Đang tải... (xem toàn văn)
Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương Xây dựng phương pháp định lượng amoxicilin và kali clavulanat trong huyết tương
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI ĐỖ LAN PHƯƠNG XÂY Dự^ỊG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AMOXICILLIN VÀ KALICLAVULANAT TRONG HUYÊT TƯƠNG KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược s ĩ ĐẠI HỌC KHOÁ 2000- 2005 Người hướng dẫn: PGS - TS. TRẦN t ủ a n Th.s. TRẦN NGUYÊN HÀ Nơi thực hiện: BỘ MÔN HOÁ PHÂN TÍCH TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI Thời gian thực hiện: 1/2005 - 5/2005 HÀ NÔI THÁNG 5 - 2005 V' ________^ ^ <■/ LỜI CẢM ƠN Trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS- TS Trần Tử An, Th.s . Trần Nguyên Hà, Th.s. Nguyễn Thị Kiều Anh là những người đã trực tiếp hướng dẫn, đã dành nhiều thời gian và tâm sức, kinh phí giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp. Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuậl viên Irong bộ môn Hoá Phân Tích - Trường đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá luận này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các cán bộ của phòng Vậl lý II, phòng Hoá lý II- Viện Kiểm Nghiệm đã giúp đỡ về hoá chất cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn thư viện Trường Đại học Dược Hà Nội đã cung cấp những tài liệu cần thiết cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và những người thân đã động viên và hết lòng giúp đỡ tôi hoàn thành khoá luận này. Hà Nội, tháng 5 năm 2005 Đỗ Lan Phương BẢNG CHỮ VIẾT TẮT Amox : Amoxicillin c : Nồng độ Clav : Kali clavulanat DAD : Diode array detector ESI : Electrospray ionization HPLC : Sắc ký lỏng hiệu năng cao MeCN : Acetonitril MeOH : Methanol MSD : Mass spectrometric detector NXB : Nhà xuất bản PA : Tinh khiết phân tích PL : Phụ lục s,. ; Diện tích STT : Số thứ tự TB : Trung bình THF : Tetrahydrofuran UV-VIS : Tử ngoại- khả kiến MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỂ 1 PHẦN 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Đại cương về amoxicillin trihydrat 3 1.1.1. Cấu trúc hoá học của amoxicillin trihydrat 3 1.1.2. Tính chất hoá lý 3 1.2. Đại cương về kali clavulanat 3 1.2.1. Cấu trúc hoá học của kali clavulanat 3 1.2.2. Tính chất hoá lý của kali clavulanat 4 1.3. Đại cương về dạng kết hợp amoxicillin và clavulanat 4 1.3.1. Dược lý và cơ chế tác dụng 4 1.3.2. Dược động học 5 1.3.3. Chỉ định 5 1.3.4. Chống chỉ định 6 1.3.5. Liều lượng 6 1.3.6. Dạng bào chế 6 1.4. Các phương pháp đã được áp dụng để định lượng amoxicillin và kali clavulanat trong huyết tương 7 1.4.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 7 1.4.2. Nhận xét và lựa chọn 10 1.5. Phương pháp HPLC . 10 1.5.1. Nguyên tắc phương pháp HPLC 10 1.5.2. Nguyên tắc cấu tạo của máy sắc ký HPLC 11 1.5.3. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc k ý 12 1.5.4. Pha tĩnh trong HPLC 14 1.5.5. Pha động trong HPLC 15 1.5.6. Cách đánh giá pic 16 1.5.7. Cách tính kết quả . 