ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _______________ TRƯƠNG THỊ HUỲNH HOA ĐỊNH LƯNG THÀNH PHẦN BIOFLAVONOID TRONG LÁ CHÈØ XANH Ở BẢO LỘC VÀ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN TRITERPENOID TRONG LÁ CHÈØ ĐẮNG CAO BẰNG - VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa lý thuyết và Hóa lý Mã số: 1.04.04 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. GS. TS. CHU PHẠM NGỌC SƠN 2. GS. TS. POUL ERIK HANSEN TP. HỒ CHÍ MINH – NĂM 2010 6 LỜI MỞ ĐẦU Đất nước Việt Nam mến yêu của chúng ta được thiên nhiên ưu đãi rừng vàng, biển bạc. Nguồn thực vật phong phú đó vừa dùng làm thực phẩm, vừa là nguồn dược liệu có giá trò cao. Trong đó có cây chè (Camellia sinensis) được trồng trãi dài từ miền trung du Bắc bộ đến vùng cao nguyên Nam bộ. Ở miền Nam, điều kiện môi trường khí hậu, thổ nhưỡng của vùng cao nguyên Bảo Lộc (tỉnh Lâm Đồng) rất thuận lợi cho sự phát triển của loại cây công nghiệp là cây chè. Việc nghiên cứu về chất lượng của chè, nhất là các hợp chất bioflavonoid (epicatechin, epigallocatechin, epigallocatechin gallate, epicatechin gallate) có trong chè là mối quan tâm hàng đầu, không chỉ của các nước nhập khẩu chè như Mỹ, Nhật, Đài Loan, mà còn là vấn đề lớn cho cây chè vùng cao nguyên Bảo Lộc. Muố n tăng sản lượng xuất khẩu chè ra thị trường nước ngoài thì phải chú trọng cả về sản lượng và chất lượng các giống chè. Hiện nay, ngành Y – Dược đang có nhu cầu muốn ly trích các bioflavonoid trong cây chè để làm thuốc. Vì thế vấn đề đối với cao nguyên Nam bộ là trong các giống chè đang trồng phổ biến (PH1, LD97, TB14 và TB18) thì nên chọn giống và thu hoạch lá chè vào thời điểm nào để có hàm lượng bioflavonoid cao nhất. Xuất phát từ những nhu cầu thực tiễn và phương hướng phát triển từ năm 1999 – 2010 của tỉnh Lâm Đồng, luận án này góp phần vào việc nghiên cứu định lượng các hợp chất bioflavonoid, trong đó chú trọng nhiều đến việc phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ một tứ cực các hợp chất gallic acid, catechin, epicatechin, epigallocatechin, epigallocatechin gallate, epicatechin gallate trong các giống chè đang trồ ng phổ biến tại tỉnh Lâm Đồng là PH1, LD97, TB14 và TB18. 7 Hiện nay, còn có cây chè đắng (Cao Bằng – Ilex kaushue S. Y. Hu) cũng được chế thành một loại thức uống có tính trò liệu ngày càng phổ biến trong nước. Ở các nước đã có nhiều nghiên cứu về các cây thuộc chi Ilex và người ta đã cô lập được nhiều hợp chất mới, đóng góp vào kho tàng hóa chất của nhân loại. Vì thế, việc nghiên cứu thành phần hóa học của cây chè đắng Cao Bằng là một vấn đề cần thiết. Trong luận án này chúng tôi chỉ nghiên cứu thành phần triterpenoid trong lá chè đắng Cao Bằng, chú trọng đến việc cô lập và xác đònh cấu trúc những hợp chất mới. 1 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT - APCI: Atmospheric Pressure Chemical Ionization - Asp. niger: Aspergillus niger - B. subtilis: Bacillus subtilis - C. albicans: Candida albicans - C: Catechin - COSY: COrrelation SpectroscopY - DEPT: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer - DPPH: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl - E. coli: Escherichia coli - EC: Epicatechin - ECg: Epicatechin gallate - EGC: Epigallocatechin - EGCg: Epig allocatechin gallate - ESI: ElectroSpray Ionization - F. oxysporum: Fusarium oxysporum - Ga: Gallic acid - HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Coherence - HSQC: Heteronuclear Single Quantum Correlation - MeOH: Methanol - NOESY: Nuclear Overhauser Enhancement SpectroscopY - P. aeruginosa: Pseudomonas aeruginosa - S. aureus: Staphylococcus aureus - S. cerevisiae: Saccharomyces cerevisiae 2 DANH MỤC CÁC BẢNG CÂY CHÈ Trang Bảng 2.4.1 : Chương trình gradient phân tích các hợp chất bioflavonoid 36 Bảng 3.1.1 : Số liệu đường chuẩn của Ga 46 Bảng 3.1.2 : Số liệu đường chuẩn của C 47 Bảng 3.1.3 : Số liệu đường chuẩn của EC 47 Bảng 3.1.4 : Số liệu đường chuẩn của ECg 48 Bảng 3.1.5 : Số liệu đường chuẩn của EGC 48 Bảng 3.1.6 : Số liệu đường chuẩn của EGCg 49 Bảng 3.2.1 : Hàm lượng Ga, C, EC, ECg, EGC và EGCg có trong giống chè LD97 50  Bảng 3.2.2 : Hàm lượng Ga, C, EC, ECg, EGC và EGCg có trong giống chè PH1 51  Bảng 3.2.3 : Hàm lượng Ga, C, EC, ECg, EGC và EGCg có trong giống chè TB14 52  Bảng 3.2.4 : Hàm lượng Ga, C, EC, ECg, EGC và EGCg có trong giống chè TB18 53  Bảng 3.3.1 : So sánh hàm lượng EC, ECg, EGC và EGCg trong chè Tâm Châu và Thái Bảo 54  Bảng 3.4.1 : Kết quả về nhiệt độ, số giờ nắng và lượng mưa ở Bảo Lộc 58 Bảng 3.4.2 : So sánh hàm lượng EGCg và tổng polyphenol * trong bốn giống chè khảo sát thay đổi theo tháng trong năm 58  Bảng 3.4.3 : Mối tương quan giữa hàm lượng EGCg (mg/g), tổng polyphenol* (mg/g) với nhiệt độ ( o C), lưu lượng mưa (mm) và số giờ nắng (giờ) ở Bảo Lộc 59  3 CÂY CHÈØ ĐẮNG CAO BẰNG Bảng 1.7 : Một số loài thuộc chi Ilex ở Việt Nam 22 Bảng 3.6.1 : Dữ liệu phổ NMR của hợp chất IL 261 65 Bảng 3.6.2 : Dữ liệu phổ NMR của hợp chất IL 271 có so sánh với hợp chất lupeol 68  Bảng 3.6.3 : Dữ liệu phổ NMR của hợp chất IL 6522 so sánh với lup- 20(29)-en-3β,23-diol 74  Bảng 3.6.4 : Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ILE 7222 so sánh với hợp chất methyl 3ß-hydroxylup-20(29)-en-24-oate (IL 261) 77  Bảng 3.6.5 : Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ILC 4443 so sánh với hợp chất ursolic acid 79  Bảng 3.6.6 : Dữ liệu phổ NMR của hợp chất ILC 54321 so sánh hợp chất 27-p-(E)-coumaroyloxyursolic acid 83  Bảng 3.7.1 : Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm đònh 85 Bảng 3.7.2 : Kết quả thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa theo phương pháp DPPH 85  Bảng 3.7.4 : Kết quả thử nghiệm gây độc tế bào – Cytotoxicity 86 4 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ CÂY CHÈ HÌNH Trang Hình 1.1.1 : Lá, hoa và trái của cây chè ở Bảo Lộc 8 Hình 1.3.2.1 : Vườn chè giống LD97 15 Hình 1.3.2.2 : Búp và lá chè LD97 tại Bảo Lộc 15 Hình 1.3.2.3 : Vườn chè giống PH1 15 Hình 1.3.2.4 : Búp và lá chè PH1 tại Bảo Lộc 15 Hình 1.3.2.5 : Vườn chè giống TB14 15 Hình 1.3.2.6 : Búp và lá chè TB14 tại Bảo Lộc 15 Hình 1.3.2.7 : Vườn chè giống TB18 16 Hình 1.3.2.8 : Búp và lá chè TB18 tại Bảo Lộc 16 Hình 2.4.1 : Sắc đồ của sáu chất chuẩn 36 Hình 2.5.1 : Sắc đồ của EGCg của giống chè LD97 ở tháng 7 37 ĐỒ THỊ  Đồ thò 3.1.1 : Đường chuẩn Ga 46 Đồ thò 3.1.2 : Đường chuẩn C 47 Đồ thò 3.1.3 : Đường chuẩn EC 47 Đồ thò 3.1.4 : Đường chuẩn ECg 48 Đồ thò 3.1.5 : Đường chuẩn EGC 48 Đồ thò 3.1.6 : Đường chuẩn EGCg 49 Đồ thò 3.2.1 : Hàm lượng bioflavonoid trong giống chè LD97 thay đổi theo từng tháng trong năm 50  5 Đồ thò 3.2.2 : Hàm lượng bioflavonoid trong giống chè PH1 thay đổi theo từng tháng trong năm 51  Đồ thò 3.2.3 : Hàm lượng bioflavonoid trong giống chè TB14 thay đổi theo từng tháng trong năm 53  Đồ thò 3.2.4 : Hàm lượng bioflavonoid trong giống chè TB18 thay đổi theo từng tháng trong năm 54  Đồ thò 3.3.1 : Hàm lượng EC, ECg, EGC và EGCg có trong chè Tâm Châu và chè Thái Bảo 55  CÂY CHÈ ĐẮNG  Hình 1.6 : Một số loài thuộc chi Ilex 25 Hình 1.8.1 : Nhánh, lá và quả của cây chè đắng ở Cao Bằng 25 Hình 1.10.1 : Lá chè đắng sau khi sấy khô giống cây đinh 31 Hình 1.10.2 : Lá chè đắng sau khi sấy khô có dạng cuộn 31 Hình 3.6.1.2 : Tương tác NOESY của hợp chất IL 261 63 Hình 3.6.1.1 : Phổ NOESY của hợp chất IL 261 63 Hình 3.6.2.1 : Tương tác HMBC trong hợp chất IL 271 67  Hình 3.6.3.2 : So sánh giá trò cộng hưởng  C của một số carbon của hợp chất IL 6522 và hợp chất lup-20(29)-en-3β,23-diol 71  Hình 3.6.3.3 : Phổ NOESY của hợp chất IL 6522 73 Hình 3.6.3.4 : Tương tác HMBC trong hợp chất IL 6522 73 Hình 3.6.4.1 : Tương tác HMBC của hợp chất ILE 7222 76 Hình 3.6.6.1 : Phổ NOESY của hợp chất ILC 54321 82 Hình 3.6.6.2 : Tương tác HMBC của hợp chất ILC 54321 84 MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1 DANH MỤC CÁC BẢNG 2 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ 4 LỜI MỞ ĐẦU 6 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 8 CÂY CHÈ 1.1 Đặc điểm thực vật của cây chèø 8 1.2 Tình hình phân bố cây chè và sản xuất chè ở Việt Nam 9 1.3 Điều kiện tự nhiên và các giống chè ở Lâm Đồng 10 1.4 Thành phần hóa học của cây chè 16 1.4.1 Thành phần hóa học chủ yếu trong búp chè 16 1.4.2 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học và sáng chế trên thế giới 17 1.5 Hoạt tính sinh học của cây chè 20 1.5.1 Theo kinh nghiệm dân gian 20 1.5.2 Nghiên cứu về dược tính trên thế giới 20 CÂY CHÈ ĐẮNG  1.6 Đặc điểm thực vật của cây chè đắng 21 1.7 Phân bố chi Ilex ở Việt Nam 21 1.8 Đặc điểm thực vật của cây chè đắng ở Cao Bằng 23 1.8.1 Về tên khoa học 23 1.8.2 Về đặc điểm thực vật