NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA Bacillus amylolyquefaciens D1768 NHƯ MỘT CHÂT KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH NHẰM NÂNG CAO SỨC KHỎE CỦA TÔM HE NHẬT BẢN Marsupenaeus japonicus CHỐNG LẠI NHÂN TỐ GÂY SỐC FORMALIN Nguyễn Thị Huế Linh 1 , Toshiaki Itami 2 1 Khoa Thủy Sản, Trường ĐH Nông Lâm, Huế 2 Khoa Nông nghiệp, Trường ĐH Miyazaki, Nhật Bản 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Giống Bacillus là trực khuẩn Gram dương, thuộc đám vi khuẩn hiếu khí và có khả năng sinh nội bào tử (Stackebrandt & Swiderski, 2002). Các loài vi khuẩn thuộc giống Bacillus có thể được phân lập từ những môi trường khác nhau như đất, nước ao, nền đáy và hệ vi sinh vật trong đường ruột của động vật thủy sản (Travers et al., 1987; Balakrishnan et al., 2003; Shakila et al., 2006). Một số loài của giống Bacillus có thể được sử dụng như probiotic dành cho người bao gồm B. cereus, B. pumilus, B. clausii (Duc et al., 2004). Và probiotic được sản xuất từ vi khuẩn này cũng được sử dụng trong nền công nghiệp nuôi trồng thủy sản. Moriarty (1998) đã dùng Bacillus để kiểm soát hiện tượng phát sáng, và tác nhân gây bệnh đã hoàn toàn không có ở đáy ao trong tất cả các giai đoạn phát triển của tôm nuôi với sự có mặt của các loài Bacillus. Meunpola et al. (2003) đã cho thấy hiệu quả của việc kết hợp ozone và probiotic Bacillus 11 để nâng cao tỷ lệ sống của tôm sú Penaeus monodon kháng lại sự cảm nhiễm của Vibrio. Mặt khác, Tseng et al. (2009) đã thừa nhận hiệu quả ức chế của probiotic B. subtlis E20 đối với sự phát triển vi khuẩn Aeromonas hydrophila và probiotic này cũng đã kích thích sự đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào ở tôm thẻ chân trắng Liptopenaeus vannamei với sự tăng lên của hoạt động thực bào và hoạt động của enzyme phenoloxidase hiệu quả kháng lại Vibrio alginolyticus. Trong công nghiệp nuôi trồng thủy sản, formalin là một trong những chất sát trùng phổ biến ở ao nuôi tôm (Gräslund & Bengtsson, 2001; Gräslund et al., 2003). Formalin được hạn chế sử dụng trong ao nuôi do tác động của nó ảnh hưởng đến môi trường, con người và thực phẩm (Boyd & Massaut 1999). Tuy nhiên, Samocha et al. (1998) đã kiến nghị rằng sử dụng formalin để kiểm tra sức khỏe tôm nuôi là một phương pháp nhanh, đơn giản, rẻ tiền, mà không đòi hỏi trang thiết bị hiện đại hay kỹ thuật cao. Benedictal et al. (2009) đã sử dụng formalin để đánh giá tỷ lệ sống, sản sinh nauplii và đẻ trứng của Artemia parthenogenetia. Tung (2009) cũng đã tiến hành formalin stress để đánh giá chất lượng của ấu trùng tôm he Nhật Bản sau khi đã cho ăn bằng thức ăn bổ sung Lactobacillus plantarum. Thêm vào đó, Lamela et al. (2008) đã chứng minh hiệu quả của formalin đối với một số thông số miễn dịch của tôm Litopenaeus schmitti cũng như sự hoại tử ở mang và khối gan tụy sau 48 h formalin stress. Như vậy, để nâng cao sức khỏe của tôm nuôi, nghiên cứu này đã sử dụng các thông số miễn dịch để đánh giá hoạt động kháng lại formalin stress sau khi đã cung cấp thức ăn có bổ sung B. amylolyquefaciens D1768 cho vật thí nghiệm. Kết quả nghiên cứu đạt được sẽ góp phần vào sự phát triển ổn định và bền vững của ngành công nghiệp nuôi trồng thủy sản. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Tôm he Nhật Bản (M. japonicus) trọng lượng 10-11g, thu từ ao nuôi và đem về phòng thí nghiệm của trường ĐH Miyazaki, Nhật Bản để thích nghi từ 3-5 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm. Bacillus amylolyquefaciens D1768 được bổ sung vào thức ăn tôm với một lượng lần lượt là 6.3 x 10 5 , 2.3 x 10 6 và 2.4 x 10 7 cfu /g 2.2. Bố trí thí nghiệm Cho ăn Có 3 lô thí nghiệm và 1 lô đối chứng (n = 20). Tôm được cho ăn thức ăn có bào tử (6.3 x 10 5 , 2.3 x 10 6 và 2.4 x 10 7 cfu /g) và không bổ sung bào tử của B. amylolyquefaciens D1768 trong 1 tuần với tỷ lệ 2 % trọng lượng cơ thể / 1 lần / 1 ngày. Tôm được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 22-23 0 C, độ mặn 30 ‰, hàm lượng oxy hòa tan 5 – 6 mg L -1 và 30% nước nuôi được thay hàng ngày. Phân tích các thông số miễn dịch Tại ngày nuôi thứ 8, tiến hành formalin stress đối với vật thí nghiệm tại nồng độ 200 ppm. Dung dịch máu tôm ở lô đối chứng và 3 lô thí nghiệm được thu trước và trong khi stress tại thời điểm 0 h, 12 h, 24 h, 48 h để đánh giá tổng số tế bào máu (THC), hoạt động thực bào và hoạt động của hệ thống enzyme prophenoloxidase (PO) của vật thí nghiệm. Nước không được thay trong khoảng thời gian thí nghiệm. Tổng số tế bào máu được xác định bằng cách sử dụng buồng đếm hồng cầu Bürker-Türk kết hợp với kính hiển vi quang học (Cheng et al., 2005). Hoạt động thực bào được xác định dựa vào hoạt động tiêu hóa của các tế bào máu đối với các hạt polyme hình cầu được hình thành từ các hạt polyme vô định hình (Latex bead). Hoạt động của hệ thống enzyme prophenoloxidase được phân tích dựa vào đo sự hình thành dopachrome từ L-DOPA (L-3, 4-dihydroxyphenylalanine, Sigma) (Sung et al., 1994; Pan et al., 2008). Phân tích và xử lý số liệu bằng phần mềm xử lý thống kê SPSS. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN THC của tôm nuôi ở lô đối chứng dao động từ 9 ± 2.1 x 10 6 đến 18.2 ± 1.6 x 10 6 tế bào mL -1 trong 48 h; trong khi đó THC của tôm nuôi ở 3 lô thí nghiệm ổn định đến 24 h, cụ thể: THC của lô thí nghiệm với thức ăn có bổ sung bào tử B. amylolyquefaciens D1768 6.3 x 10 5 cfu/g (lô D1768 10 5 ), 2.3 x 10 6 cfu/g (lô D1768 10 6 ), 2.4 x 10 7 cfu/g (lô D1768 10 7 ) lần lượt biến đổi từ 10.4 ± 7.0 x 10 6 đến 19.6 ± 2.7 x 10 6 cells mL -1 , 8 ± 0.7 x 10 6 đến 8.2 ± 2.6 x 10 6 cells mL -1 , 7.4 ± 2.7 x 10 6 đến 11.8 ± 4.5 x 10 6 cells mL -1 . Việc giảm và thay đổi số lượng tế bào máu trong vòng tuần hoàn của giáp xác là sự đáp ứng đối với nhiều yếu tố stress, tương ứng với sự giảm nguy cơ cảm nhiễm tác nhân gây bệnh (Le Moullac & Haffner, 2000; Cheng & Chen, 2001). Hsu & Chen (2007) đã chứng minh sự nhạy cảm của P. vannamei đối với V. alginolyticus có liên quan đến Hình 1. Sự thay đổi tổng số tế bào máu ở tôm cho ăn thức ăn có và không có Bacillus amylolyquefaciens D1768 của 3 lô đối chứng và 1 lô thí nghiệm trong thời gian gây stress bằng formalin. Hình 2. Sự thay đổi hoạt động thực bào ở tôm cho ăn thức ăn có và không có Bacillus amylolyquefaciens D1768 của 3 lô đối chứng và 1 lô thí nghiệm trong thời gian gây stress bằng formalin. Ký tự trên mỗi cột với cùng mốc thời gian biểu hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê hơn các cột khác (p<0.05). việc giảm các thông số miễn dịch bao gồm THC và tế bào máu không hạt khi tôm được ngâm trong 488 μg L -1 hợp chất chứa Sunfua hoặc cao hơn. Thí nghiệm của Lamela et al. (2008) đã chứng minh khi tôm L. schmitti được tiến