17 PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 18 2.1. Đối tượng, hoá chất, thiết b ị 18 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 18 2.1.2. Phương tiện, dụng cụ, hoá chất 18 2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1. Nghiên cứu, xây dựng qui trình kỹ thuật 19 2.2.2. Thẩm định phương pháp 20 2.2.3. Một số công thức tính toán trong xử lý thống kê kết quả 20 2.3. Kết quả thực nghiệm 20 2.3.1. Chiết amoxicillin và kali clavulanat trong huyết tương 20 2.3.2. Xác định điều kiện sắc ký định lượng amoxicillin và kali clavulanat trong huyết tương 23 2.3.3.Thẩm định phương pháp 24 2.3.4. Phân tích Amoxicillin và Kali clavulanat trong huyết tương người tình nguyện 30 2.4. Bàn luận 31 PHẦN 3: KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUÂT 33 3.1. Kết luận 33 3.2. Đề xuất 34 ĐẶT VÂN ĐỂ Song song với sự phát triển của khoa học kỹ thuật và ngành công nghệ dược phẩm, lĩnh vực phân tích phục vụ cho công tác đảm bảo chất lượng thuốc cũng không ngừng lớn mạnh. Phương pháp phân tích định lượng thuốc và các chất chuyển hoá trong dịch sinh học có vai trò quyết định trong đánh giá tương đương sinh học của thuốc nhằm đánh giá chất lượng thuốc nghiên cứu về mặt chất lượng, hiệu quả và an toàn phục vụ cho xét duyệt thuốc và khả năng thay thế các chế phẩm phát minh. Hiện nay ở Việt Nam chưa có văn bản chính thức đánh giá tương đương sinh học đối với các chế phẩm sản xuất trong nước, trong hồ sơ đăng ký thuốc chưa có yêu cầu cung cấp kết quả nghiên cứu về tương đương sinh học. Bên cạnh đó để ngành Dược Việt Nam phát triển và hội nhập với các nước trong khu vực và trên thế giới, thuốc sản xuất ở Việt Nam phải đạt chất lượng tốt để có thể xuất khẩu ra nước ngoài. Vì vậy triển khai nghiên cứu tương đương sinh học của thuốc có ý nghĩa về mặt khoa học và thực tế quản lý thuốc ở nước ta hiện nay. Chế phẩm thuốc kết hợp hai thành phần (amoxicillin và kali clavulanat) đã và đang được sử dụng phổ biến ở Việt Nam dưới nhiều dạng chế phẩm như viên nén, viên phân tán, viên nhai, bột pha tiêm hoặc truyền tĩnh mạch, bột pha dung dịch treo để uống. Để nghiên cứu chất lượng thuốc có kết hợp hai thành phần trên sản xuất ở Việt Nam cần phải có đánh giá so sánh với chế phẩm nhập ngoại, vì lý do đó chúng tôi chọn đề tài: “Xây dựng phưotig pháp định lượng amoxicillin và kali clavulanat trong huyết tương” Đề tài này nhằm mục tiêu: > Xây dựng qui trình kỹ thuật định lượng hai thành phần amoxicillin và kali clavulanat trong huyết tương phục vụ đánh giá tương đương sinh học của chế phẩm Vigentin 625mg do Xí nghiệp Dược phẩm Trung ương 1 sản xuất so với biệt dược nước ngoài Augmentin (GlaxoSmithKline) có cùng hoạt chất và dạng bào chế. Chúng tôi hi vọng rằng kết quả nghiên cứu này sẽ có giá trị thực tiễn cao, góp phần vào việc thúc đẩy ứng dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng các chất trong dịch sinh học nhằm phục vụ cho đánh giá tương đương sinh học của thuốc cũng như cá thể hoá điều trị. PH Ầ N l TỔNG QUAN 1.1. Đại cương về amoxicillin trihydrat 1.1.1. Cấu trúc hoá học của amoxicillin trihydrat [2], [9], [10], [18] . 3 H2O y ✓ / ✓ Ễ ^ boO H Công thức phân tử: C16HJ9N3O5S . 3H2O Phân tử lượng: 419,4. Tên khoa học : acid (6R) - 6 - (a- D- 4- Hydroxyphenyl glycylamino) penicilanic trihydrat. 1.1.2. Tính ch ấthoálý Là kháng sinh nhóm penicilin tồn tại dưới dạng bột kết tinh trắng hoặc gần như trắng. Khó tan trong nước và trong ethanol 96%, thực tế không tan trong chloroform, ether và các dầu béo. Tan được trong các dung dịch acid loãng và dung dịch hydroxyd kiềm loãng. Bảo quản trong lọ kín ở nhiệt độ không quá 30°c. 1.2. Đại cương về kali clavulanat 1.2.1. Cấu trúc hoá học của kali clavulanat [2], [9], [10], [18] H H o '(X JDH2OH -N _ ^ ^ H COOK Công thức phân tử: CgHgNOgK. Phân tử lượng: 237.3 Tên khoa học: Muối mono kali của 3-(2- hydroethyliden)-7-oxo-[2R(2a, 3z, 5a) - 4-oxa-]-aza bicyclo [3, 2 ,0 ] heptan - 2 - Carboxylic. 