1 ĐẶT VẤN ĐỀ Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 (A/H1N1/09 đại dịch) được phát hiện lần đầu tiên vào đầu tháng 3 năm 2009 tại Mexico nhanh chóng lan rộng ra phạm vi toàn cầu và đã phát triển thành đại dịch cúm đầu tiên của thế kỷ 21. Theo số liệu thống kê của Tổ chức Y tế Thế Giới (TCYTTG), ngày 06/08/2010 đại dịch cúm đã lan rộng 214 quốc gia và gây tử vong cho 18.449 trường hợp. Việt Nam là nước thứ 54 trên thế giới thông báo các trường hợp nhiễm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 được ghi nhận đầu tiên vào ngày 31/5/2009. Dịch cúm bắt đầu lan rộng trong cộng đồng vào tháng 7/2009 và trong giai đoạn tháng 8 đến tháng 9/2009 có 85 – 95% tổng số các trường hợp nhiễm cúm tại Việt Nam là căn nguyên do vi rút cúm A(H1N1)pdm09. Theo thống kê của Bộ Y tế, tổng số 11.104 trường hợp nhiễm với 53 trường hợp tử vong báo cáo tại Việt Nam (28/12/2009). Tương tự các đại dịch cúm đã xảy ra ở giai đoạn trước, vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tiếp tục lưu hành và cùng với các vi rút cúm A/H3N2 và vi rút cúm B gây ra các dịch cúm mùa hàng năm. Trong giai đoạn 2010 – 2013, theo số liệu của chương trình giám sát cúm quốc gia (NISS) tại các điểm nghiên cứu vi rút cúm A(H1N1)pdm09 được ghi nhận với tỷ lệ là 46,6% (2009), giảm với tỷ lệ 28% (2010). Năm 2011, vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tiếp tục gây dịch với tỷ lệ 74,1%, rải rác năm 2012 và đạt 30% (2013). Kể từ khi xuất hiện đại dịch cúm năm 2009, những phân tích về di truyền học đã phát hiện một số thay đổi (đột biến) liên quan đến sự đa dạng của biểu hiện lâm sàng, độc lực và đáp ứng miễn dịch. Những sự thay đổi được ghi nhận như tăng tiến triển viêm phổi nặng, có thể gây tử vong liên quan đến sự thay đổi của axit amin tại vị trí 222 trên protein HA (D222/G/E/N), đột biến I129K tại khu vực thụ cảm thể bám trên gai HA sẽ làm tăng ái lực gắn bám của vi rút vào tế bào biểu mô đường hô hấp. Các đột biến I117V, I223R và H275Y trên protein NA là nguyên nhân của hiện tượng vi rút giảm độ nhạy hoặc kháng thuốc oseltamivir cũng được ghi nhận. Ngoài ra, một số thay đổi trên các protein NP, PA và PB2 đã ảnh hưởng tới độc tính của vi rút hoặc làm tăng khả năng nhân lên của vi rút trong tế bào chủ. Khả năng tiềm tàng của hiện tượng trao đổi và tích hợp (reassortment) của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 với các vi rút cúm A khác có thể sẽ tăng độc tính của vi rút hoặc nguy cơ tạo ra một vi rút cúm mới. Hiện tại, vắc xin phòng nhiễm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 là một trong vắc xin cúm mùa hàng năm và các thông tin về dịch tễ học, vi rút học vẫn được yêu cầu cập nhật thường xuyên trong hệ thống giám sát cúm toàn cầu (GISRS) của TCYTTG. Tại Việt Nam, vắc xin phòng chống cúm mùa đang được phát triển tại một số đơn vị sản xuất vắc xin và sử dụng các vi rút dự tuyển theo khuyến cáo của TCYTTG. Để chủ động trong công tác phòng chống cúm đồng thời góp phần vào chiến lược phát triển vắc xin cúm tại Việt Nam chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Một số đặc điểm vi rút học của vi rút cúm A/H1N1/09 đại dịch tại Việt Nam, 2009 – 2013” với các mục tiêu: 1. Phân tích đặc điểm di truyền học của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lưu hành tại Việt Nam giai đoạn 2009 – 2013. 2. Xác định đặc tính kháng nguyên của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09. 