BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HẢ NỘI BÙI LAN PHƯƠNG NGHIÊN cứ u THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CÁC BỘ PHẬN • • • TRÊN MẶT ĐẤT CỦA CÂY Ô ĐẦU SA PA (Aconitum carmỉchaelii Debx.) (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 2 0 0 2 -^ 7 ) Ngưòi hướng dẫn khoa học ^ f Q Ị ịW J 1. TS Phạm Văn Thanh 2. ThS Bùi Hồng Cường Nơi thực hiện : 1. Viện dược liệu 2. Công ty TRAPHACO Thời gian thực hiện : Tháng 3-5/2007 Hà N ộ i-2007 \ ' ¥ M ồ i e ả n t đ i L Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khoá luận, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy, cô giáo, bạn bè và gia đình. Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: - TS Phạm Văn Thanh, trưởng khoa Hoá thực vật, Viện Dược liệu. - Ths Bùi Hồng Cường, công ty Traphaco. Là những người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đê tài này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phùng Hoà Bình, giảng viên Bộ môn Dược học cổ truyền đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xỉn gửi lời cảm ơn chân thành tới: - Ban lãnh đạo Viện Dược liệu và các cô, chú, anh, chị công tác tại khoa Hoá thực vật, Viện Dược liệu. - Các thầy cô giáo trong Bộ môn Dược học cổ truyền, trường Đại học Dược Hà Nội. - Các cô, chú, anh, chị trong phòng Kiểm tra chất lượng, công tỵ Traphaco. Là những người đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành ten cha mẹ, bạn bè, người thân đã luôn ủng hộ, động viên để tôi có được ngày hôm nay. Một lần nữa, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người! Hà Nội tháng 5 năm 2007 Sinh viên Bùi Lan Phương MỤC LỤC 1.4. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền 1.4.1. Phụ tử sống 1.4.2. Phụ tử chế 1.4.3. Phần trên mặt đất Phần 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1. Nguyên liệu, phương tiện và phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Nguyên liệu 2.1.2. Phương tiện nghiên cứu Trang 1 NHỮNG CHỬ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỂ Phần 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Đặc điểm thực vật của chi Aconitum L. 2 1.1.1. Vị trí phân loại 2 1.1.2. Phân loại chi Aconitum L. 2 1.1.3. Phân bố ^ 1.1.4. Nguồn gốc cây Ô đầu trồng ở Sa Pa (Lào Cai) hiện nay ^ 1.1.5. Bộ phận dùng ^ 1.2. Thành phần hoá học ^ 1.2.1. Thành phần hoá học của rễ củ (Ô đầu, Phụ tử) ^ 1.2.2. Thành phần hoá học của phần trên mặt đất của cây Ô đầu ^ 1.2.3. Phương pháp kiểm định Alcaloid 1.3. Tác dụng sinh học 1.3.1. Tác dụng sinh học của Phụ tử 1.3.2. Tác dụng sinh học của phần trên mặt đất của cây Ô đầu ^ 9 9 10 10 11 11 11 11 2.1.3. Phương pháp nghiên cứu 13 2.2. Thực nghiệm và kết quả 13 2.2.1. Định tính các nhóm chất hữu cơ 13 2.2.2. Nghiên cứu Alcaloid 21 2.3. Bàn luận 32 2.3.1. Định tính 32 2.3.2. Định lượng 33 KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT Aco Alc Alctp Cs Dieste alc