ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KIỀU PHƯƠNG NAM NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC TÍNH VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SPP. PHÂN LẬP Ở VÙNG ĐÔNG NAM BỘ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62 42 40 01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. BÙI VĂN LỆ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2010 Luận án Tiến sĩ Sinh học i 1MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH x TÓM TẮT 1 MỞ ĐẦU 2 1 Chương 1 - TỔNG QUAN 4 1.1 Chi vi khuẩn Methylobacterium 4 1.1.1 Lịch sử phát hiện và phân loại chi Methylobacterium 4 1.1.2 Đặc điểm sinh thái 5 1.1.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá 7 1.1.4 Phương pháp phân lập và định danh 11 1.1.5 Các loài vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium 12 1.1.6 Khoá phân loại chi Methylobacterium 13 1.1.7 Các đặc tính của vi khuẩn Methylobacterium spp. 16 1.2 Các cơ chế tương tác của vi khuẩn Methylobacterium spp. 26 1.2.1 Sinh tổng hợp các chất điều hòa tăng trưởng thực vật ở vi sinh vật và Methylobacterium spp. 29 1.2.2 Methylobacterium spp. và sự kiểm soát bệnh hại ở thực vật 35 1.3 Địa lý và điều kiện tự nhiên vùng Đông Nam Bộ 47 2 Chương 2 - VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP 48 Luận án Tiến sĩ Sinh học ii 2.1 Vật liệu 48 2.1.1 Nguồn phân lập 48 2.1.2 Chủng vi sinh vật 48 2.1.3 Hạt, giống thực vật 49 2.1.4 Môi trường 49 2.2 Phương pháp 51 2.2.1 Phân lập và định danh 51 2.2.2 Xác định đặc điểm sinh lý – sinh hóa của chủng phân lập 56 2.2.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn Methylobacterium radiotolerans 1019 lên sự tăng trưởng và phát sinh cơ quan ở thực vật 59 2.2.4 Sự sinh tổng hợp gibberellin, auxin và cytokinin 61 2.2.5 Vai trò của M. radiotolerans H2T trong việc hạn chế bệnh thối nhũn ở cây A. thaliana 65 2.2.6 Đặc tính làm gia tăng tỉ lệ nảy mầm của hạt giống 71 2.2.7 Tác dụng kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành của chủng Methylobacterium radiotolerans H2T 73 2.2.8 Xác định khả năng sinh tổng hợp poly-β-hydroxybutyrate (PHB) 76 3 Chương 3 - KẾT QUẢ, BIỆN LUẬN 84 3.1 Phân lập và định danh vi khuẩn Methylobacterium spp. 84 3.1.1 Phân lập 84 3.1.2 Định danh 84 3.1.3 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa của chủng phân lập 91 3.2 Nghiên cứu các đặc tính của các chủng phân lập được 96 3.2.1 Ảnh hưởng của vi khuẩn Methylobacterium radiotolerans 1019 lên sự tăng trưởng và phát sinh cơ quan ở thực vật 96 Luận án Tiến sĩ Sinh học iii 3.2.2 Sự sinh tổng hợp gibberellin, auxin và cytokinin 104 3.2.3 Vai trò của Methylobacterium radiotolerans H2T trong việc hạn chế bệnh thối nhũn ở cây Arabidopsis thaliana 111 3.3 Nghiên cứu định hướng các ứng dụng của các chủng Methylobacterium spp. phân lập 121 3.3.1 Đặc tính làm gia tăng tỉ lệ nảy mầm của hạt giống 121 3.3.2 Tác dụng kéo dài tuổi thọ hoa cắt cành của chủng M. radiotolerans H2T 126 3.3.3 Đặc điểm sinh tổng