3. Đề xuất chủng vi rút dự tuyển vắc xin phòng cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam. 2 Những đóng góp mới của luận án: 1. Đây là công trình nghiên cứu khoa học thực hiện có hệ thống để xác định đặc điểm di truyền, đặc tính kháng nguyên và đề xuất chủng dự tuyển vắc xin cho vi rút lưu hành tại Việt Nam. 2. Chứng minh sự tương đồng về mặt di truyền và kháng nguyên giữa các vi rút lưu hành tại Việt Nam và các vi rút lưu hành tại các nước láng giềng trên thế giới trong giai đoạn nghiên cứu 2009 - 2013. 3. Phát hiện một số đột biến liên quan đến thay đổi kiểu hình: làm tăng tiến triển nặng của bệnh (đột biến vị trí D222N), giảm tương tác ngưng kết hồng cầu (đột biến vị trí G155E, N156K) trên protein HA và giảm độ nhạy với oseltamivir (H275Y) trên protein NA phát hiện trên một số vi rút A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu lưu hành tại Việt Nam. 4. Không phát hiện sự trao đổi và tích hợp giữa các phân đoạn gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 với các vi rút cúm A khác lưu hành trên người và động vật. 5. Lựa chọn đề xuất 2 chủng vi rút dự tuyển phát triển vắc xin cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam Bố cục luận án: Luận án dày 120 trang gồm: Đặt vấn đề 2 trang Chương I: Tổng quan 38 trang Chương II: Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 20 trang Chương III: Kết quả 34 trang Chương IV: Bàn luận 23 trang Kết luận 2 trang Kiến nghị 1 trang Luận án có 27 hình vẽ, 18 bảng và 1 sơ đồ. Trong 127 tài liệu tham khảo có 6 tài liệu Tiếng Việt và 121 tài liệu Tiếng Anh. CHƢƠNG I – TỔNG QUAN 1.1. Vi rút cúm 1.1.1. Đặc điểm vi rút học Vi rút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, bao gồm 5 nhóm vi rút: vi rút cúm A, vi rút cúm B, vi rút cúm C, vi rút Thogoto và vi rút Isa. Vi rút cúm A được chia thành các phân týp dựa vào cấu trúc kháng nguyên bề mặt là HA (H1–H17) và NA (N1- N9). Vi rút cúm B ít có sự thay đổi về kháng nguyên bề mặt. Bộ gen của vi rút cúm A, B gồm 8 phân đoạn và vi rút cúm C là 7 phân đoạn ARN sợi đơn âm. Mỗi phân đoạn mã hoá cho 1 hoặc 2 protein cấu trúc hoặc không cấu trúc: (7 protein cấu trúc: PB1, PB2, PA, HA, NA, NP và M1 và 3 protein không cấu trúc - nonstructureral protein: NS1, NS2 và M2 đối với vi rút cúm A và NB đối với vi rút cúm B - chỉ thấy ở tế bào nhiễm vi rút). Protein HA gây ngưng kết hồng cầu, có vai trò quyết định trong việc gắn vi rút vào tế bào chủ, protein NA có chức năng phá vỡ liên kết giữa vi rút và tế bào chủ để giải phóng vi rút ra khỏi tế bào nhiễm. Heamaglutinin (HA): Heamaglutinin là protein trên bề mặt của vi rút được mã hóa bởi đoạn RNA số 4 có chức năng bám vào thụ thể trên bề mặt tế bào chủ và khởi đầu sự xâm nhập của vi rút cúm vào cơ thể. Trên bề mặt tế bào người, HA gắn vào 3 thụ thể α 2,6 axit sialic; trên tế bào gia cầm, HA gắn vào thụ thể α 2,3 axit sialic; trên tế bào của lợn có mang cả hai loại thụ thể . Neuraminidase (NA): Protein bề mặt thứ hai có chức năng là một enzyme neuraminidase, được mã hóa bởi phân đoạn gen thứ 6. NA xúc tác cho quá trình cắt đứt mối liên kết α 2,3 hoặc α 2,6 ketosidic phá hủy thụ thể HA trên bề mặt tế bào, tạo điều kiện cho sự giải phóng vi rút mới ra khỏi tế bào chủ. 1.1.2. Quá trình nhân lên của vi rút cúm A Vi rút cúm A nhân lên qua bốn giai đoạn: (1) gắn màng và xâm nhập vào tế bào chủ, (2) phiên mã và sao chép genom vi rút, (3) giải phóng vRNP ra khỏi nhân và (4) quá trình đóng gói, nảy chồi và giải phóng vi rút thế hệ mới. Vi rút cúm bám vào tế bào biểu mô đường hô hấp bằng cách dùng heamoglutinin gắn vào phần axit sialic của glucoprotein và glucolipid trên bề mặt tế bào (α 2,3 hoặc α 2,6 axit sialic). Vi rút tiến vào tế bào chủ bằng quá trình thực bào. Sự hoạt động của protein M2 chấm dứt tình trạng pH thấp trong thể thực bào, phá vỡ vỏ giải phóng RNP vào tế bào chất của tế bào chủ. RNA của vi rút cúm được tổng hợp và nhân lên tại nhân tế bào, các RNP và M1 liên kết các thành phần lại để tạo nên hạt vi rút. Hạt vi rút nảy chồi ra phía ngoài màng tế bào chủ rồi được tách ra khỏi tế bào nhờ hoạt động của enzyme neuraminidase. 