HPLC MeOH MT Nxb PTS SKLM TB uv Aconitin Alcaloid Alcaloid toàn phần Cộng sự Diester alcaloid High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) Methanol Mẫu thử Nhà xuất bản Phụ tử sống Sắc ký lớp mỏng Trung bình Ultraviolet (tử ngoại) ĐẬT VẤN ĐỂ Cây Ô đầu là một cây thuốc quý, các bộ phận dưới mặt đất của nó như củ cái (Ô đầu) và củ nhánh (Phụ tử) là những vị thuốc quý, có tác dụng cải tử hoàn sinh đã được sử dụng khá phổ biến trong y - dược học cổ truyền phưoỉng Đông [1], [3], [6], [12], [13], [14], [29]. Gần đây đã có một số tài liệu nước ngoài công bố nghiên cứu về các bộ phận trên mặt đất của một số loài thuộc chi Aconitum L. cho thấy chúng cũng có chứa một số thành phần hoá học giống với Phụ tử như các alcaloid, flavonoid. Nhưng những công trình nghiên cứu về vấn đề này còn rất ít [17], [18], [19], [21], [22], Cây Ô đầu đã được trồng ở Việt Nam từ những năm 70 của thế kỷ trước. Sau chiến tranh biên giới (1979), cây Ô đầu bị triệt phá và mất giống hoàn toàn. Từ năm 1990, chúng đã được nhân dân Sa Pa phục hồi lại.Trong điều kiện sinh thái của vùng Sa Pa thì thành phần hoá học của cây Ô đầu có thể sẽ khác đi. Gần đây, một số nhà khoa học của Việt Nam đã nghiên cứu về một loài Ô đầu ở Sa Pa có tên khoa học là Aconitum carmichaelii Debx. Họ Ranunculaceae [8]. Tuy nhiên các công trình nghiên cứu này chủ yếu là phần rễ củ, chưa có nghiên cứu nào về các bộ phận trên mặt đất của cây Ô đầu Sa Pa này. Với mục tiêu nghiên cứu về các thành phần hóa học có trong một số bộ phận trên mặt đất (gồm thân, lá, hoa, hạt) của cây Ô đầu Sa Pa chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thành phần hoá học các bộ phận trên mặt đất của cây Ô đầu Sa Pa ( Aconitum carmichaelii Debx.) ” vói các nội dung sau: Định tính các nhóm chất hữu cơ trong các bộ phận trên mặt đất của cây Ô đầu Sa Pa. Định lượng alcaloid toàn phần, diester alcaloid, aconitin trong các bộ phận đó. Phần 1: TỔNG QUAN 1.1. Đặc điểm thực vật của chi Aconitum L. 1.1.1. Vị trí phân loại [5] Chi Ô đầu {Aconitum L.) thuộc họ Hoàng Liên (Ranunculaceae), bộ Hoàng Liên (Ranunculales), phân lớp Hoàng Liên (Ranunculidae), lófp Mộc Lan (Magnoliopsida), ngành Mộc Lan (Magnoliophyta). 1.1.2. Phân loại chi Aconitum L.[16], [25]: Được sắp xếp thành 3 phân chi: - Phân chi Aconitum: cỏ, sống hai năm, giả một năm, có rễ củ. - Phân chi Lycoctonum: cỏ, sống lâu năm, có thân rễ. - Phân chi Gymnaconitum: cỏ, sống một năm. 1.1.3. Phân bố: Chi Aconitum L. có khoảng 400 loài phân bố chủ yếu ở các vùng ôn đói ấm Bắc Bán cầu, có nhiều nhất ở Trung Quốc (trên 200 loài) [25]. ở Việt Nam , cây Ô đầu có ở Sa Pa (Lào Cai) và một số noi ở tỉnh Hà Giang, Lai Châu [1], [14]. 