hợp poly-β-hydroxybutyrate (PHB) 131 3.4 Tóm tắt tổng kết các đặc điểm và khả năng ứng dụng của các chủng Methylobacterium spp. phân lập ở Vùng Đông Nam Bộ 142 4 Chương 4 - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 143 4.1 Kết luận 143 4.2 Đề nghị 144 CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN TỚI NỘI DUNG LUẬN ÁN 145 TÀI LIỆU THAM KHẢO 147 TIẾNG VIỆT 147 TIẾNG ANH 148 INTERNET 163 PHỤ LỤC 165 Luận án Tiến sĩ Sinh học v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Tiếng việt cfu: đơn vị hình thành khuẩn lạc CMS: môi trường MS bổ sung 2g/l cao thịt và casein DEPC – H 2 O: nước cất hai lần xử lý bằng DEPC ĐC: đối chứng LB: môi trường Luria – Bertani STN: sinh trắc nghiệm tRNA: RNA vận chuyển MMS: môi trường Methanol Mineral Salts MS: môi trường Murashige và Skoog, 1962 rDNA: gen mã hóa rRNA Tiếng Anh ABA : abscisic acid ACC deaminase: 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase AHL: N-acyl homoserine lactone BA: N 6 -Benzylaminopurine DNA: deoxyribonucleotide DNS: 3,5 dinitrosalicylic acid GA: gibberellic acid GUS: β-glucuronidase HPLC: High Performance Liquid Chromatography HR: hypersensitive response IAA: indole - 3- acetic acid IBA: indole -3- butyric acid ISR: induced systemic resistance NAA: -Naphthaleneacetic acid Luận án Tiến sĩ Sinh học vi OD: optical density PCR: Polymerase Chain Reaction PGPR: Plant Growth Promoting Rhizobacteria PPFM: Pink Pigmented Facultative Methylotroph PR: pathogenic-related protein PHB: poly-ß-Hydroxybutyrate (poly-beta-Hydroxybutyrate) Q-PCR: quantitative PCR QS: Quorum Sensing RNA: ribonucleic acid rRNA: RNA ribosome RT-PCR: reverse-transcription PCR SA: salicylic acid SAR: systemic acquired resistance UV: ultraviolet Zeatin: 4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenylaminopurine Luận án Tiến sĩ Sinh học vii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Danh mục các loài Methylobacterium spp. đã được đặt tên. Lựa chọn dựa trên công bố của các tạp chí trong ngân hàng NCBI 13 Bảng 1.2. Tóm tắt các đặc điểm của các chi vi khuẩn dinh dưỡng methyl (methylotrophic bacteria) 14 Bảng 1.3. Đặc điểm sử dụng carbon của các loài thuộc chi Methylobacterium 15 Bảng 1.4. Các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp IAA 30 Bảng 1.5. Các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp gibberellin 31 Bảng 1.6. Các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cytokinin 31 Bảng 1.7. Các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp abscisic acid 32 Bảng 1.8. Các vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp ethylene 32 Bảng 1.9. Một số AHL và hoạt động phụ thuộc vào mật độ quần thể được điều hòa bởi AHL 38 Bảng 2.1. Các loại môi trường sử dụng 60 Bảng 2.2. Thành phần của các dung dịch cắm hoa 76 Bảng 2.3. Các thông số cần được khảo sát trong nuôi cấy lỏng lắc 80 Bảng 2.4. Các thông số cần được khảo sát ở điều kiện nuôi cấy lỏng có lắc trong thí nghiệm 2.2.8.5 82 Bảng 3.1. Thông tin