của cây chè đắng ở Cao Bằng 24 1.8.3 Phân bố chè đắng Cao Bằng 24 1.9 Một số nghiên cứu từ chi Ilex 26 1.9.1 Các hợp chất đã cô lập được từ chi Ilex 26 1.9.2 Một số nghiên cứu ở Việt Nam trên cây chè đắng Cao Bằng 29 1.10 Công dụng và các dạng sản phẩm trên thò trường của cây chè đắng Cao Bằng 29  1.10.1 Công dụng 29 1.10.2 Một số bài thuốc được dùng trong dân gian 30 1.10.3 Các dạng sản phẩm trên thò trường 31 1.11 Hoạt tính sinh học của dòch chiết lá chè đắng 31 CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 33 CÂY CHÈ 2.1 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 33 2.1.1 Nguyên liệu 33 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 34 2.2 Pha động và dung dòch chuẩn gốc 34 2.3 Trích bioflavonoid 35 2.4 Các thông số của hệ thống LC/MS 35 2.5 Xử lý đònh lượng các bioflavonoid 37 CÂY CHÈØ ĐẮNG CAO BẰNG 2.6 Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 38 2.6.1 Nguyên liệu 38 2.6.2 Phương pháp nghiên cứu 38 2.7 Cô lập các hợp chất từ lá chè đắng Cao Bằng 39 [...]... chè và sản xuất chè ở Việt Nam - Tình hình phân bố cây chè [15] Với ba phần tư diện tích là đồi núi, Việt Nam có điều kiện tự nhiên khá phù hợp cho cây chè sinh trưởng và phát triển Tuy nhiên ở Việt Nam sản xuất chè chỉ thực sự bắt đầu từ sau những năm 1925 Các vùng chè ở Việt Nam, bao gồm:  Vùng chè Tây Bắc, chủ yếu ở hai tỉnh Sơn La và Lai Châu, giống chè chủ yếu là Shan và Trung Du  Vùng chè Việt. .. Búp và lá chè PH1 tại Bảo Lộc Hình 1.3.2.5: Vườn chè giống TB14 Hình 1.3.2.6: Búp và lá chè TB14 tại Bảo Lộc 15 Hình 1.3.2.7: Vườn chè giống TB18 - Hình 1.3.2.8: Búp và lá chè TB18 tại Bảo Lộc Ngọc Thúy (du nhập vào Việt Nam năm 1991), Kim Tuyên (du nhập vào Việt Nam năm 1994) là các giống chè của Đài Loan Các giống chè này đang được thò trường nhiều nước chấp nhận 1.4 Thành phần hóa học của cây chè. .. Một số nghiên cứu ở Việt Nam trên cây chè đắng Cao Bằèng  Nông Văn Hai và các cộng sự[10] đã đònh lượng được các nhóm chất có trong lá chè đắng Cao Bằng là: saponin toàn phần 5,1 – 5,5 %; flavonoid toàn phần 0,5 – 0,6 %; polysaccharide toàn phần 2,8 – 3,4 %; carotenoid (tính theo ßcarotene) 5,0 – 5,8 %  Nguyễn Văn Đậu và Lê Ngọc Thức[8] đã cô lập và nhận danh được hai hợp chất là quercetin và dihydrocaffeic... (Ga, C, EC, ECg, EGC và EGCg) có trong các mẫu chè khảo sát 49  3.2.1  Hàm lượng bioflavonoid trong giống chè LD97 49  3.2.2  Hàm lượng bioflavonoid trong giống chè PH1 51  3.2.3  Hàm lượng bioflavonoid trong giống chè TB14 52  3.2.4  Hàm lượng bioflavonoid trong giống chè TB18 52  3.3  So sánh hàm lượng EC, ECg, EGC và EGCg trong một số chè sản xuất tại Bảo Lộc 54 ... gallate (EGCg) và epigallocatechin (EGC)  Yoko Yoshida[69] nghiên cứu ảnh hưởng của màng lọc đến hiệu suất thu hồi và của pH trong việc đònh lượng catechin trích từ chè xanh bằng sắc ký lỏng  Lihu Yao và cộng sự[48] đã nghiên cứu ảnh