1.1.4. Nguồn gốc cây Ô đầu trồng ở Sa Pa ( Lào Cai) hiện nay: Tên khoa học của cây Ô đầu ở Sa Pa hiện nay đã được xác định là Aconitum carmỉchaelii Debx. Họ Ranunculaceae [8]. Cây Ô đầu trồng ở Việt Nam hiện nay có xuất xứ nhập nội từ hai nguồn: Nguồn thứ nhất do ngành y tế chính thức nhập giống từ Trung Quốc, được trồng đầu tiên ở Sa Pa từ những năm 70 của thế kỷ trước, còn được trồng ở Bắc Hà ( Lào C ai), Sìn Hồ ( Lai Châu ). Nguồn thứ hai do cộng đồng người Hoa ở huyện Quản Bạ và Đồng Văn (tỉnh Hà Giang) tự động nhập giống Ô đầu từ bên kia biên giới về trồng [1]. 1.1.5. Bộ phận dùng: Rễ củ: Củ cái gọi là Ô đầu, chỉ được dùng ngoài. Củ nhánh gọi là Phụ tử được chế biến thành Phụ tử chế để dùng trong. 1.2. Thành phần hóa học: Đến nay đã có tới hàng trăm công trình nghiên cứu về thành phần hoá học của chi Aconitum L., trong đó có ít nhất 96 loài đã được nghiên cứu. Trong số đó thì chủ yếu các công trình nghiên cứu về phần rễ củ (Ô đầu, Phụ tử), chỉ có ít công trình nghiên cứu về bộ phận trên mặt đất của một số loài Aconitum spp. ĩử in Aconitum vulparia [23], Aconitum napellus [18], [19], Aconitum leaveỴll]. Thành phần hoá học chính trong chi Aconitum L. là alcaloid, flavonoid, ngoài ra cũng có một số chất thuộc nhóm polysaccharid, glycosid 1.2.1. Thành phần hoá học của rễ củ ( Ô đầu, Phụ tử ): 12.1.1. Alcaloid. Các nhà nghiên cứu trên thế giới đã xác định được thành phần có hoạt tính sinh học mạnh nhưng độc tính cao thuộc nhóm alcaloid, trong đó được quan tâm nhiều nhất là các alcaloid diterpenoid. Một số tác giả đã phân lập được một số alcaloid thuộc các nhóm khác, đặc biệt là l-benzyl- tetrahydroisoquinolin và aporphin là những alcaloid có hoạt tính sinh học mạnh [16]. a. Alcaloid diterpenoid. Là nhóm alcaloid đặc trưng của chi Aconitum L. và cũng là nhóm tạo ra độc tính cao. Căn cứ vào cấu trúc của khung diterpenoid, các tác giả đã chia các alcaloid này thành 2 nhóm: Cig-Norditerpenoid alcaloid và C20” Diterpenoid alcaloid [16]. Gần đây, một số tác giả bổ sung thêm 2 khung ít gặp hơn: Cjg- Diterpenoid alcaloid [26] và khung Bisditerpenoid alcaloid [20]. Căn cứ vào số liên kết ester vào khung diterpenoid, nhóm alcaloid này lại được chia thành 3 nhóm [15]: - Nhóm 1: phân tử có 2 nhóm ester liên kết vào khung diterpenoid (diester alcaloid) như aconitin, mesaconitin, - Nhóm 2: phân tử có 1 nhóm ester liên kết vào khung diterpenoid (monoester alcaloid) như benzoylaconin, benzoylmesaconin, - Nhóm 3 : Không có dây nối ester trong phân tử như aconin, mesaconin, b. Alcaloid khác. Là các alcaloid không có cấu trúc diterpenoid đặc trưng của các loài Ô đầu, chúng bao gồm các isoquinolin (higenamin, N-demethyl-colletin và O- methyl-armepavin) và các amin [16]. Vói các tài liệu thu thập được, đã có khoảng 400 alcaloid được phân lập từ 80 loài thuộc chi Aconitum L [7]. * Hàm lượng alcaloid trong rễ củ của một số loài Aconitum L. Hàm lượng alcaloid toàn phần, nhóm diesteralcaloid cũng như các alcaloid trong chi Aconitum L. khác nhau, tuỳ thuộc vào loài, thời kỳ thu hái, bộ phận dùng , vùng trồng, nhiệt độ môi trưcmg trồng [16]. Hàm lượng alcaloid