về các chủng phân lập được 84 Bảng 3.2. Sự tương đồng của các chủng mục tiêu và các trình tự đã công bố dựa trên kết quả Blast trong NCBI 85 Bảng 3.3. Một số đặc điểm hình thái, sinh lý của M. radiotolerans H2T, M. oryzae 1021b, M. zatmanii 6012 và M. komagatae TN10 92 Bảng 3.4. Đặc điểm sử dụng nguồn carbon của bốn chủng khảo sát và bốn chủng chuẩn của loài. 94 Bảng 3.5. Một số thử nghiệm sinh hoá khác 95 Luận án Tiến sĩ Sinh học viii Bảng 3.6. Ảnh hưởng của chủng vi khuẩn 1019 lên sự phát sinh chồi ở thuốc lá và Saintpaulia ionathna nuôi cấy in vitro 98 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của chủng 1019 lên sự hình thành mô sẹo ở cúc và thuốc lá 99 Bảng 3.8. Ảnh hưởng của chủng 1019 lên sự hình thành rễ ở cây hoa cúc và thuốc lá 100 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của vi khuẩn Methylobacterium radiotolerans 1019 lên sự tăng trưởng chồi và tạo rễ ở cây in vitro, sau 14 ngày nuôi cấy 102 Bảng 3.10. Tỉ lệ sống của cây thuốc lá, cà chua và cây hoa cúc sau 10 ngày đưa ra vườn ươm, và chiều cao trung bình của cây sau 21 ngày 103 Bảng 3.11. Kết quả phổ HPLC/MS của dịch chiết GA 3 từ M. radiotolerans H2T108 Bảng 3.12. Kết quả sinh trắc nghiệm 108 Bảng 3.13. Tốc độ nảy mầm của hạt lúa 109 Bảng 3.14. Sự thay đổi hoạt tính amylase. Đơn vị là UI, trong đó 1 đơn vị là lượng enzyme cần để giải phóng 1µM maltose từ tinh bột trong 1 phút, ở pH 6,9 ở 20 0 C 110 Bảng 3.15. Thông số tăng trưởng của lúa sau 14 ngày 110 Bảng 3.16. Kết quả phân tích mẫu AHL tách được từ vi khuẩn M. radiotolerans H2T cùng các chất chuẩn bằng phương pháp HPLC-MS 115 Bảng 3.17. Giá trị 2 ^ [ ct2( ct1)] của các gen kháng ở cây Arabidopsis thaliana Col0 khi lây nhiễm với Methylobacterium spp. 118 Bảng 3.18. Giá trị 2 ^ [ ct2( ct1)] của các gen kháng ở cây Arabidopsis thaliana Col0 và sid2 khi lây nhiễm với Methylobacterium spp. 48 giờ 120 Bảng 3.19. Tỉ lệ % nảy mầm và sức nảy mầm của các loại hạt thí nghiệm 122 Bảng 3.20. Mật độ tế bào sau khi bảo quản bằng phương pháp đông khô (tế bào/ml) 124 Bảng 3.21. Ảnh hưởng của M. radiotolerans H2T đến các chỉ tiêu cảm quan của hoa cẩm chướng cắt cành. 127 Luận án Tiến sĩ Sinh học ix Bảng 3.22. Hàm lượng chlorophyll, đường, protein, phytohormone của hoa cắt cành cắm trong dung dịch sinh khối vi khuẩn 127 Bảng 3.23. Ảnh hưởng của sự phối hợp giữa nồng độ đường, AgNO 3 35mg/l (A); và sinh khối vi khuẩn lên các chỉ tiêu theo dõi ở hoa cẩm chướng. 128 Bảng 3.24. Hàm lượng chlorophyll, đường, protein, phytohormone của hoa cắt cành cắm trong dung dịch có sự phối hợp giữa nồng độ sucrose 1,5%, AgNO 3 35mg/l và sinh khối vi khuẩn 129 Bảng 3.25. Ảnh hưởng của các dạng chế phẩm lên các chỉ tiêu cảm quan của hoa cẩm chướng 130 Bảng 3.26. Kết quả khảo sát môi trường và chủng vi khuẩn trong thu nhận PHB ở điều kiện nuôi cấy lỏng lắc 135 Bảng 3.27. Các thông số của quá trình nuôi cấy thu nhận PHB từ chủng M. radiotolerans H2T trên môi trường Med3 với các nồng độ methanol bổ sung ở