Bộ Y TÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI • • • • KIÈU MAI DUNG KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT Độ ĐẾN HÀM LƯỢNG RUTIN TRONG HÒE HOA (KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP D ư ợ c s ĩ KHÓA 2< Người hướng dẫn: Th.s Nguyễn Đức Toàn Nơi thực hiện: Khoa Kiểm nghiệm Đông dược, dược liệu - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương Bộ môn Dược học cổ truyền - Trường Đại học Dược Hà Nội. Thời gian thực hiện: Tháng 10/2006 - 5/ 2007. Hà Nội - 5/2007 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết on sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn Tiến sỹ Phùng Hòa Bình, Thạc sỹ Nguyễn Đức Toàn, người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Khoa Kiểm nghiệm Đông dược, dược liệu - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, các thầy cô giáo bộ môn Dược học cổ truyền đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận. Đồng thời, tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo đã giảng dạy và giúp đỡ tôi trong thời gian học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội tháng 5 năm 2007 Sinh viên: Kiều Mai Dung MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Phần 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Vị thuốc Hòe hoa 2 1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố 2 1.1.2. Thành phần hóa học 2 1.1.3. Tác dụng theo YHCT 3 1.2. Rutin 3 1.2.1. Công thức hóa học 3 1.2.2. Tính chất vật lý 4 1.2.3. Định tính, định lượng 4 1.2.4. Tác dụng dược lý 8 1.2.5. Một số chế phẩm có chứa Rutin 9 1.2.6. Chiết suất Rutin 10 1.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thành phần hóa học của vị thuốc 11 Phần 2: THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 15 2.1. Nguyên vật liệu, trang thiết bị nghiên cứu 15 2.1.1. Nguyên vật liệu 15 2.1.2. Thiết bị nghiên cứu 15 2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1. Phương pháp định tính Rutin 16 2.2.2. Khảo sát phương pháp chiết rutin từ Hòe hoa 16 2.2.3. Khảo sát, lựa chọn điều kiện sắc ký 19 2.2.4. Định lượng Rutin trong các MNC 19 2.2.5. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả 20 2.3. KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 2.3.1. XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP 22 2.3.2. ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP 24 2.3.3. ĐỊNH LƯỢNG RUTIN TRONG CÁC MNC 27 BÀN LUẬN 34 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 CÁC CHỮ VIÉT TẮT BuOH: Butanol DĐ: Dược điển HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-Performance Liquid Chromatography) MNC: Mầu nghiên cứu MeOH: Methanol SKĐ: Sắc ký đồ SKLM: Sắc ký lớp mỏng TPHH: Thành phần hóa học TW: Trung ương YHCT: Y học cổ truyền ĐẶT VẮN ĐỀ Hòe hoa Flos Sophorae là nụ của cây hòe Sophora japonica L., họ Đậu (Fabaceae). Hòe hoa là vị thuốc quý được Đông y sử dụng để chữa các bệnh như chảy máu cam, băng huyết, cao huyết áp, trĩ Thành phần hóa học chủ yếu của Hòe hoa là