toàn phần, diester alcaloid và một số alcaloid chính trong củ của một số loài thuộc chi Aconitum L. được thể hiện trong bảng 1.1. Bảng 1.1. Hàm lượng alcaloid toàn phần, diester alcaloid và một số alcaỉoid chính trong củ của một số loài thuộc chi Aconitum L. Tên, bộ phận Địa phương Alctp (%) Diester alc (%) Một số alcaloid chính Tài liệu A. carmichaelii Debx. Phu tử Trung Quốc 0,82- 1,56 0,07- 0,17 Hypaconitin (0,179%), mesaconitin (0,027%), deoxyaconitin (0,013%), Aconitin (0,003%) 16 Tứ Xuyên 0,77 Mesaconitin (0,4%), Hypaconitin, aconitin 16 SaPa 1,15- 1,21 0 ,21- 0,34 Aconitin(0,0054-0,0125%) 16 Xuyên ô Shensi 0,32 Aconitin, hypaconitin (0,1%) 16 Đài Loan 0,58 0,27 Aconitin, mesaconitin, hypaconitin 16 Ôđầu Nhật Bản, (Hokkaido) 1,04- 1,1 Mesaconitin + aconitin (0,14-0,16%), hypaconitin 16 Nhật Bản, Honshu 1.09- 1.32 Mesaconitin + aconitin (0,13-0,23%), hypaconitin (0,03-0,06%) 16 Thảo ô Đài Loan 0,41 0,2 Aconitin, mesaconitin, hypaconitin 16 [...]... sống Aconitum carmichaelii Debx có tác dụng hạ glulose huyết [30] - Glycosid: Fuzinosid, Yokonosid glucosid [16] 1.2.2 Thành phần hoá học của phần trên mặt đất của cây Ô đầu Các công trình nghiên cứu thành phần hoá học của phần trên mặt đất của cây Ô đầu không nhiều Một số tác giả đã phân lập được một số Alcaloid diterpenoid và Flavonoid glycosid từ phần trên mặt đất (thân, lá, hoa ) của một số loài... sinh học của phần trên mặt đất của cây Ô đầu: Các nghiên cứu về tác dụng sinh học của phần trên mặt đất của cây Ô đầu hiện nay còn rất ít + Tác dụng chống oxy hoá: Flavonoid glycosid trong hoa của một số loài Aconitum spp như A.napellus, A.paniculatum, A.vulparia [17] và Alcaloid trong phần trên mặt đất ( thân, lá, hoa ) của Aconitum laeve [27] có tác dụng chống oxy hoá + Tác dụng quét gốc tự do: của. .. con bú không dùng [14] Không dùng chung vói Bán hạ, Bạch cập, Bối mẫu, Qua lâu nhân [3], [29] 1.4.2 Phần trên mặt đất: Rất ít tài liệu đề cập đến việc sử dụng phần trên mặt đất của cây Ô đầu làm thuốc chữa bệnh Dược điển Trung Quốc 2005 có chuyên luận “Thảo ô diệp” (Folium Aconiti kusnezoffii) là lá khô của cây Bắc Ô đầu {Aconitum kusnezoffii Reichb.) Đây là vị thuốc thường được dân tộc Mông cổ sử... tộc Mông cổ sử dụng [29]: - Công năng: thanh nhiệt, giải độc, giảm đau - Chủ trị: chứng sốt nóng, đau bụng ỉa chảy, đau đầu, đau răng - Kiêng kỵ: phụ nữ có thai không được dùng Phần 2: THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1 Nguyên liệu, phương tiện và phương pháp nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu: Các mẫu nghiên cứu được lấy từ các bộ phận của cây Ô đầu Sa Pa có tên khoa học là Aconitum carmichaelii Debx., họ Ranunculaceae... giọt thuốc thử Bouchardat thấy tủa nâu (phản ứng dương tính) Kết quả: Cả 3 phản ứng đều dương tính vói cả 5 mẫu Kết quả định tính thành phần hóa học của các bộ phận trên mặt đất của cây Ô đầu Sa Pa được trình bày