các thời điểm khác nhau 138 Bảng 3.28. Tóm tắt về đặc tính của các chủng Methylobacterium spp. phân lập được ở vùng Đông Nam Bộ 142 Luận án Tiến sĩ Sinh học x DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Tế bào vi khuẩn Pseudomonas methanica và Vibrio extorquens 5 Hình 1.2. Methylobacterium spp. trên cây rêu (A), hình dạng tế bào vi khuẩn chụp qua kính hiển vi điện tử (B) 6 Hình 1.3. Methylobacterium spp. chủng BJ001 nuôi cấy trên môi trường thạch LB (A) và môi trường dịch thể LB (B) 7 Hình 1.4. Biến dưỡng hợp chất một carbon ở vi khuẩn Methylobacterium extorquens AM1 9 Hình 1.5. Cây phát sinh loài (dựa theo trình tự 16S rRNA) thể hiện các nhánh khác nhau của vi khuẩn nốt sần (rhizobia), 11 Hình 1.6. Nốt sần rễ cây C. perrottetii hình thành khi ủ chung với vi khuẩn 11 Hình 1.7. Khuẩn lạc của vi khuẩn Methylobacterium spp. phân lập 12 Hình 1.8. Sự tái sinh chồi của lá cây thuốc lá chuyển gen ipt trên môi trường MS không bổ sung hormone sau một tháng nuôi cấy 17 Hình 1.9. Sự hiện diện của dòng vi khuẩn PPFM (đã dòng hoá gen gfp) trên lá cây cỏ ba lá đỏ (A,B), rễ cây cỏ ba lá (C) và cây lúa mì (D) 18 Hình 1.10. P. deltoides _ nigra DN34 tái sinh từ mô nuôi cấy in vitro trên môi trường thạch MS 18 Hình 1.11. Sự phát triển của rêu Funaria hygrometrica trong điều kiện có vi khuẩn Methylobacterium spp. (+) và đối chứng (-) 20 Hình 1.12. Giả thuyết về cơ chế tương tác ở mức độ trao đổi các chất chuyển hóa giữa mô thực vật và vi khuẩn PPFM 22 Hình 1.13. Cấu trúc phân nhánh của tế bào Methylobacteium extorquens (A) và phân bố của PHB trong tế bào (B) 24 Hình 1.14. Các cơ chế kích thích sự tăng trưởng ở thực vật của Rhizobacteria 28 Hình 1.15. Tương tác quorum sensing 36 Hình 1.16. Hệ thống điều hòa sinh tổng hợp AHL ở vi khuẩn Garm âm 37 [...]... tới chi vi khuẩn này Vì thế, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu các đặc tính vi khuẩn Methylobacterium spp phân lập ở vùng Đông Nam Bộ nhằm đạt được các mục tiêu như sau: - Thu thập các chủng vi khuẩn Methylobacterium spp ở vùng Đông Nam Bộ, xác định tên và các đặc tính của chủng phân lập được nhằm tạo ra nguồn chủng vi khuẩn Methylobacterium spp phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo - Nghiên cứu những... để phân lập vi khuẩn Methylobacterium spp Ngoài 11 Tổng quan Luận án Tiến sĩ Sinh học ra, vi khuẩn Methylobacterium spp có sắc tố hồng đặc trưng nên rất dễ nhận diện trên môi trường phân lập (hình 1.7) [63] Hình 1.7 Khuẩn lạc của vi khuẩn Methylobacterium spp phân lập từ cỏ ba lá trên môi trường có methanol [174] Khoảng nhiệt độ thường được sử dụng để phân lập Methylobacterium spp là 25-30 0C Vi khuẩn. .. những đặc điểm về cơ chế tương tác với thực vật, tương tác với vi sinh vật gây bệnh cho thực vật và sự sinh tổng hợp các hợp chất có giá trị của các chủng phân lập được - Nghiên cứu phát triển các chế phẩm trên cơ sở nguồn chủng phân lập và các đặc tính được nghiên cứu Các kết quả của luận án sẽ là cơ sở khoa học cho vi c