1.2. Đại dịch cúm A/H1N1/09 1.2.1. Tình hình cúm A(H1N1)pdm09 trên thế giới Tại Mexico: Cuối tháng 3 năm 2009 các nhà khoa học ghi nhận sự tăng đột biến các trường hợp nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính có liên quan đến cúm tại Veracruz, Mexico và được Trung tâm kiểm soát bệnh dịch Hoa Kỳ xác định là vi rút cúm A có nguồn gốc từ lợn phân týp H1N1. Ngày 17/4/2009 Bộ Y tế Mexico cảnh báo đại dịch cúm A/H1N1/09 tiếp diễn tại Mexico được ghi nhận đến tháng 12/2009 với 3 làn sóng dịch với tổng số mắc được khẳng định bằng chẩn đoán PTN là 27.440 trường hợp. Tại Mỹ: Hình 1.1 Biểu đồ dịch tễ học cúm A(H1N1)pdm09 trên toàn cầu khởi phát Mỹ từ 28/3 - 5/5/2009 (Nguồn:http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa0903810) 1- 15/4: CDC xác nhận trường hợp đầu tiên. 2-17/4: CDC xác nhận bệnh nhân thứ 2, báo cáo Chính phủ và TCYTTG 3- 23/4: CDC đưa những thông tin đầu tiên liên quan đến dịch 4 4- 25/4: TCYTTG thông báo về nguy cơ bùng phát dịch trên toàn cầu 5- 26/4: TCYTTG xác định mức cảnh báo đại dịch tại mức độ 3. 6- 26/4: Mỹ tuyên bố tình trạng khẩn cấp về sức khỏe cộng đồng 7- 27/4: TCYTTG tăng mức cảnh báo đại dịch lên mức độ 4 8- 29/4 : TCYTTG tăng mức cảnh báo đại dịch lên mức độ 5 9- 11/6 : TCYTTG tăng mức cảnh báo đại dịch lên mức độ 6 Đến ngày 31/5/2009 có 22 quốc gia của châu Mỹ thông báo có sự xuất hiện của cúm mới A(H1N1)pdm09 với tổng số mắc là 16.018 người và 115 trường hợp tử vong. Trong năm 2009 - 2010, một số nước đã chứng kiến làn sóng thứ 2 và thứ 3 của đại dịch này trước khi đại dịch thoái lui. Đến ngày 10 tháng 8 năm 2010, TCYTTG chính thức công bố đại dịch cúm A/H1N1/09 này đã chuyển sang giai đoạn hậu đại dịch. 1.2.2. Tình hình đại dịch cúm A/H1N1/09 tại Việt Nam Việt Nam là nước thứ 54 thông báo các trường hợp nhiễm cúm A(H1N1)pdm09, sau đó liên tục phát hiện các ca bệnh mới nhập cảnh từ Mỹ, Hàn Quốc có tiền sử tiếp xúc gần với bệnh nhân trước đó và xuất hiện các chùm ca bệnh trên diện rộng. Giữa tháng 7/2009 dịch bắt đầu có dấu hiệu lan ra cộng đồng, tăng số người mắc tại các nơi tập trung đông người như trường học, cơ quan công sở và nơi công cộng. Ngày 3 tháng 8 năm 2009 ghi nhận ca tử vong đầu tiên do cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam. Đến tháng 6 năm 2011, cả nước ghi nhận 66 trường hợp tử vong, tuy nhiên số ca bệnh ghi nhận được trên thực tế có thể sẽ cao hơn nhiều lần, tính từ đầu vụ dịch cho đến trung tuần tháng 9/2009, tỷ lệ chết/mắc do cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam là 0,17%. 1.2.3. Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 Hình 1.2 Cấu trúc bộ gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 Nguồn: www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19525932 Vi rút A(H1N1)pdm09 là vi rút cúm có trao đổi và tích hợp bậc 4; 3 phân đoạn gen (HA, NP và NS) tương tự với vi rút cúm lưu hành trên lợn năm 1998 tại Bắc Mỹ; 2 phân đoạn gen (PA và PB2) giống cúm chim, lợn tại Bắc Mỹ; phân đoạn PB1 tương tự vi rút cúm A/H3N2 lưu hành trên người và phân đoạn gen NA và M rất giống gen của vi rút cúm lưu hành trên lợn tại châu Âu-Á (H1N1 và H3N2). Sự tham 5 gia của các gen M và NA từ các dòng vi rút cúm lợn Á-Âu đã tạo ra một phân týp vi rút cúm A hoàn toàn mới, thể hiện sự trao đổi giữa các loài và đã đáp ứng đầy đủ về vi rút học trong cơ chế gây đại dịch cúm ở người. Tuy nhiên vi rút cúm này vẫn có xuất phát điểm là sự tiến hóa của vi rút cúm đại dịch A/H1N1/1918 1.