hưởng của khí hậu đến thành phần polyphenol trong búp chè tươi trồng ở miền bắc Queensland – Úc bằng phương pháp sắc ký lỏng Thành phần chủ yếu được nghiên cứu là các hợp... Trung học Kỹ thuật và Dạy nghề ở Bảo Lộc trồng và đang nghiên cứu với tên gọi là TB18 Ngoài ra ở Bảo Lộc cũng có những giống chè khác như:[75] - LDP1, LDP2 là dòng chè được chọn lọc bằng phương pháp lai hữu tính (1981 – 1988) với cây mẹ là Đại bạch trà và cây bố là PH1 (*) đang nghiên cứu 14 Hình 1.3.2.1: Vườn chè giống LD97 Hình 1.3.2.2: Búp và lá chè LD97 tại Bảo Lộc Hình 1.3.2.3: Vườn chè giống PH1 Hình... polyphenoloxydase )  Chất tro hàm lượng tro trong chè tươi từ 4 – 5 % và trong chè khô từ 5 – 6 % 1.4.2 Một số nghiên cứu về thành phần hóa học và sáng chế trên thế giới - Một số các nghiên cứu thành phần hóa học cây chè trên thế giới  Theo tài liệu GreenselectTM của Ý[29], chè xanh có chứa flavanol (catechin polyphenol), flavonol và phenolic acid Nhiều flavanol được cô lập từ chè xanh và được nhận danh, hai... do trong chè có hàm lượng epigallocatechin gallate (EGCg) cao, có khả năng ngăn ngừa bệnh ung thư - EGCg[36] có khả năng ngăn ngừa sự oxy hóa trong huyết thanh của người - EGCg[41] trong lá chè xanh có khả năng ngăn ngừa dấu hiệu Wnt trong quá trình xâm lấn của tế bào ung thư vú 1.5.3 Nghiên cứu về dược tính ở Việt Nam - Đề tài nghiên cứu của Phạm Thiện Ngọc[25] nhằm chiết xuất polyphenol từ lá chè xanh. .. và EGC trong búp chè tươi trồng ở Úc, cụ thể hàm lượng EGCg, ECg và EGC cao nhất trong các tháng nóng (tháng 4/2000 và tháng 5/2000) và thấp nhất trong các tháng lạnh (tháng 7/2000 – tháng 9/2000)  Theo nghiên cứu của Yukihiko Hara[72] thì hàm lượng EGCg trong chè tăng khi nhiệt độ cao và nắng nhiều, là nhờ hiệu ứng quang hợp có 14CO2 hỗ trợ cho việc tạo thành các catechin Điều này được xác nhận trong. .. Thơ và Trần Lê Quan[23] đã cô lập và nhận danh được các hợp chất kudinoside A (31), kudinoside C (32), kudinoside D (12), kudinoside E (13) và latifoloside G (33) 1.10 Công dụng và các dạng sản phẩm trên thò trường của cây chè đắng Cao Bằng[ 1],[79] 1.10.1 Công dụng Lá non và búp được sao thành chè dùng để uống Nước chè đắng trong hơn nước chè xanh; nó có vò đắng ngọt, tính mát Theo dân gian, chè đắng . ĐỊNH LƯNG THÀNH PHẦN BIOFLAVONOID TRONG LÁ CHÈØ XANH Ở BẢO LỘC VÀ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN TRITERPENOID TRONG LÁ CHÈØ ĐẮNG CAO BẰNG - VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa lý thuyết và Hóa lý. việc nghiên cứu thành phần hóa học của cây chè đắng Cao Bằng là một vấn đề cần thiết. Trong luận án này chúng tôi chỉ nghiên cứu thành phần triterpenoid trong lá chè đắng Cao Bằng, chú trọng. Vườn chè giống LD97 Hình 1.3.2.2 : Búp và lá chè LD97 tại Bảo Lộc Hình 1.3.2.3 : Vườn chè giống PH1 Hình 1.3.2.4 : Búp và lá chè PH1 tại Bảo Lộc Hình 1.3.2.6 : Búp và lá chè TB14 tại Bảo Lộc Hình