Rutin. Rutin là hoạt chất có tác dụng làm giảm tính thấm của mao mạch, tăng sức bền của thành mạch, được ứng dụng trong Tây y để chữa các bệnh có liên quan đến tổn thương thành mạch như trĩ, chảy máu đáy mắt và các chứng bệnh có liên quan đến tai biến mạch máu như xơ vữa động mạch, rối loạn tuần hoàn Ngoài ra Rutin còn được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực bao màu, công nghệ thực phẩm Do vậy nhu cầu sử dụng Rutin ngày càng tăng. Rutin là một Flavonoid dễ bị thủy phân. Khi thủy phân Rutin cho Quercetin, Glucose và Rhamnose. Nhiệt độ, độ ẩm và enzym (trong Hòe hoa) làm tăng quá trình thủy phân Rutin. Vì vậy, trong quá trình bảo quản, chế biến hàm lượng Rutin trong Hòe hoa thường có sự thay đổi. Một số công trình nghiên cứu gần đây đã thông báo ảnh hưởng của nhiệt độ đến thành phần hóa học, hàm lượng hoạt chất chính và thành phần hóa học của một số vị thuốc thay đổi. Đe góp phần tìm hiểu ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng Rutin trong vị thuốc Hòe hoa chúng tôi thực hiện đề tài: “Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng Rutin trong Hòe hoa” với mục tiêu: 1. Xây dựng phương pháp định lượng Rutin trong Hòe hoa bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). 2. ứng dụng phương pháp đã xây dựng để khảo sát hàm lượng Rutin trong Hòe hoa đã được xử lý bằng nhiệt độ. Phần 1: TỎNG QUAN 1.1. Vị thuốc Hòe hoa Là nụ hoa đã phơi hay sấy khô của cây Hòe (Stypnoỉobium japonicum (L.) Schott; Syn. Sophora japonica L.), họ Đậu (Fabaceae). Nụ hoa hình trứng có cuống nhỏ, ngắn, một đầu hơi nhọn, dài 0,3 - 0,6 cm, rộng 0,2 - 0,4 cm. Đài hoa hình chuông, màu vàng xám, dài bằng 1/2 - 2/3 chiều dài nụ hoa, phía trên xẻ thành 5 răng nông. Cánh hoa chưa nở màu vàng. Mùi thom, vị đắng [4], [9], [17], [29]. 1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố Cây gỗ, to cao có thể đến 15 m, thân thẳng có chỏm lá tròn, cành cong queo. Lá kép lông chim lẻ, có 9 - 13 lá chét hình trứng, đỉnh nhọn, nguyên, dài 3 cm, rộng 1,5 - 2,5 cm. Cụm hoa hình chùy ở đầu cành. Tràng hoa hình bướm màu trắng ngà. Quả loại đậu không mở, dày và thắt nhỏ lại ở giữa các hạt. Ở nước ta hòe được trồng ở một số tỉnh Nam Hà, Nam Định, Thanh Hóa, Nghệ An và nhiều nhất là ở Thái Bình. Các nước như Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản cũng trồng. Ở Châu Âu hòe được trồng làm cảnh [4]. 1.1.2. Thành phần hóa học Thành phần hóa học chủ yếu là Rutin (ít nhất là 20%) [9], phần Aglycol của Rutin là Quercetin (Quercetol - thuộc nhóm flavonol), phần đường là Rutinose(6 - o- a L Rhamnopyranosyl- ị3- D- glycopyranose). Ngoài ra trong Hòe hoa còn có Betulin là dẫn chất của triterpenoid nhóm Lupan, Sophoradiol là dẫn chất của nhóm Olean, Sophorin A, B, c [4], [17]. Lá có 6 , 6 % flavonoid toàn phần, trong đó có 4,7% Rutin. Vỏ quả: 10,5% flavonoid toàn phần, trong đó có 4,3% là Rutin, Sophoricosid, Sophorabiosid và một số Flavonoid khác [4 ]. 