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán vi rút cúm A(H1N1)pdm09 phòng thí nghiệm. 1.3.1. Phân lập vi rút Phân lập vi rút được coi là “tiêu chuẩn vàng” trong giám sát cúm. Hiện nay, có 2 hệ thống phân lập được TCYTTG khuyến cáo là phân lập trên trứng gà đạt tiêu chuẩn (Specific Pathogenic Free - SPF) 10-11 ngày tuổi và trên dòng tế bào thường trực thận chó (Mardin - Darby canine kidney cells - MDCK). Vi rút sau khi phân lập được xác định đặc tính kháng nguyên bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI). 1.3.2. Phương pháp phát hiện vật liệu di truyền - Phương pháp RT-PCR: có khả năng xác định nhanh sự nhiễm vi rút thông qua xác định vật liệu di truyền của vi rút bằng khả năng phát hiện đoạn ARN đặc hiệu của vi rút cúm trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng. - Phương pháp Real time RT-PCR: được ứng dụng để định lượng ADN, ARN, chẩn đoán các vi rút gây bệnh như vi rút cúm A/H5N1, A/H1N1/09 đại dịch… - Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng phiên mã ngược (RT- LAMP): khuếch đại ADN trong điều kiện đẳng nhiệt, thời gian tiến hành phản ứng ngắn. - Phương pháp xác định trình tự gen (Sequence): xác định đặc điểm di truyền học, xây dựng cây gia hệ trên cơ sở so sánh gen HA, NA và M của vi rút cúm, từ đó xác định tần suất tiến hóa, các đột biến trên một số gen liên quan đến khả năng tăng độc lực của vi rút, giảm độ nhạy của thuốc kháng vi rút cũng như phát hiện các yếu tố tiềm tàng của sự trao đổi và tích hợp của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đang lưu hành. 1.3.3. Phương pháp phát hiện kháng thể - Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination Inhibition test - HI): xác định kháng thể kháng HA đặc hiệu vi rút cúm (anti heamagglutinin) khi kết hợp với kháng nguyên chuẩn (A/H1, A/H3, A/H5, B…) - Phản ứng trung hoà vi lượng (Microneutralization test - MN): phát hiện kháng thể kháng đặc hiệu vi rút cúm A/H5N1 và kháng thể kháng các phân týp vi rút cúm gia cầm khác mà phản ứng HI không có khả năng phát hiện được. 1.4. Vắc xin 1.4.1. Các loại vắc xin cúm Vắc xin cúm mùa (A/H3N2, A/H1N1 và B) hiện tại có nhiều loại khác nhau: vắc xin bất hoạt (inactivated vaccine), vắc xin sống giảm độc lực (Live attenuated influenza virus - LAIV) và vắc xin bất hoạt bằng công nghệ di truyền ngược (reassortment vaccine). Hiện tại, vắc xin cúm mùa đang dùng phổ biến là vắc xin bất hoạt, đa giá (thành phần vắc xin bao gồm vi rút cúm A/H1N1, A/H3N2 và B). Vắc xin cúm A(H1N1)pdm09: Vi rút dự tuyển cho vắc xin cúm A(H1N1)pdm09 đầu tiên (IDCDC-RG15) được TCYTTG thông báo vào ngày 6 27/5/2009 phát triển tại PTN chuẩn thức CDC- Atlanta, Mỹ, đó là một vi rút được tạo bằng công nghệ di truyền ngược (reassortant virus) từ vi rút A/Texas/5/2009. Tháng 10/2009 vi rút cúm A/California/07/09 được giới thiệu là vi rút dự tuyển cho sản xuất vắc xin cúm theo công nghệ vắc xin bất hoạt thông dụng và các sinh phẩm kiểm chuẩn (kháng huyết thanh chuẩn), được cung cấp tại các PTN chuẩn thức của TCYTTG cho các công ty, viện vắc xin được sẵn sàng vào tháng 11/2009. 