xây dựng, phát triển chế phẩm vi sinh vật từ vi khuẩn Methylobacterium spp. ,... dụng các hợp chất hữu cơ làm nguồn cung cấp carbon và năng lượng ở các loài vi khuẩn PPFM thuộc chi Methylobacterium rất đặc trưng Do vậy, có thể xác định loài vi khuẩn Methylobacterium spp căn cứ vào khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ của chủng vi khuẩn này (Bảng 1.2) [70] Những nghiên cứu phân tích DNA và rRNA cho thấy các loài vi khuẩn Methylobacterium spp có quan hệ họ hàng rất gần với các loài vi. .. Thông qua khảo sát các đặc tính của các chủng phân lập phát hiện những đặc tính mới được ghi nhận bao gồm: ảnh hưởng lên quá trình phát sinh cơ quan ở thực vật; Sinh tổng hợp chất điều hòa tăng trưởng thực vật, nhóm gibberellin; Cảm ứng hệ thống kháng tập nhiễm (SAR) ở cây thông qua phân tử AHL và con đường salicylic acid Trên cở sở đặc tính của các chủng, các định hướng nghiên cứu ứng dụng mới đã... thaliana Col0 khi lây nhiễm vi khuẩn Methylobacterium spp ở các thời điểm khác nhau 118 Đồ thị 3.8 Đồ thị biểu diễn sự biểu hiện các gen kháng ở dòng Aradidopsis thaliana Col0 và sid2 khi lây nhiễm vi khuẩn Methylobacterium spp ở các thời điểm 48 giờ sau khi lây nhiễm vi khuẩn 120 Đồ thị 3.9 Tỉ lệ nảy mầm của hạt đậu xanh trong các điều kiện bảo quản sinh khối vi khuẩn khác nhau ... các loài vi khuẩn PPFM vào chi Methylobacterium [35], [63] Từ năm 1992 đến nay, số lượng các loài Methylobacterium spp mới được phân lập và đặt tên gia tăng nhanh chóng một phần dựa trên sự phát triển của các phương pháp sinh học phân tử Tuy nhiên, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa vẫn là công cụ không thể bỏ qua [50], [106], [165], [171], [172] 1.1.2 Đặc điểm sinh thái Vi khuẩn Methylobacterium spp phân. .. nghiên cứu về hệ vi sinh vật trong nước và cân nhắc, chọn lọc các hệ vi sinh vật nhập nội Hiện tại, các nghiên cứu không chỉ tập trung vào khai thác hệ vi sinh vật vùng rễ mà hệ vi sinh vật vùng lá cũng được chú ý nhiều Hệ vi sinh vật vùng lá tuy không đa dạng và phong phú như hệ vi sinh vật vùng rễ nhưng chúng có những đặc điểm khiến chúng trở nên đặc biệt như khả năng sử dụng methanol, sinh tổng hợp các. .. phân lập lần đầu tiên ở Vi t Nam từ các nguồn mẫu lá cây, đất và nước ở các sinh cảnh đồng ruộng hay rừng tự nhiên trong vùng Đông Nam Bộ Thông qua phân tích trình tự gen mã hóa rRNA 16S xác định 16 chủng thuộc 4 loài khác nhau: M radiotolerans, M oryzae, M zatmanii và M komagatae Loài M radiotolerans (với 11 chủng phân lập) xuất hiện trên nhiều loại mẫu và ở nhiều khu vực trong vùng Đông Nam Bộ Thông... nhiều nghiên cứu tập trung vào tìm hiểu vai trò của các gen tham gia vào chu trình 8 Tổng quan Luận án Tiến sĩ Sinh học chuyển hoá các hợp chất một carbon, điều này sẽ giúp cho vi c sử dụng các loài vi khuẩn Methylobacterium spp một cách hữu ích nhất [41], [109] Hình 1.4 Biến dưỡng hợp chất một carbon ở vi khuẩn Methylobacterium extorquens AM1 Các gen đã biết được in nghiêng Để đơn giản hóa các phản