1.2.2. Tính chất hoá lý của kali clavulanat [10], [16], [17] Tồn tại dưới dạng tinh thể trắng, tan tốt trong nước, hơi tan trong alcohol, rất ít tan trong aceton. Kali clavulanat phản ứng với Imidazol theo phản ứng sau; .CH2OH J \ l C-CHFCH-N—CH2- C -C H 2CH2OH % , ỵ \ ỳ " 0 H 0 l-(8- hydroxy-6-oxo-4-azaoct-2-enoyl)- imidazol Bảo quản trong lọ kín ở nhiệt độ không quá 30°c. 1.3. Đại cương vê dạng kết hợp amoxicillin và clavulanat [3], [6], [8 ] 1.3.1. Dược lý và cơ chế tác dụng Amoxicillin là kháng sinh bán tổng hợp thuộc họ beta-lactamin có phổ diệt khuẩn rộng đối với nhiều vi khuẩn Gram dương và Gram âm do ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn. Nhưng vì amoxicillin rất dễ bị phá huỷ bởi beta-lactamase, do đó không có tác dụng với chủng vi khuẩn sản sinh ra các enzym này (nhiều chủng Entetobacterỉaceae Haemophilus influenzae). Acid clavulanic do sự lên men của Streptomyces clavulỉgerus, có cấu trúc beta-lactam gần giống với penicillin, có khả năng ức chế beta-lactamase do phần lớn các vi khuẩn Gram âm \à Staphylococcus sinh ra. Đặc biệt nó còn có tác dụng ức chế mạnh các beta-lactamase truyền qua plasmid gây kháng các penicillin và các cephalosporin. Pseudomonas aeruginosa, Proteus morganii và rettgeri, một số chủng Enterobacter và Providentia kháng thuốc, và cả tụ cầu methicilỉn cũng kháng thuốc nàj. Bản thân acid clavulanic cũng có tác dụng kháng khuẩn rất yếu. Acid clavulanic giúp cho amoxicillin không bị beta-lactamase phá huỷ, đồng thời mở rộng thêm phổ kháng khuẩn của amoxicillin một cách hiệu quả đối với nhiều vi khuẩn thông thường đã kháng lại amoxicillin, kháng các penicillin khác và cephalosporin. Có thể coi amoxicillin và clavulanat là thuốc diệt khuẩn đối với các Pneumococcus, cắc Streptococcus beta tan máu, Staphylococcus (chủng nhạy cảm với penicillin không bị ảnh hưởng của penicillinase), Haemophilus influenza, Branhamella catarrhalis kể cả những chủng sinh mạnh beta-lactamase. 1.3.2. Dược động học Amoxicillin và kali clavulanat đều hấp thụ dễ dàng qua đường uống. Nồng độ của hai chất này trong huyết thanh đạt tối đa sau 1-2 giờ uống thuốc. Với liều 500mg amoxicillin và 125mg kali clavulanat thì nồng độ thuốc tối đa trong huyết tương của amoxicillin là 8-9|ig/ ml và của kali clavulanat là khoảng 3|j,g/ ml. Thời gian bán thải của amoxicillin trong huyết thanh là 1-2 giờ và của kali clavulanat là khoảng 1 giờ. 13.3. Chỉ định Các chế phẩm amoxicillin + clavulanat được dùng để điều trị trong thời gian ngắn các trường hợp nhiễm khuẩn sau: +Nhiễm khuẩn nặng đường hô hấp trên: Viêm amidan, viêm xoang, viêm tai giữa đã được điều trị bằng các kháng sinh thông thường nhưng không đỡ. +Nhiễm đường hô hấp dưới bởi các chủng H.influenzae và Branhamella catarrbalis sản sinh beta-lactamase: Viêm phế quản cấp và mạn, viêm phổi- phế quản. [...]