Cấu tạo Enzyme XO là một protein dimer đồng nhất (homodimeric protein) có phân tử lƣợng là 300000 Da, trong đó mỗi monomer của protein tổ chức gồm 3 phần (domain) chính: một phần chứa 2 tâm Fe 2 S 2 , một phần chứa tâm molybdenum (Mo) liên kết với pterin gọi là molybdopterin, một phần là flavin adenine dinucleotide (FAD). Trong đó phần chứa Mo là phần lớn nhất và là trung tâm hoạt tính xúc tác của enzyme, tâm Fe 2 S 2 và FAD đóng vai trò là những chất vận chuyển điện tử trong quá trình oxy hóa đƣợc xúc tác bởi enzyme 21 . 2.4.5.3 Cơ chế hoạt động của enzyme XO Enzyme XO là một trong ba loại enzyme chứa tâm hoạt tính xúc tác là molybdenum (XO, DMSO reductase, sulfite oxidase). Enzyme XO xúc tác cho sự hydroxyl hóa các chất nền khác nhau theo phản ứng tổng quát: 11 RH + H 2 O ROH + 2H + + 2e ─ Phản ứng xảy ra tại tâm Mo, Mo bị khử từ Mo (VI) xuống Mo (IV), và trong quá trình phản ứng, các electron tạo thành đƣợc chuyển tới các tâm nhận electron trong enzyme 21 . Với chất nền là xanthine, cơ chế phản ứng hydroxygen hóa dƣới sự hiện diện của XO đƣợc các nhà khoa học đề nghị nhƣ sau 21 : Hình 4. Cơ chế xúc tác của XO cho phản ứng biến đổi xanthine thành acid uric. 2.4.5.4 Nguyên tắc quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme XO Xanthine oxidase là một enzyme thân oxy hóa, xúc tác cho phản ứng oxy hóa xanthine tạo thành acid uric, đồng thời hình thành gốc tự do O 2 ● . Acid uric có bƣớc sóng cực đại hấp thu tại 290 nm. Nếu mẫu thử có khả năng kháng O S N N N N O O H H H H O O glu 126 MoS S O O SH N N N N O O H H H H , e MoS S O O S N N N N O O H H H HO , H e Mo OH S O S S + HN NH NH N O O OH HN NH NH NH O O O Xanthine Acid uric VI IV V VI MoS S O H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 12 enzyme XO càng cao sẽ càng hạn chế sự hình thành acid uric, do đó sẽ làm giảm giá trị mật độ quang. Hình 5. Phản ứng tạo acid uric Các phƣơng pháp thử hoạt tính chống oxy hóa trên ngày càng đƣợc sử dụng nhiều nhằm tìm ra những hợp chất có khả năng ức chế gốc tự do cũng nhƣ kháng các quá trình sinh ra nó, những hợp chất này đƣợc gọi là các chất kháng oxy hóa. Chúng có thể đƣợc sinh ra từ cơ thể nhƣ hệ thống kháng oxy hóa có bản chất enzyme bao gồm enzyme SOD, CAT, GSH peroxidase đóng vai trò thiết yếu nhằm chống lại các gốc tự do độc hại sản sinh liên tục trong cơ thể, và những chất kháng oxy hóa có phân tử lƣợng thấp nhƣ glutathinon, vitamin E, vitamin C hoặc cũng có thể là những hợp chất có trong thực phẩm, rau quả nhƣ các hợp chất thuộc họ phenolic: flavonoid, stilbene, lignan, tannin 3,9 . 3. Giới thiệu phƣơng pháp nghiên cứu độc tính tế bào 3.1 Nuôi cấy tế bào Dòng tế bào ung thƣ ruột kết ngƣời DLD-1 đƣợc thu từ bộ sƣu tập tế bào American Type và đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng McCoy’5A có bổ sung các thành phần dinh dƣỡng FBS 10%, gentamicin 0.1%, và ủ trong môi trƣờng CO 2 5% tại 37 o C. Tế bào phục vụ cho thí nghiệm đƣợc rửa bằng PBS và tách khỏi chai nuôi cấy tế bào bằng dung dịch trypsin 2% . Xanthine Acid uric HN O NH O NH N + H 2 O + O 2 2 XO HN O NH NH NH O O + O 2 + H 2 2