ở bảng 2.1 Bảng 2.1: Kết quả định tính các nhóm chất trong cây ố đầu: s Kết quả Tên nhóm T Đánh Phản ứng chất PTS T Thân Lá Hoa Hạt Dấu hiệu để 1 Chất béo lại vết mỡ trên giấy giá Có trong + -... ký đồ của aconitin và alcaloid trong các mẫu nghiên cứu Nhận xét: Từ kết quả sắc ký đồ được ghi ở hình 2.3 cho thấy: - Sắc ký đồ của PTS có 15 pic, của hoa có 21 pic, của lá có 18 pic, của thân có 15 pic, của hạt có 16 pic - Trên sắc ký đồ của các mẫu nghiên cứu đều xuất hiện pic có thời gian lưu trùng với thời gian lưu của pic của aconitin chuẩn (khoảng 14,8 phút) 2.22.2 Định lượng: M ẫu nghiên cứu: ... lượng alcaloid toàn phần trong PTS, thân, lá, hoa, hạt của cây ô đầu Lần định Kàm lượng alcaloid toàn phần % lượng PTS Thân Lá Hoa Hạt 1 1,04 0,45 0,63 1,34 2,29 2 0,96 0,49 0,61 1,50 2,33 3 0,98 0,47 0,67 1,32 2,22 Trung bình 0,99 0,47 0,64 1,39 2,28 Nhận xét: hàm lượng alcaloid toàn phần trong các bộ phận của cây Ô đầu khác nhau, giảm dần theo các bộ phận: hạt - hoa - phụ tử - lá - thân, b Định lượng... xác - Các dụng cụ thí nghiệm hoá học b Hoá chất nghiên cứu: - Dung dịch chuẩn H2SO4 0,1N; NaOH 0,1N; HCl 0,1N của Công ty Hóa chất vật liệu điện và vật tư khoa học kỹ thuật TPHCM - Cồn tuyệt đối C2ỈỈ5OH do Công ty cổ phần hóa chất tinh khiết Hà Nội cung cấp - Aconitin chuẩn của hãng Latoxan - Pháp - Các hóa chất và thuốc thử khác ở Khoa Hoá thực vật- Viện Dược liệu và phòng Kiểm ta chất lượng, công ty... diester alcaloid trong các bộ phận của cây Ô đầu Sa Pa có sự khác nhau, giảm dần theo các bộ phận: Hoa-hạt-PTS-lá-thân c Định lượng aconitin: Định lượng aconitin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [10]: Tiến hành như phần định tính bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (mục b trong 2.2.2.1) Từ diện tích pic của aconitin chuẩn và thử (mẫu nghiên cứu) tính ra hàm lượng của aconitin [ 10... [17] + Tác dụng chống viêm: Alcaloid trong phần trên mặt đất của Aconitum laeve có tác dụng chống viêm [27] + Tác dụng ức chế hoạt động của tyrosinase: của alcaloid trong phần trên mặt đất của Aconitum laeve [27] 1.4 Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền: 1.4.1 Phụ tử sống Phụ tử sống thưòfng chỉ được dùng ngoài [3], [6 ], [13], được bào chế dưới dạng cồn Ô đầu, dùng để chữa đau dây thần kinh ngoại . Yokonosid glucosid [16]. 1.2.2. Thành phần hoá học của phần trên mặt đất của cây Ô đầu. Các công trình nghiên cứu thành phần hoá học của phần trên mặt đất của cây Ô đầu không nhiều. Một số tác giả. số bộ phận trên mặt đất (gồm thân, lá, hoa, hạt) của cây Ô đầu Sa Pa chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu thành phần hoá học các bộ phận trên mặt đất của cây Ô đầu Sa Pa ( Aconitum carmichaelii. Tuy nhiên các công trình nghiên cứu này chủ yếu là phần rễ củ, chưa có nghiên cứu nào về các bộ phận trên mặt đất của cây Ô đầu Sa Pa này. Với mục tiêu nghiên cứu về các thành phần hóa học có