hành formalin stress (25 và 50 ppm) trong 48 h đã dẫn đến hoại tử mang, khối gan tụy, giảm lượng máu tuần hoàn tại vị trí tổn thương và là nguyên nhân của việc giảm số lượng tế bào máu trong huyết thanh. Cũng giống với các kết quả trên, THC của lô đối chứng trong thí nghiệm của chúng tôi đã giảm trong 12 h và dao động trong suốt 36 h, trong khi đó THC của 3 lô thí nghiệm vẫn giữ ổn định trong 24 h của formalin stress. Dường như formalin nồng độ 200 ppm không có ảnh hưởng nhiều đến tôm nuôi ở cả 3 lô thí nghiệm này. Hoạt động thực bào của tôm he Nhật Bản ở cả 1 lô đối chứng và 3 lô thí nghiệm hầu như không có sự thay đổi trong 12 h (p>0.05). Tại 24 h lô D1768 10 7 hoạt động thực bào giảm và thấp hơn các lô khác từ 13.6 ~ 26.5% tại 48 h (p<0.05). a a Hoạt động PO của tôm ở 4 lô thí nghiệm giảm trong khoảng 48 h formalin stress. Trong đó, hoạt động PO của lô đối chứng thấp hơn lô D1768 10 5 (15.4 ~ 27.6%) và D1768 10 7 (3 ~ 27.6%) (p<0.05); khác nhau có ý nghĩa thống kê đối đối với lô D1768 10 6 (30.6 ~ 45.4%) trong thời gian thí nghiệm ngoài trừ tại thời điểm 24 h. Hình 3. Sự thay đổi hoạt động của enzyme phenoloxidase ở tôm cho ăn thức ăn có và không có Bacillus amylolyquefaciens D1768 của 3 lô đối chứng và 1 lô thí nghiệm trong thời gian gây stress bằng formalin. Các cột khác nhau có cùng mốc thời gian với các ký tự khác nhau biểu hiện sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0.05). Các tế bào máu của giáp xác đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch chống lại tác nhân gây bệnh. Có 3 hình thái khác nhau của tế bào máu với tế bào không hạt có chức năng thực bào, tế bào bán hạt và tế bào hạt chứa hệ thống enzyme prophenoloxidase (proPO) là nguyên nhân gây ra hiện tượng melanin hóa, hiện tượng gói gọn liên quan đến cơ chế nhận biết những chất lạ và đóng vai trò quan trọng trong tính độc của tế bào (Hose et al., 1990; Johansson, 1995; Johansson et al., 2000; Vargas-Albores et al., 2005). Vì vậy sự biến đổi của 3 thành phần tế bào máu có thể được dùng để đánh giá sức khỏe của tôm và khả năng đáp ứng miễn dịch tế bào. Trong báo cáo của Lamela et al. (2008) không có sự biến đổi hoạt động của enzyme PO của tôm L. schmitti ngâm trong formalin (25 and 50 ppm) 48 h. Tuy nhiên, thí nghiệm của chúng tôi cho thấy rằng hoạt động của enzyme PO giảm trong vòng 48 h formalin stress (p<0.05), điều này có thể do nồng độ của formalin là 200ppm cao hơn 25 và 50 ppm so với nghiên cứu trước. Như vậy, so sánh giữa 3 lượng bào tử khác nhau của vi khuẩn B. amylolyquefaciens D1768 bổ sung vào thức ăn cho tôm nuôi thì lượng bào tử 6.3 x 10 5 cfu/g được đánh giá là hiệu quả giúp tôm he Nhật Bản chống lại độc lực của formalin (200 ppm) tối thiểu trong vòng 12 h. 4. KẾT LUẬN B. amylolyquefaciens D1768 (6.3 x 10 5 cfu/g) bổ sung vào thức ăn để nâng cao sức khỏe của tôm he Nhật Bản có hiệu quả giúp vật nuôi chống lại formalin stress. Việc sử dụng probiotic như một phương pháp phòng bệnh ở động vật thủy sản và để cạnh tranh, loại trừ tác nhân gây bệnh khỏi ao nuôi hiện rất phổ biến trong ngành công nghiệp thủy sản. Trong tương lai, việc sử dụng probiotic và các chất kích thích miễn dịch khác sẽ là một biện pháp tối ưu và thân thiện với môi trường hơn so với việc sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất tràn lan trong ao nuôi trình nuôi hiện nay. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Balakrishnan S., John K. R. and George M. R. (2003) Antibiotic susceptibility of Bacillus spp. from shrimp (Penaeus monodon) cultured ponds. Indian Journal of Marine Sciences 32 (1), 81- 84. 2. Benedictal A., Veluraja K., Palavesam A., Immanuel G. (2009) Formalin and salinity stress induced cyst induction in Artemia parthenogenetica. Roumanian Biotechnological Letters Vol. 14, No.3, pp. 4370-4380. 3. Boyd C. E., Massaut L. (1999) Risks associated with the use of chemicals in pond aquaculture. Aquacultural Engineering 20, 113–132. 4. Cheng W. and Chen J C. (2001) Effects of intrinsic and extrinsic factors on the haemocyte profile of the prawn, Macrobrachium rosenbergii. Fish & Shellfish Immunology 11, 53–63. 5. Cheng W., Wang L U., Chen J C. (2005) Effect of water temperature on the immune response of white shrimp Litopenaeus vannamei to Vibrio alginolyticus. Aquaculture 250 592– 601. 6. Duc L. H., Hong H. A., Barbosa T.M., Henriques A. O. and Cutting S. M. (2004) Characterization of Bacillus Probiotics Available for Human Use. Applied and Environmental Microbiology 70, 2161–2171. 7. Gräslund S., Bengtsson B E. (2001) Chemicals and biological products used in south-east Asian shrimp farming, and their potential impact on the environment _ a review. The Science of the Total Environment 280, 93-131. 8. Gräslund S., Holmström K., Wahlström A. (2003) A field survey of chemicals and biological products used in shrimp farming. Marine Pollution Bulletin 46, 81–90. 9. Hose J. E., Martin G. G. and Gerard A. S. (1990) A decapod hemocyte classification scheme integrating morphology, cytochemistry, and function. The Biological Bulletin 178 (1): 33-45. 10. Hsu S W., Chen J C. (2007) The immune response of white shrimp Penaeus vannamei and its susceptibility to Vibrio alginolyticus under sulfide stress. Aquaculture 271, 61–69. 11. Johansson M. W. (1995) Cellular immune reactions in crustaceans: method for in vitro studies. In: Stolen J. S., Fletcher T. C., Smith S. A., Zelikoff J. T., Kaattari S. L., Anderson R. S., Söderhäll K., Weeks-Perkins B. A. (Eds.), Techniques in Fish Immunology-4. SOS Publications, Fair Haven, NJ, USA, pp. 147–154. 12. Johansson M. W., Keyser P., Sritunyalucksana K., Söderhäll K. (2000) Crustacean haemocytes and haematopoiesis. Aquaculture 191, 45–52. 13. Lamela R. E L., Quintana Y. C., Coffigny R. S., Martínez M. & Herrate N. G. (2008) Effects of formalin on total haemocytes count and histopathological changes in the shrimp Litopenaeus schmitti (Pe´rez-Farfante & Kensley 1997). Aquaculture Research 39, 1316-1321. 14. Le Moullac G., Haffner P. (2000) Environmental factors affecting immune responses in Crustacea. Aquaculture 191, 121–131. 15. Moriarty D. J. W. (1998) Control of luminous Vibrio species in penaeid aquaculture ponds Aquaculture 164, 351–358. 16. Meunpola O., Lopinyosiri K., Menasveta P. (2003) The effects of ozone and probiotics on the survival of black tiger shrimp (Penaeus monodon). Aquaculture 220, 437–448. 17. Samocha T. M., Guajardo H., Lawrence A. L., Castille F. L., Speed M., McKee D. A., Page K. I. (1998) A simple stress test for Penaeus vannamei postlarvae. Aquaculture 165, 233-242. 18. Shakila R. J., Saravanakumar R., Vyla S. A. P., Jeyasekaran G. and Jasmine G. I. (2006) Antagonistic Activity of the Gut Microflora Isolated from Farmed Tiger Shrimp (Penaeus monodon). Asian Fisheries Science 19:247-255. 