BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI oỉíoDícaĩo DƯƠNG THỊ HỔNG ÁNH NGHIÊN CỨU BÀO CHÊ THUỐC TIÊM ĐÔNG KHÔ a-CHYMOTRYPSIN (KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DUỌC SỸ KHÓA 2001-2006) Người hướng dẫn Nơi thực hiện Thời gian thực hiện : PGS.TS. NGUYÊN VĂN LONG THS. TĂNG THỊ DIỆU LINH : Bộ môn Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội Xí nghiệp Dược phẩm Trung ương 1 : 7/2004-5/2006 HÀ NỘI - 5/2006 £Ờ3.&ẦMơn Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới: Thầy giáo PGS. TS. Nguyễn Văn Long là người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Dưới sự hướng dẫn của thầy, em đã có điều kiện học tập và sáng tỏ rất nhiều điều trong thực hành cũng như lý thuyết. Trong quá trình làm thực nghiệm và nghiên cứu, em cũng đã nhận được sự giúp đỡ, tạo điều kiện của các thầy cô giáo, kỹ thuật viên của Bộ môn Bào chế, các anh chị đang công tác tại phòng Kiểm nghiệm và phòng Nghiên cứu phát triển, Xí nghiệp Dược phẩm Trung ương I, đặc biệt là sự giúp đỡ của Thạc sỹ Tăng Thị Diệu Linh. Em xỉn cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu này. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình và bè bạn đã động viên, giúp đỡ em hoàn thành nhiệm vụ của mình. Hà Nội, tháng 5 năm 2006 Sinh viên Dương Thị Hồng Ảnh CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT ATEE BTEE CT DĐVNIII kl/kl TD USP vđ v/v XNDPTW2 a-chy N-acetyl-L-tyrosin ethyl ester benzoyl-L-tyrosin ethyl ester Công thức Dược điển Việt Nam III khối lượng/khối lượng Tá dược Dược điển Mỹ vừa đủ Thể tích/thể tích Xí nghiệp dược phẩm trung ương 2 a-chymotrypsin MỤC LỤC ĐẶT VẤN Đ Ể 1 PHẦN 1-TổNG QUAN . . 2 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ ENZYM a-CHYMOTRYPSIN 2 1.1.1. Nguồn gốc, cấu tạo . . 2 1.1.2. Tính chất vật lý . 2 1.1.3. Các phưcmg pháp định lượng (xác định hoạt tính) 2 1.1.4. Tác dụng dược lý . 3 1.1.5. Chỉ định . . 3 1.1.6. Liều lượng và cách dùng . . 4 1.1.7. Chế phẩm . 4 1.2. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐÊN HOẠT ĐỘNG, ĐỘ ổN ĐỊNH CỦA ENZYM PROTEIN VÀ BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC 4 1.2.1. Các yếu tố ảnh hưcmg đến hoạt động enzym 4 1.2.2. Các yếu tố ảnh hưcmg đến độ ổn định của protein 5 1.2.3. Biện pháp làm tăng độ ổn định của protein 7 1.3. ĐẠI CƯƠNG VỀ ĐÔNG KHÔ 8 1.3.1. Khái niệm, ưu nhược điểm của phưoìig pháp đông khô 8 1.3.2. Các giai đoạn trong quá trình đông khô . . 9 1.4. THUỐC TIÊM ĐÔNG KHÔ 10 1.4.1. Khái niệm 10 1.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng và độ ổn định của chế phẩm thuốc tiêm đông khô . 10 PHẦN 2-THựC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ 16 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THựC NGHIỆM 16 2.1.1. Nguyên vật liệu . 16 2.1.2. Phương tiện thực nghiệm 16 2.1.3. Nội dung nghiên cứu 17 2.1.4. Phương pháp nghiên cứu . 17 2.2. KẾT QUẢ THựC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 25 2.2.1. Nghiên cứu xây dựng công thức thuốc tiêm đông khô a-chymotrypsin 5000 đơn vị ƯSP/lọ . . . 25 2.2.2. Nghiên cứu xây dựng các thông số kỹ thuật trong quy trình bào chế thuốc tiêm đông khô a-chymotrypsin 5000 đơn vị USP/lọ . 36 2.2.3. Kết quả bước đầu nghiên cứu độ ổn định của thuốc tiêm đông khô a-chymotrypsin 5000 đơn vị USPAọ 38 2.2.4. Kết quả nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cơ sở cho chế phẩm 42 KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT . 43 ĐẶT VẤN ĐỂ Viêm là một phản ứng tại chỗ của cơ thể, gặp trong nhiều bệnh, do nhiều nguyên nhân sinh ra. Các thuốc chống viêm có cấu trúc Steroid và phi Steroid bên cạnh tác dụng chống viêm còn chứa đựng nhiều tác dụng không mong muốn như gây loét dạ dày tá tràng, suy giảm miễn dịch, dễ chảy máu Vì vậy, hiện nay trên thế giới đã mở ra một hướng mới sử dụng enzym có tác dụng chống viêm như trypsin, Chymotrypsin, papain, seratidopeptidase a-chymotrypsin là một enzym đã được sử dụng làm thuốc chống viêm rất hiệu quả. Tuy nhiên, do bản chất là protein, enzym này rất dễ bị phân huỷ trong quá trình bào chế cũng như quá trình bảo quản. Phần lớn các chế phẩm chứa a-chymotrypsin trong nước đều có độ ổn định không cao. Nhằm khắc phục nhược điểm này, a-chymotrypsin được bào chế dưới dạng thuốc tiêm đông khô. Ngày nay trên thế giói, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của các ngành khoa học công nghệ, ngành dược cũng đang trên đà phát triển mạnh mẽ. Các kỹ thuật bào chế mới trong đó có đông khô, đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ bào chế các dạng thuốc. Các chế phẩm đông khô không những bền vững, ổn định trong thời gian dài mà còn có tốc độ hoà tan nhanh. Đông khô đã được ứng dụng để sản xuất các loại kháng sinh, hỗn hợp các vitamin, vaccin, thuốc chống viêm Xuất phát từ thực tiễn trên đây, chúng tôi tiến hành đề tài: ''Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm đông khô a-chymotrypsirí’'’ với mục tiêu: • Xây dựng công thức và quy trình bào chế thuốc tiêm đông khô a-chymotrypsin 5000 đơn vị USP/lọ • Bước đầu nghiên cứu độ ổn định của chế phẩm • Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cơ sở cho chế phẩm PHẦN 1 - TỔNG QUAN 1.1. ĐẠI CƯƠNG VỂ ENZYM a-CHYMOTRYPSIN 1.1.1. Nguồn gốc, cấu tạo - a-chymotrypsin là enzym thuỷ phân protein, được điêu chế bằng cách hoạt hoá chymotrypsinogen, chiết xuất từ tuyến tuỵ bò [6],[9],[39],[46]. - a-ehymotrypsin có phân tử lượng 21600, được cấu tạo bởi 3 chuỗi polypeptid liên kết với nhau bằng các cầu disulfid, số lượng các acid amin là 241 [4],[9]. - a-chymotrypsin thuộc nhóm serin-protease, ưu tiên cắt các liên kết peptid ở gần các acid amin có nhân thcím. Trung tâm hoạt động gồm gốc histidin-57 được khu trú giữa gốc aspartic-102 và serin-195. Ba gốc này nối với nhau bằng liên kết hydro tạo thành phức hợp “di chuyển điện tích” [4],[6],[9]. 1.1.2. Tính chất vật lý - Dạng bột vô định hình hoặc kết tinh trắng đến trắng vàng. Dạng vô định hình dễ hút ẩm. - Độ tan: a-chymotrypsin hơi tan trong nước. Dung dịch 1% trong nước có pH 3,0-5,0 [39],[46]. 1.1.3. Các phương pháp định lượng (xác định hoạt tính) Từ năm 1959, Hummel [50] đã đề ra phương pháp định lượng a-chymotrypsin dựa trên tốc độ phản ứng thuỷ phân cơ chất benzoyl-L-tyrosin ethyl ester (BTEE) bởi enzym này ở bước sóng 256 nm. Theo đó, 1 đơn vị enzym có khả năng thủy phân 1 ịimol BTEE trong 1 phút ở pH 7,8 và nhiệt độ 25°c. Trong nghiên cứu của N. Sperti và cộng sự [35], hoạt tính của a-chymotrypsin được đánh giá qua tốc độ thủy phân cơ chất N-glutaryl-L-phenylalanin-p-nitroanilid (GPNA) bằng cách theo dõi sự tăng độ hấp thụ ở bước sóng 410nm của p-nitroanilin được giải phóng ra, trong