1.1.3. Tác dụng theo YHCT - Tính vị: Vị đắng, tính hơi hàn [6 ], [17]. - Quy kinh: Vào 2 kinh Can và Đại tràng [6 ], [17]. - Công năng, chủ trị: [6 ] > Lương huyết, chỉ huyết: Dùng trong trường hợp xuất huyết như: chảy máu cam, trĩ chảy máu, phụ nữ băng huyết, đại tiểu tiện ra máu. > Thanh nhiệt, bình can: Dùng trong trường họfp can hỏa thượng viêm: Đau mắt đỏ, đau đầu. > Bình can, hạ áp: Hòe hoa sao vàng dùng trong trường hợp huyết áp cao, ngoài ra có thể dùng trong trường họp đau thắt động mạch vành. > Thanh phế chống viêm: Dùng trong trường hợp viêm thanh đới, nói không ra tiếng. 1.2. Rutin 1.2.1. Công thức hóa học • Công thức cẩu tạo:[4], [31 ] -3- • Công thức hóa học: C27H30O16 Rutin còn có tên gọi khác như Rutosid, quercetin-3-rutinoside và sophorin, hoặc (3, 3', 4', 5, 7 pentahydroxy flavone - 3- Rutinosid). Rutin là glycosid bao gồm flavonol Quercetin và disaccharide Rutinose. Khi thủy phân Rutin cho Quercetin, Glucose và Rhamnose [4], 1.2.2. Tính chất vật lý Bột kết tinh màu vàng hay vàng lục, không mùi, bay hơi có mùi đặc trưng, để ngoài ánh sáng màu hơi sậm lại. Dễ tan trong pyridin, tan trong methanol và các dung dịch kiềm loãng, hơi tan trong glycerin, khó tan trong ethanol và isopropanol (1/650) nhưng tan trong ethanol sôi (1/60), ít tan trong nước lạnh (1/8000), tan ít trong nước sôi (1 /2 0 0 ), không tan trong ether dầu hỏa, benzen, cacbon sulfid [4], [17]. Rutin có độ hấp thụ cực đại tử ngoại bước sóng 258,5nm và 362,5nm/ethanol, 359nm/methanol. Nhiệt độ nóng chảy: Khoảng 210°c, kèm phân hủy [17]. 1.2.3. Định tính, định lượng 1.2.3.1. Định tính [4], [5] a. Định tính bằng phương pháp ổng nghiệm: - Phản ứng Cyanidin: Dịch chiết + (Mg + dd HC1) => Dịch chuyển sang màu đỏ. - Phản ứng hơi Amoniac: Hơ tờ giấy thấm có nhỏ dịch chiết lên lọ Amoniac đặc: màu vàng đậm lên. - Phản ứng dd NaOH 0,1N: Dịch chiết + dd NaOH 0,1N: Màu vàng đậm lên - Phản ứng với dd FeCỈ3 5%: cho màu xanh lục. b. Sắc ký Thường dùng 2 loại sắc ký: SKLM và SKG [4], [5], [9], [11]. > Sắc ký lớp mỏng: + Bản mỏng: Chất hấp phụ Silicagel G + Dung môi thường dùng: • Benzen - AtOAc (3:1) • CHCỈ3 - MeOH (5:1) • Benzen - Aceton (9:1) • Toluen - Aceton (19:1) • CHCI3 - CH3COOH (9:1) > Sắc ký giấy: + Giấy sắc ký: Whatman số 1, số 3. + Dung môi thường dùng: • TBA - nBuOH - CH3COOH - H20 (3:1:1). • BAW - nBuOH - CH3COOH - H20 (4:1:5). • Forestal - CH3 COOH - HC1 - H20 (30:3:10). • Benzen - CH3 COOH - H20 (125:72:3). • CHCI3 - CH3 COOH - H20 (13:6:1) • nBuOH - CH3 COOH - H20 (5:1:4) • nBuOH - CH3 COOH - H20 (4:1:1) Hiện màu bằng đèn tử ngoại (UV) ở bước sóng 365nm hoặc bằng hơi ammoniac rồi soi đèn tử ngoại ở X = 254nm. 1.2.3.2. Định lượng: Để xác định hàm lượng Rutin trong chế phẩm hoặc trong dược liệu người ta có thể dùng các phương pháp sau: -5- • Phương pháp cân [8 ] Nguyên tắc: Rutin được chiết bằng cồn, dịch chiết được thủy phân bằng acid H2SO4 thu được Quercetin ít tan, lọc lấy tủa, sấy khô, cân rồi tính ra Rutin. • Phương pháp đo màu [4] Nguyên tắc: Dựa vào màu khi