1.4.2. Lựa chọn chủng vi rút dự tuyển vắc xin Hàng năm, vắc xin cúm mùa đều phải cập nhật để thành phần vi rút trong vắc xin tương thích với vi rút cúm lưu hành và gây bệnh trên phạm vi toàn cầu. Theo khuyến cáo hàng năm của TCYTTG về chủng vi rút cúm dự tuyển cho thành phần vắc xin cúm cho mùa dịch sắp tới tại khu vực Bắc bán cầu hoặc Nam bán cầu, các công ty sản xuất vắc xin sẽ nhận được các thông tin về đặc điểm vi rút cúm lưu hành thu thập từ các trung tâm giám sát cúm gần nhất và các thông tin về các sinh phẩm liên quan để đánh giá chất lượng vắc xin tại các PTN chuẩn thức của TCYTTG. Quá trình bắt đầu sản xuất đến khi lưu hành vắc xin cúm sẽ được thực hiện trong 6 tháng (tháng 3 đến tháng 9 hàng năm cho khu vực Bắc bán cầu, tháng 9 đến tháng 3 năm sau cho khu vực Nam bán cầu). CHƢƠNG II - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 phân lập được tại Trung tâm Cúm Quốc gia, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương từ mẫu bệnh phẩm bệnh nhân có hội chứng cúm (sốt trên 38 0 C, ho và/hoặc đau họng) giai đoạn 2009-2013 từ đề tài nhánh cấp nhà nước (2009-2011) và chương trình Giám sát Cúm quốc gia phối hợp với Cơ quan Kiểm soát bệnh tật Hoa Kỳ - CDC/US (2006-2012). 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu Cỡ mẫu: Nghiên cứu mô tả và tiến cứu với 75 chủng vi rút được lựa chọn để đảm bảo tính đại diện cho vụ dịch theo địa điểm (miền Bắc, Trung và Tây Nguyên) và thời gian xảy ra dịch (2009-2013). Chủng cúm A(H1N1)pdm09 đạt hiệu giá HA ≥ 8 sau 72-96 giờ khuếch đại trên tế bào MDCK. Bảng 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Năm Địa điểm thu thập Số vi rút Miền Bắc Miền Trung Tây Nguyên 2009 6 4 4 14 2010 14 5 0 19 2011 2 2 3 7 2012 2 1 1 4 2013 24 5 2 31 Tổng 48 17 10 75 Kỹ thuật xét nghiệm: Phân lập và khuếch đại vi rút, phân tích đặc điểm di truyền bằng kỹ thuật giải trình tự gen (Sanger sequence) và xác định đặc tính kháng nguyên bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu (HI). 7 Sinh phẩm: Tế bào MDCK (CDC)/ trứng phân lập vi rút cúm; Giải trình tự gen sử dụng bộ kit của hãng ABI, Mỹ, mồi được cung cấp bởi CDC; xác định đặc tính kháng nguyên bằng kháng huyết thanh chuẩn (reference antisera) trong bộ sinh phẩm của TCYYTG cung cấp hàng năm. Phân tích số liệu: Trình tự nucleotide phân đoạn gen mã hóa của các vi rút sau khi được giải trình tự được phân tích sự tương đồng và các điểm đột biến liên quan đến thay đổi kiểu hình bởi phần mềm DNASTAR, Winscosin, USA và Bioedit phiên bản 7.2.3; cây gia hệ 6 phân đoạn gen được xây dựng bằng phần mềm MEGA5 sử dụng phương pháp Maximum Likelihood. Các trình tự phân đoạn gen tham chiếu được thu thập từ ngân hàng dữ liệu DNA (www.ncbi.com). Đặc tính kháng nguyên của vi rút được xác định tại kháng huyết thanh chuẩn cho hiệu giá ngăn ngưng kết hồng cầu cao nhất. Vi rút được lựa chọn để phát triển vắc xin phải đảm bảo: đại diện cho đa phần các chủng lưu hành tại Việt Nam về di truyền cũng như đặc tính kháng nguyên; có khả năng khuếch đại tốt trên các hệ thống nuôi (tế bào hoặc trứng) và có tính ổn định về di truyền và đặc tính kháng nguyên. 2.3. Vấn đề Y đức trong nghiên cứu Nghiên cứu là một nhánh của đề tài nghiên cứu cấp nhà nước (Mã số ĐTĐL 2009G/55) và chương trình giám sát cúm quốc gia giai đoạn 2009-2011 tại khu vực miền Bắc Việt Nam, phối hợp với Cơ quan phòng chống bệnh tật Mỹ (CDC-US) giai đoạn 2006-2012. Vì vậy Y đức trong nghiên cứu đã được phê duyệt bởi Hội đồng Y đức - Bộ Y tế và Trung tâm kiểm soát và phòng chống bệnh tật Mỹ (CDC-US). CHƢƠNG III - KẾT QUẢ 3.1. Lựa chọn chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu 75 chủng vi rút nghiên cứu được phân lập và khuếch đại trên dòng