điều kiện 25°c và pH 7,75. Theo các dược điển Anh, Mỹ, a-chymotrypsin được định lượng bằng cách so sánh tốc độ thuỷ phân cơ chất N-acetyl-L-tyrosin ethyl ester (ATEE) của mẫu thử với a-chymotrypsin chuẩn trong cùng một điều kiện: a) Phương pháp giảm mật độ quang Tốc độ thủy phân cơ chất ATEE của mẫu thử được đánh giá qua độ giảm độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch cơ chất ở bước sóng 237 nm sau những khoảng thời gian nhất định [47]. Phưcmg pháp định lượng này phù hợp với điều kiện thực tế tại cơ sở và đã được Viện kiểm nghiệm áp dụng. Trong phương pháp này, giá trị độ hấp thụ đo được không cần chính xác tuyệt đối mà quan trọng là tốc độ thay đổi độ hấp thụ phải hằng định. Tuy nhiên, phương pháp định lượng này yêu cầu điều kiện về nhiệt độ 25 ±0 ,rc và khoảng nồng độ tiến hành phép định lượng khá hẹp từ 12-16 đơn vị USP a-chymotrypsin trong 1 ml. b) Phương pháp phân tích thể tích Tốc độ thủy phân cơ chất ATEE của mẫu thử được đánh giá qua độ giảm pH của dung dịch cơ chất sau những khoảng thời gian xác định. So sánh trong cùng điều kiện với a-chymotrypsin chuẩn [46]. Phương pháp định lượng này cũng yêu cầu duy trì nhiệt độ 25±0,l°c. Quá trình chuẩn độ đòi hỏi tiến hành trong bầu khí nitrogen. Các dụng cụ cần thiết để tiến hành chuẩn độ phải có yêu cầu đặc biệt như buret chia độ tới 0,005ml, máy đo pH có khoảng đo rộng. 1.1.4. Tác dụng dược lý - a-chymotrypsin được dùng trong nhãn khoa để làm tan dây chằng mảnh dẻ treo thuỷ tinh thể, giúp loại bỏ dễ dàng nhân mắt đục trong bao và giảm chấn thương cho mắt. - a-chymotrypsin cũng được sử dụng nhằm làm giảm viêm và phù mô mềm do áp xe và loét, hoặc do chấn thưofng. Enzym này còn giúp làm giảm các dịch tiết đường hô hấp trên ở người bệnh hen, viêm phế quản, bệnh phổi và viêm xoang [6],[39]. 1.1.5. Chỉ định - Hỗ trợ trong phẫu thuật đục thuỷ tinh thể để lấy bỏ nhân mắt dễ dàng - Phù nề sau chấn thương hoặc sau phẫu thuật - Hỗ trợ bệnh lý viêm đường hô hấp, giảm tiết dịch nhày đờm, ức chế dịch rỉ viêm [6],[39]. 1.1.6. Liều lượng và cách dùng Tuỳ theo từng loại bệnh và các dạng bào chế khác nhau mà xác định liều cho thích hợp. Điều trị phù nề sau chấn thương và sau phẫu thuật: tiêm bắp 5000 đơn vị USP 1 lần, ngày 1-3 lần [6], 1.1.7. Chế phẩm - Bột để pha dung dịch dùng trong nhãn khoa: 300 đơn vị USP - Bột để pha dung dịch tiêm bắp: 25 microkatal ( hoặc 5000 đơn vị USP) - Viên nén: 21 microkatal (uống hoặc đặt dưới lưỡi), 4200 đofn vị USP [6],[39] 1.2. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐÊN HOẠT ĐỘNG, ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA ENZYM PROTEIN VÀ BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC Enzym là chất xúc tác sinh học có bản chất protein, có tính đặc hiệu rất cao và hiệu lực xúc tác rất lófn [4]. 1.2.1. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzym ❖ Tác dụng của nhiệt độ Nhiệt độ có tác dụng làm tăng tốc độ phản ứng enzym lên đến tốc độ cực đại, chừng nào enzym chưa bị biến tính, mỗi khi tăng nhiệt độ lên đến khoảng 10°c, tốc độ phản ứng sẽ tăng lên khoảng 2 lần. Khi tăng nhiệt độ lên đến 60-70°C thì phần lớn enzym mất hẳn hoạt tính, ở nhiệt độ lạnh, enzym không bị biến tính. Vì vậy, các enzym thường được bảo quản ở nhiệt độ 0°c, hoặc thấp hơn nữa [4],[8]. Tốc độ giảm hoạt tính của a-chymotrypsin