cho Rutin chuẩn và mẫu thử cùng tác dụng với AICI3 hoặc tiến hành phản ứng Cyanidin rồi đo màu. So sánh gam màu của mẫu thử và Rutin chuẩn đã biết nồng độ, từ đó suy ra nồng độ của Rutin trong mẫu thử. • Phương pháp quang phổ [4], [9] Nguyên tắc: Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại và khả kiến còn được gọi là phương pháp phân tích dựa trên sự hấp thụ bức xạ điện từ. Trên cơ sở định luật Lambert - Beer cho phép xác định nồng độ các chất bằng cách đo độ hấp thụ: Trong đdt: k là hệ số hấp thụ. 1 DTcĩĩỉèucIay của lóp dung dịch (cm) A là độ hấp thụ của dung dịch đo ở bước sóng cực đại. E\ là độ hấp thụ của dung dịch 1% (kl/tt), chiều dày của dung dịch là 1 cm khi đo ở bước sóng cực đại. Phổ u v của Rutin ở \ max = 362,5nm thì có E1%icm = 325 (Ethanol). Trên cơ sở đó xây dựng đường tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ Rutin. Đo độ hấp thụ của mẫu thử, đối chiếu với đường chuẩn tính được hàm lượng Rutin trong mẫu thử. • Phương pháp HPLC [7], [12], [20], [25], [30]. [...]... 2.3.3.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian sẩy Các MNC chiết xuất theo quy trình trong hình 2.2 Dịch chiết thu được pha loãng 20 lần, lọc dịch chiết qua màng lọc 0,45|im Định lượng bằng HPLC theo chương trình đã chọn Khi sấy hòe hoa ở cùng nhiệt độ, sự ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng Rutin được thể hiện ở các hình 2.6 và ở bảng 2.8 Bảng 2.8: Hàm lượng % (kl/kl) Rutin trong Hòe hoa khi sẩy ở nhiệt độ. .. của chất phân tích trong mẫu thử và mẫu chuẩn từ đó tính ra hàm lượng của nó trong mẫu cần định lượng Hàm lượng % (kl/kl) Rutin trong mẫu thử được tính theo công thức sau: At và As là diện tích píc của Rutin trong mẫu thử và mẫu chuẩn mT và ms là lượng cân của mẫu thử và Rutin chuẩn (g) p là hàm lượng % (kl/kl) Rutin trong mẫu chuẩn w là độ ẩm của mẫu thử (%) - 20- Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng... lệch chuẩn s RSD (%) Hàm lượng % (kl/kl) 25,67 26,30 25,78 25,95 26,17 26,24 26,02 0,26 0,99 Hàm lượng % (kl/kl) của Rutin trong Hòe hoa là 26,02 vói độ lệch chuẩn tương đối RSD = 0,99% cho thấy phương pháp có độ chính xác cao Kết quả này cho phép áp dụng chương trình sắc ký đã xây dựng để định lượng Rutin trong các MNC 2.3.2.3 Khảo sát độ đúng của phương pháp Độ đúng được khảo sát bằng phương pháp thêm... Nồng độ (mcg/ml) Hình 2.5: Đồ thị khảo sát khoảng tuyến tính -25- 2.3.2.2 Khảo sát độ chính xác của phương pháp Độ lặp lại của phương pháp được đánh giá bằng cách tiến hành thực nghiệm định lượng Rutin trong hoè hoa trên 6 mẫu thử riêng biệt, với các điều kiện như trên Kết quả được trình bày ở bảng 2.4 Bảng 2.4: Khảo sát độ chỉnh xác của phương pháp STT 1 2 3 4 5 6 Trung bình Độ lệch chuẩn s RSD (%) Hàm. .. sau: + Khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độ Rutin + Khảo sát độ lặp lại của phương pháp + Khảo sát độ đúng của phương pháp Trên cơ sở đó, chúng tôi đã lựa chọn chương trình sắc ký với các điều kiện sau để định lượng