... dùng cho HPLC 2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Nghiên cứu, xáy dựng qui trình kỹ thuật > Tham khảo các phương pháp định lượng amoxicillin và kaliclavulanat đã được công bố > Tham khảo các phương pháp định lượng đồng thời amoxicillin và kali clavulanat trong huyết tương bằng phương pháp HPLC > Dựa vào cấu tạo nguyên tử, tính chất lý hoá học của amoxicillin và kali clavulanat cũng như các điều... hành xây dựng qui trình kĩ thuật định lượng đồng thời amoxicillin và kali clavulanat trong huyết tương bằng phương pháp HPLC > Bằng thực nghiệm nghiên cứu các điều kiện tiến hành để xây dựng phưcíng pháp ■ Khảo sát các qui trình chiết amoxicillin và kali clavulanat trong huyết tương để tìm ra phưoỉng pháp chiết tốt nhất: chiết được đồng thời cả hai chất trên với hiệu suất cao, loại được các tạp chất trong. .. trong huyết tưofng Để đánh giá sinh khả dụng của thuốc phải xác định được nồng độ của thuốc trong máu sau khi uống Do đó phương pháp lựa chọn phải có độ nhạy cao, đồng thời đáp ứng được độ chính xác và độ tin cậy của phương pháp định lượng và đặc biệt lý tưỏíng là phương pháp đó phải có khả năng tách tốt, xác định được đồng thời nồng độ của amoxicillin và kali clavulanat trong huyết tương 1.4.1 Phương pháp. .. thấy kali clavulanat được rửa giải ở 2.478 phút, pic cân đối độc lập Như vậy phương pháp được xây dựng trên rất chọn lọc cho phân tích amoxicillin và kali clavulanat trong huyết tương trong phân tích này 2.3.3.2 Xác định giới hạn định lượng và giói hạn phát hiện Giới han vhát hiên Chuẩn bị mẫu amoxicillin và kali clavulanat nồng độ nhỏ dần Xử lý mẫu theo hình 4 và tiến hành phân tích sắc ký Xác định. .. định lượng kali clavulanat trong huyết tương Nhận x é t : ■ Pic của amoxicillin và kali clavulanat trong huyết tương gọn, khá cân đối ■ Trên sắc ký đồ của mẫu huyết tương trắng không có pic tại vị trí pic của amoxicillin và kali clavulanat ■ Phương trình hồi qui biểu diễn sự phụ thuộc của diện tích pic - nồng độ có hệ số tương quan rất gần với 1 (r=0.9987 đối với amoxicillin và r= 0.9996 đối với kali. .. sóng 200 nm và 322 nm KÌ ■ Lưu lượng dòng; 2ml/ phút ■ Thể tích tiêm: 25|Lil ■ Nhiệt độ phòng 2.3.3.Thẩm định phương pháp Chúng tôi tiến hành đánh giá phương pháp định lượng amoxicillin và kali clavulanat trong huyết tương với các chỉ tiêu sau: 2.3.3.I Đánh giá tính chọn lọc của phương pháp Để khảo sát tính chọn lọc của phương pháp chúng tôi đã tiến hành như sau: + Mẫu 1: Lấy Iml huyết tương trắng... phân tích và điều kiện hiện có chúng tôi dùng sắc ký phân bố pha đảo Kết quả khảo sát tách và định lượng amoxicillin và kali clavulanat trong các cột sắc ký Cịg, Cg và cột phenyl cho thấy cột Cg là phù hợp, có khả năng tách chọn lọc amoxicillin và kali clavulanat ra khỏi mẫu phân tích, cho pic cân xứng trên sắc đồ > Pha động : Khảo sát định lượng amoxicillin và kali clavulanat trong huyết tương với... clavulanat trong huyết tương 1.4.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao Tham khảo phương pháp HPLC được sử dụng để định lượng amoxicillin và kali clavulanat trong huyết tương (bảng 1 ) và trang thiết bị hiện có, chúng tôi lựa chọn một chương trình HPLC phù hợp để phân tích định lượng amoxicillin và kali clavulanat trong huyết tương íi ìiiì| ịi||Ị|;b» i Tài lưựiig gian lưu (phút) (6) (7) Pha động tham (ml/phút)... Kết quả % A m oxicillin = %Kali clavulanat 251.78 60.08 100% = 98.25% 100% = 91 ÂA% Nhận xét: Với hiệu suất cao « 100% và độ lệch chuẩn tương đối