tế bào MDCK với hiệu giá HA ≥ 8 từ mẫu bệnh phẩm dịch họng dương tính với vi rút cúm A(H1N1)pdm09 bằng phương pháp RT-PCR hoặc Realtime PCR. Bảng 3.1 Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên cứu Năm Số vi rút (n) Tỷ lệ (%) 2009 14 18,7 2010 19 25,3 2011 7 9,3 2012 4 5,3 2013 31 41,4 Tổng 75 100 Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 được thu thập trong nghiên cứu đại diện trong các năm, nhiều nhất năm 2013 (31 vi rút), tiếp đến năm 2010 (19 vi rút), 2009 (14 vi rút), các năm 2011 (7 vi rút) và 2012 (4 vi rút). Các vi rút sử dụng trong nghiên cứu được thu thập từ năm 2009 - 2013 tại một số tỉnh miền Bắc, miền Trung và Tây nguyên. 8 3.2. Kết quả phân tách, khuếch đại và giải trình tự 6 phân đoạn gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 Do cấu trúc hệ gen của vi rút cúm gồm 8 phân đoạn với kích cỡ và cấu trúc khác nhau nên khả năng thành công khi tổng hợp từng phân đoạn bằng phản ứng PCR sẽ thay đổi theo từng phân đoạn. Sử dụng các cặp mồi đặc hiệu thiết kế cho phân tách (tách biệt) các phân đoạn gen độc lập của vi rút cúm A kết hợp với DNA polymerase Hifi có khả năng khuếch đại và hiệu chuẩn sản phẩm PCR với kích cỡ lớn, các phân đoạn gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 được phân tách và khuếch đại với độ đặc hiệu, chính xác cao. Bảng 3.2 Kết quả tổng hợp 6 phân đoạn gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 bằng phản ứng PCR Phân đoạn gen Độ dài thu đƣợc (bp) Số vi rút (n) Tổng (N=75) Tỷ lệ (%) 2009 2010 2011 2012 2013 HA 1778 14 19 7 4 31 75 100 NA 1413 6 16 4 2 24 52 69,3 M 1027 12 18 3 4 13 50 66,7 NS 890 8 18 3 4 14 47 62,7 PB1 2299 3 14 3 4 12 36 48 PB2 2185 7 18 3 4 13 45 60 Trong tổng số 75 chủng vi rút cúm phân lập đạt hiệu giá HA ≥ 8 đều thành công trong việc phân tách và khuếch đại phân đoạn gen HA đạt tỷ lệ 100%, trong khi phân đoạn gen NA thu được 52/75 vi rút (69,3%), các phân đoạn gen M thu được 50/75 (66,7%), NS 47/75 (62,7)% và PB2 45/75 (60%) và phân đoạn gen PB1 thu được từ 36/75 (48%). 3.2.1. Đặc điểm di truyền phân đoạn gen HA *Cây gia hệ phân đoạn gen HA: được xây dựng với vi rút gốc là A/California/07/09 và 75 chủng vi rút với phân đoạn gen HA có độ dài 1778 nucleotide sử dụng trong nghiên cứu cùng với các vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lưu hành tại các nước láng giềng trong cùng giai đoạn (Thái Lan, Trung Quốc…). Cho đến hiện tại, các vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trên thế giới được nhóm thành 7 nhóm chính (nhóm 1 đến 7), trong đó nhóm 6 được tách thành các phân nhóm 6A; 6B và 6C. Các vi rút tập trung trong từng nhóm hoặc phân nhóm đều có độ tương đồng về trình tự nucleotide của gen HA từ 99,7% (nhóm) hoặc 99,9% (phân nhóm) với độ lặp lại (boostrap) 1000 lần trong quá trình so sánh trình tự giữa các vi rút. Kết hợp với phân tích sự tương đồng trên các vi rút lưu hành trong khu vực và trên thế giới, các vi rút sử dụng trong nghiên cứu được tập hợp trong nhóm/phân nhóm của cây gia hệ như sau (Hình 3.1): - Nhóm 1: gồm 1 vi rút phân lập năm 2009 - Nhóm 2: 2 vi rút phân lập năm 2009, 2 vi rút phân lập năm 2010 - Nhóm 3: 3 vi rút phân lập năm 2009 và 8 vi rút phân lập năm 2010. - Nhóm 4: 8 vi rút còn lại phân lập năm 2009. - Nhóm 5: 9 vi rút còn lại phân lập năm 2010 - Phân nhóm 6A: 7 vi rút phân lập năm 2013. - Phân nhóm 6B: không có vi rút nào xuất hiện trong nghiên cứu 9 - Phân nhóm 6C: là phân nhóm lớn gồm 23 vi rút phân lập (2013) và 1 vi rút phân lập năm 2011 - Nhóm 7: 6 vi rút phân lập (2011), 4 vi rút (2012) và 1 vi rút (2013). *Protein HA: Kết quả phân tích protein HA của 75 chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên cứu cho thấy sự thay đổi axit amin trong từng nhóm, phân nhóm so với vi rút gốc A/California/07/09 (bảng 3.3) cho thấy: nhóm 1 có 2 axit amin thay đổi đó là (P83S, I321V), nhóm 2 có 3 axit amin thay đổi (P83S, I321V và S203T); nhóm 3 và nhóm 5 có 5 axit amin thay đổi; nhóm 4 có 4 axit amin thay đổi, phân nhóm 6A có 11 axit amin thay đổi; phân nhóm 6C có 16 axit amin thay đổi và nhóm 7 có 12 axit amin thay đổi. Tần xuất thay đổi (đột biến) của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lưu hành tại Việt Nam so với vi rút gốc A/California/07/09 được ghi nhận tại một số vị trí axit amin số 83 thay đổi từ Proline thành Serine (P83S) và Isoleucine thành Valine tại axit amin số 321 (I321V) xuất hiện trong toàn bộ 75 chủng vi rút (100%) sử dụng trong nghiên cứu. Tiếp theo thay đổi S203T được xác định trong hầu hết các nhóm/phân nhóm từ 2-7 với tần suất 87,5%, các thay đổi R223Q, E374K cũng xuất hiện với tần suất đạt 50% và D97N, S451N được xác định trong 3 nhóm/phân nhóm (37,5%). Các thay đổi (đột biến) khác xuất hiện đơn lẻ tại 1-2 nhóm/phân nhóm (bảng 3.3). Bảng 3.3 Sự thay đổi (đột biến) axit amin trên protein HA Nhóm 2009 2010 2011 2012 2013 Axit amin thay đổi so với vi rút A/California/07/09 1 1 P83S, I321V 2 2 2 P83S, I321V, S203T 3 3 8 P83S, I321V, S203T, S84N, I116M 4 8 P83S, I321V, S203T, R223Q. 5 9 P83S, I321V, S203T, R259K, E347K 6A 7 P83S, I321V, S203T, R223Q, D97N, N38D, H138R, S185T , V249L, E374K, S451N 6C 1 23 P83S, I321V, S203T, R223Q, D97N, G155E, N156K, S185T, I216M, D222N, V234I, T241I, K283E, E374K, S451N, E499K 7 6 4 1 P83S, I321V, S203T, R223Q, D97N, S143G, S185T, A197T, N260D, E374K, S451N, E499K Tổng 14 19 7 4 31 75 Vi rút 10 Hình 3.1 Cây gia hệ HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam, 2009-2013. Hình 3.2 Cây gia hệ NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam, 2009-2013. 2013 2012 2011 2010 2009 2013 2012 2011 2010 2009 [...]... tiếp sau đại dịch (từ 2011 đến 2013) đã cho thấy vi rút cúm A(H1N1)pdm09 hoàn toàn chuyển đổi phương thức lây truyền của vi rút cúm gây đại dịch thành vi rút cúm mùa và các đặc điểm vi rút học cũng sẽ tiến hóa theo kiểu vi rút cúm mùa Vì vậy, vi c theo dõi, giám sát sự thay đổi về đặc điểm di truyền, đặc tính kháng nguyên và một số biểu hiện gây bệnh liên quan của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sẽ là một nhiệm... các vi rút sử dụng nghiên cứu được tập trung trong 5 nhóm/phân nhóm (Hình 3.4) 2013 2013 2012 2012 2011 2011 2010 2010 2009 2009 Hình 3.3 Cây gia hệ M của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tại Vi t Nam, 2009- 2013 Hình 3.4 Cây gia hệ NS của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tại Vi t Nam, 2009- 2013 *Cây gia hệ phân đoạn gen PB1 (Polymerasse): được xây dựng dựa trên 36 chủng vi rút phân lập trong nghiên cứu và một số vi rút. .. vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong giai đoạn 2009- 2013 4.6 Đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lƣu hành tại Vi t Nam, 2009- 2013 Hiệu giá HI của 70/75 vi rút (chiếm 93,3%) tương đương với hiệu giá của của A/California/07/09 (HI = 640-1280) có thể nhận định rằng chưa có sự thay đổi đặc tính kháng nguyên trong hầu hết các vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lưu hành tại Vi t Nam trong giai đoạn 2009- 2013. .. gồm 3 vi rút phân lập năm 2009 và 4 vi rút phân lập năm 2010 - Nhóm 3: gồm 3 vi rút phân lập năm 2009 và 12 vi rút