trong dung dịch nước ở pH 7,4 phụ thuộc vào nhiệt độ. ở nhiệt độ trên 45°c, hoạt tính còn lại của a-chymotrypsin giảm rất nhanh [44]. ❖ Tác dụng của pH Enzym rất nhạy cảm với pH của môi trưòỉng, mỗi enzym có một trị số pH thích hợp cho sự hoạt động của nó, ở đó tốc độ phản ứng enzym lớn nhất. pH có tác dụng vào trạng thái ion hóa của phân tử enzym nói chung và các nhóm hoạt động của enzym nói riêng, do đó ảnh hưởng đến hoạt tính enzym. Mặt khác, pH còn ảnh hưởng đến độ bền vững của phân tử enzym [4],[8]. ở dạng dung dịch, a- chymotrypsin ổn định nhất ở pH = 3,0 và có hoạt tính tối đa ở pH = 8,0 [39],[46]. ❖ Tác dụng của ion kim loại Một số kim loại ức chế enzym này nhưng lại hoạt hoá enzym khác hay ức chế một enzym ở nồng độ này nhưng lại hoạt hoá chính enzym đó ở nồng độ khác. Tác dụng của ion kim loại đối với enzym rất phức tạp [4],[8]. 1.2.2. Các yếu tô ảnh hưởng đến độ ổn định của protein ❖ Thoái hóa về hóa học - Phẩn ứng thuỷ phân Phản ứng thuỷ phân protein thường là thuỷ phân liên kết peptid và thuỷ phân nhóm amid. Trong môi trường acid mạnh hoặc môi trường acid nhẹ, nhiệt độ cao, protein dễ dàng bị thuỷ phân liên kết peptid [17]. Sự thuỷ phân amid thường diễn ra ở phần glutamin và asparagin còn lại. Phần asparagin còn lại bị thủy phân amid qua dạng vòng imid tạo ra acid aspartic và acid iso-aspartic tương ứng, trong môi trưòỉng pH trung tính đến base. Phần glutamin còn lại bị thủy phân amid với tốc độ chậm hơn [17],[44]. - Oxy hoá Các nhóm amino acid, đặc biệt với các nhóm có nhân thơm như methionin, histidin rất dễ bị oxy hoá. Tác nhân oxy hoá là phân tử O2, H2O2, ion kim loại [17],[31],[44]. Nhiều hormon bị mất hoạt tính sinh học do sự oxy hoá phần methionin còn lại trong phân tử thành sulfoxid tương ứng [17]. ở pH 8.0, phần cystein còn lại của a-amylase bị oxy hóa [44]. [...]... dung nghiên cứu • Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưcmg đến việc xây dựng công thức và quy trình bào chế thuốc tiêm đông khô a-chymotiypsin 5000 đơn vị ƯSPAọ • Bước đầu nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định của chế phẩm • Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cơ sở của chế phẩm 2.1.4 Phương pháp nghiên cứu 2.I.4.I Nghiên cứu xây dựng công thức và quy trình bào chế thuốc tiêm đông khô a -chymotrypsin. .. của dung dịch a -chymotrypsin pha bằng dung dịch HCl 0,001 N Cl Khả năng hoà tan, độ trong và thời gian trong Trước khi lọc pH Tan nhanh, (+), 20 phút 3,63 8 1 lần 2 Tan nhanh, (++) Tan nhanh, (++), 20 phút 3,00 1 11 Tan nhanh, (++) Tan nhanh, (++), 30 phút 3,40 12 Tan nhanh, (+) Tan nhanh, (+), 20 phút 3,50 13 Tan nhanh, (+) Tan nhanh, (+), 15 phút 3,50 15 lần 2 Tan nhanh, (++) Tan nhanh, (++), 15 phút... TH U Ố C TIÊM ĐÔNG KHÔ 1.4.1 Khái niệm Thuốc tiêm đông khô là thuốc tiêm dạng bột vô khuẩn được pha thành dung dịch hoặc hỗn dịch ngay trước khi tiêm, được bào chế bằng phương pháp đông khô [I],m,[i0] 1.4.2 Các yếu tô ảnh hưởng đến chất lượng và độ ổn định của chế phẩm thuốc tiêm đông khô a) Các yếu tố thuộc về công thức > Dược chất Giống như các dạng bào chế khác, dược chất là thành phần quan trọng... với nhiệt và do đó, ức chế các phản ứng thoái hóa [17] Phương pháp đông khô được ứng dụng phổ biến hofn đối với các chế phẩm protein [17],[26],[30],[33] Thuốc tiêm a -chymotrypsin dạng