Rutin trong các MNC: ❖ Cột Inertsil-ODS-3 (5ịim; 250x4,6 mm) ❖ Detector u v , bước sóng phát hiện 254 nm ❖ Pha động: MeOH - Tetrahydrofuran - NaH2 PC>4 0,05M (pH=3) (10:20:70) ❖ Tốc độ dòng:... tính chất thăng hoa, bay hơi thì ít bị biến đổi cả về lượng và chất Những kết quả nghiên cứu gần đây [10], [16], [23] chứng minh rõ hàm lượng các chất trong vị thuốc thay đổi rất ít so với mẫu sống và được biểu thị trong bảng 1.1 - 11 - Bảng 1.1: Hàm lượng hoạt chất chính trong các MNC ở nhiệt độ từ 80°C-100°C Hàm lượng chất trong MNC (%) Dược liệu Hoạt chât chính 80°c Sống 1 0 Rutin Hòe hoa Quercetin... pháp thêm chuẩn Thêm chính xác 1 lượng Rutin chuẩn đã biết hàm lượng vào dung dịch thử sao cho tổng nồng độ Rutin trong dung dịch nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát Tiến hành định lượng theo quy trình đã nêu trên Kết quả tỷ lệ % tìm thấy được trình bày ở bảng 2.5 -26- Bảng 2.5: Khảo sát độ đủng của phương pháp STT Lượng thêm vào (mg) Tỷ lê tìm thấy ‘(%) 1 38,97 Lượng tìm thấy (mg) 38,89 2 46,23... ta dùng cồn sôi để chiết Rutin, dịch chiết đem cô đặc sau đó để nguội Rutin sẽ kết tủa, lọc lấy tủa thu được Rutin 1.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến thành phần hóa học của vị thuốc Nhiệt độ có thể làm thay đổi thành phần hóa học của vị thuốc, có thể làm tăng lên hay giảm xuống, có thể tạo điều kiện để biến đổi chất này thành chất khác ❖ Sự biến đỗi về hàm lượng - Ở mức nhiệt độ < 100°C: 1 số thành phần... % (w/w) Ảnh hưởng của thời gian sấy 100°c Ảnh hưởng của thời gian sấy 110°c 40 35 30 25 I b i 20 15 X 10 0 10 15 20 30 Thòi gian (phút) Thời gian (phút) a)Sẩyởl00°C b) Sấy ở 110°c Ảnh hưởng của thời gian sấy 120°c Ảnh hưởng của thời gian sấy 130°c H àm lượng % (w/w) 40 10 0 10 15 Thòi gian (phút) c) sấy ở 120 °c 20 30 Thời gian (phút) d) Sấy ở 130 ‘U Ảnh hưởng của thời gian sấy 140°c H àm lượng % (w/w)... nhau Nhiệt độ sấy (°C) Hàm lượng % (kl/kl) Rutin ở các MNC / Thời gian sấy (phút) 0 ’ 1 0 ’ 15' 2 0 ’ 30’ 1 0 0 26,51 25,89 25,98 25,89 1 1 0 25,96 26,33 25,42 25,81 25,34 26,17 26,47 25,95 130 26,64 26,00 26,53 26,65 140 26,49 26,86 25,56 25,72 1 2 0 28,78 Kết quả cho thấy ở tất cả các trường hợp (nhiệt độ sấy 100°c đến 140°C), hàm lượng của Rutin trong Hoè hoa đều giảm so với mẫu sống -31 - H àm lượng . học của một số vị thuốc thay đổi. Đe góp phần tìm hiểu ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng Rutin trong vị thuốc Hòe hoa chúng tôi thực hiện đề tài: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng. • KIÈU MAI DUNG KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT Độ ĐẾN HÀM LƯỢNG RUTIN TRONG HÒE HOA (KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP D ư ợ c s ĩ KHÓA 2< Người hướng dẫn: Th.s Nguyễn Đức Toàn Nơi thực hiện: Khoa Kiểm nghiệm. bảo quản, chế biến hàm lượng Rutin trong Hòe hoa thường có sự thay đổi. Một số công trình nghiên cứu gần đây đã thông báo ảnh hưởng của nhiệt độ đến thành phần hóa học, hàm lượng hoạt chất chính