phân lập năm 2010 - Nhóm 5: gồm 5 vi rút phân lập năm 2013 - Phân nhóm 6B: gồm 5 vi rút phân lập năm 2013 - Phân nhóm 6C: gồm 10 vi rút phân lập năm 2013 - Phân nhóm 7A: gồm 3 vi rút phân lập (2011); 1 vi rút (2012) và 1 vi rút (2013) - Phân nhóm 7B: 1 vi rút phân lập (2011); 1 vi rút (2012)... đến kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm Sử dụng kết quả thực hiện thử nghiệm ức chế neuraminidase đánh giá khả năng ức chế 50% số vi rút cúm của oseltamivir đã được thực hiện năm 2013 tại PTN Trung tâm Cúm Quốc gia - Vi n Vệ sinh Dịch tễ TƯ, vi rút cúm A/Vietnam/IS0213167 /2013 mang giá trị IC50 125,02 thể hiện sự giảm mạnh độ nhạy cảm của vi rút với oseltamivir (số liệu PTN Cúm cung cấp) 16 3.5 Lựa... tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu 3 Lựa chọn và đề xuất vi rút dự tuyển phát triển vắc xin cúm A(H1N1)pdm09 tại Vi t Nam Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 dự tuyển cho phát triển vắc xin tại Vi t Nam lần đầu tiên được đề xuất dựa trên các phân tích về đặc điểm di truyền và đặc tính kháng nguyên trên cơ sở các vi rút A(H1N1)pdm09 lưu hành tại Vi t nam đáp ứng đầy đủ 3 tiêu chí của TCYTTG:... 2012 2011 2011 2010 2010 2009 2009 Hình 3.5 Cây gia hệ PB1 của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tại Vi t Nam, 2009- 2013 Hình 3.6 Cây gia hệ PB2 của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tại Vi t Nam, 2009- 2013 *Các protein M, NS, PB1 và PB2: Sự tương đồng về axit amin của các protein M1; M2; NS1; NS2; PB1; PB2 so với vi rút vắc xin A/California/07/09 đạt từ 99,2% (protein NS1) đến 99,9% (protein M2) Số axit amin thay đổi được... cũng được phát hiện trên 1 vi rút phân lập năm 2013 Hiện tượng giảm độ nhạy hoặc kháng oseltamivir của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 với đột biến tại H275Y được ghi nhận lần đầu tại Vi t Nam vào tháng 7 /2009 và tiếp tục xuất hiện trong một số vi rút lưu hành vào các năm 20092 012 Kết quả nghiên cứu của chúng tôi bổ sung thêm dữ liệu về đột biến H275Y của vi rút A(H1N1)pdm09 trong năm 2013 dẫn đến tình trạng... M5) Vì vậy có 2 chủng vi rút A/Vietnam/HN36947 và A/Vietnam/NH13284 trong nghiên cứu có khả năng sử dụng là vi rút dự tuyển cho phát triển vắc xin cúm A(H1N1)pdm09 tại Vi t Nam CHƢƠNG IV - BÀN LUẬN 4.1 Sự lƣu hành của cúm A(H1N1)pdm09 tại Vi t Nam, 2009 -2013 Sự xuất hiện, lan rộng và tiếp tục lưu hành của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 cũng là sự chấm dứt xuất hiện của vi rút cúm mùa A/H1N1 lưu hành trong... độ nhạy của vi rút với thuốc kháng vi rút oseltamivir trên protein NA; so sánh trình tự axit amin phát hiện các “dấu ấn” tại các vị trí đặc biệt 18 trên protein PB1, PB2, M1, M2 và NS để phân biệt giữa vi rút cúm người và vi rút cúm gia cầm hoặc động vật khác được ghi nhận là các dấu hiệu của hiện tượng trao đổi và tích hợp của vi rút cúm A, căn nguyên tiềm tàng cho sự xuất hiện một vi rút cúm mới . 1.1. Vi rút cúm 1.1.1. Đặc điểm vi rút học Vi rút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, bao gồm 5 nhóm vi rút: vi rút cúm A, vi rút cúm B, vi rút cúm C, vi rút Thogoto và vi rút Isa. Vi rút cúm A. 31 75 Vi rút 10 Hình 3.1 Cây gia hệ HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tại Vi t Nam, 200 9- 2013. Hình 3.2 Cây gia hệ NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tại Vi t Nam, 200 9- 2013. 2013. chống cúm đồng thời góp phần vào chiến lược phát triển vắc xin cúm tại Vi t Nam chúng tôi tiến hành nghiên cứu Một số đặc điểm vi rút học của vi rút cúm A/H1N1/09 đại dịch tại Vi t Nam, 2009