biến đổi (hãng Princeton Separation Inc.) được bào chế dưới dạng đông khô và đượG bảo quản trong lọ thuốc tiêm không có nước cho tới lúc hoà tan thuốc trở lại khi dùng [49] 1.3 ĐẠI CƯƠNG VỂ ĐÔNG KHÔ 1.3.1 Khái niệm, ưu... hành bào chế thuốc tiêm đông khô sử dụng các tá dược độn khác nhau: manitol, tá dược số 1 tá dược số 2, sorbitol, glucose, saccarose và lactose, dùng , riêng hoặc phối hợp, nhằm đánh giá ảnh hưcmg của các tá dược này tới chất lượng thuốc tiêm đông khô a -chymotrypsin (bảng 2.6) Bảng 2.6: Các tá dược trong thuốc tiêm đông khô a -chymotrypsin dùng dung môi HCl 0,001 N CT 1.4 17 10 12 Tá dược (mg) Manitol... trình đông khô bao gồm: - Nhiệt độ và thời gian đông lạnh - Nhiệt độ buồng ngưng, thời gian làm khô sơ cấp - Nhiệt độ và thời gian làm khô thứ cấp Thành phần 1 lọ - a -chymotrypsin 5 mg (tương đương 5000 đofn vị USP) -T á dược vđ - Dung m ôi vđ 1 ml ‘Í Ị X [tĩỉẻi a) Quy trình bào chế thuốc tiêm đông khô a -chymotrypsin 5000 đơn vị USP/lọ ❖ Xử lý lọ thuỷ tinh, nút cao su, nút nhôm Trước khi pha. .. - Độ trong, thời gian ổn định độ trong của dung dịch sau khi pha lại - pH của dung dịch sau khi pha lại - Mất khối lượng do sấy khô - Hoạt tính a -chymotrypsin • Phương pháp định lượng a-chymotrypsỉn trong c h ế phẩm thuốc tiêm đông khô Để xác định hoạt tính của a -chymotrypsin trong các chế phẩm thuốc tiêm đông khô, chúng tôi sử dụng phưotìg pháp giảm mật độ quang theo USP 29 Do không thể điều chỉnh... để pha thuốc tiêm phải đạt độ tinh khiết về mặt vật lý, hóa học và sinh học cao hơn so với cùng dược chất đó nhưng dùng trong các dạng bào chế khác Đối với các dược chất không ổn định về tính chất vật lý và hoá học khi ở dạng dung dịch hoặc hỗn dịch, phải bào chế dưói dạng thuốc tiêm đông khô nhằm làm giảm tối thiểu thời gian tiếp xúc với pha nước [ ],[?],[ 10] 1 Khi thiết kế công thức thuốc tiêm đông. .. đơn vị USP/Iọ Bào chế thuốc tiêm đông khô a -chymotrypsin với sự thay đổi các yếu tố trong công thức và các thông số kỹ thuật trong quá trình đông khô, từ đó tìm ra công thức và quy trình bào chế thích hợp • Nghiên cứu các yếu tố thuộc về công thức bao gồm: - Dung môi - Tá dược độn và tỷ lệ tá dược độn - pH của dung địch trước khi đông khô - Hệ đệm - Bao bì đóng gói trực tiếp • Nghiên cứu các thông... silicon Sấy khô 110°C/3 giờ T Rửa nước cất 2 lần đã Sấy khô loc qua màng 0,45ụm ị ị Rửa nước cất 1 lần Tiệt khuẩn bằng nhiệt 160°C/3 giờ Rửa nước cất 2 lần đã lọc qua màng 0,45 ụm i Luộc sôi với nước cất 2 lần trong 30 phút ị Sấykhô 110°c/3giờ Rửa nước xà phòng ❖ Pha c h ế thuốc tiêm đông khô Thuốc tiêm đông khô a-chymotiypsin được pha chế theo quy trình sau đây: Hình 2.2: Sơ đồ tóm tắt quy trình bào c . [7],[10],[16],[17],[30],[31]. lATHUỐC TIÊM ĐÔNG KHÔ 1.4.1. Khái niệm Thuốc tiêm đông khô là thuốc tiêm dạng bột vô khuẩn được pha thành dung dịch hoặc hỗn dịch ngay trước khi tiêm, được bào chế bằng phương pháp đông khô [I],m,[i0]. 1.4.2 cứu bào chế thuốc tiêm đông khô a-chymotrypsirí’'’ với mục tiêu: • Xây dựng công thức và quy trình bào chế thuốc tiêm đông khô a -chymotrypsin 5000 đơn vị USP/lọ • Bước đầu nghiên cứu độ. đông khô, đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ bào chế các dạng thuốc. Các chế phẩm đông khô không những bền vững, ổn định trong thời gian dài mà còn có tốc độ hoà tan nhanh. Đông