19. Stackebrandt E. and Swiderski J. (2002) Book of Applications and Systematics of Bacillus and Relatives, chapter 2, p. 8-22. 20. Sung H. H., Kou G. H. and Song Y. L. (1994) Vibriosis Resistance Induced by Glucan Treatment in Tiger Shrimp (Penaeus monodon). Fish Pathology 29 (1), 11-17. 21. Travers R. S., Martin P.A. W. and Reichelderfer C. F. (1987) Selective Process for Efficient Isolation of Soil Bacillus spp. Applied and Environmental Microbiology 53, 1263-1266. 22. Tseng D Y., Ho P L., Huang S Y., Cheng S C., Shiu Y L., Chiu C S., Liu C H. (2009) Enhancement of immunity and disease resistance in the white shrimp, Litopenaeus vannamei, by the probiotic, Bacillus subtilis E20. Fish & Shellfish Immunology 26, 339–344. 23. Tung H. T. (2009) Study on effect of heat-killed Lactobacillus plantarum on response in growth and defense system of kuruma shrimp Marsupenaeus japonicus. PhD thesis, Kagoshima University, Japan. 24. Vargas-Albores F., Gollas-Galván T. & Hernández-López J. (2005) Functional characterization of Farfantepenaeus californiensis, Litopenaeus vannamei and L. stylirostris haemocyte separated using density gradient centrifugation. Aquaculture Research 36, 352-360. ABSTRACT Using immune-stimulants Bacillus amylolyquefaciens D1768 to examine the effect on immune response anti-stress of kuruma shrimp Marsupenaeus japonicus was conducted in this study. Shrimp was feed by without and with B. amylolyquefaciens D1768 spore containing 6.3 x 10 5 (group D1768 10 5 ), 2.3 x 10 6 (group D1768 10 6 ) and 2.4 x 10 7 (group D1768 10 7 ) cfu/g of dry products, respectively. After one week of feeding, the shrimp were stress by formalin (200 ppm of concentration) and were analyzed for changes in various immunological parameters at 0 h, 12 h, 24 h, 48 h of stress periods. At day 8 of feeding trial showed total hemocyte count of group D1768 10 5 and D1768 10 7 were higher than that of control group at 12 h and no difference significant between four experimental groups from 24 h to 48 h. Phagocytic activity almost no change for 12 h among these groups; phagocytic activity of group D1768 10 7 strongly decreased at 24 h and lower significantly than that of other three groups at 48 h. Phenoloxidase activity almost decreased for 48 h, in there phenoloxidase activity of control group was lower significantly than that of group D1768 10 5 and D1768 10 7 , difference significantly than that of group D1768 10 6 during stress period except at 24 h. In conclusion, B. amylolyquefaciens D1768 spore 6.3 x 10 5 cfu/g can use to enhance shrimp health and ability anti-formalin stress for 12 h at least. Key words: formalin, Bacillus amylolyquefaciens¸ Marsupenaeus japonicus . NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA Bacillus amylolyquefaciens D1768 NHƯ MỘT CHÂT KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH NHẰM NÂNG CAO SỨC KHỎE CỦA TÔM HE NHẬT BẢN Marsupenaeus japonicus CHỐNG LẠI NHÂN TỐ GÂY SỐC FORMALIN. quả của formalin đối với một số thông số miễn dịch của tôm Litopenaeus schmitti cũng như sự hoại tử ở mang và khối gan tụy sau 48 h formalin stress. Như vậy, để nâng cao sức khỏe của tôm nuôi, nghiên. giúp tôm he Nhật Bản chống lại độc lực của formalin (200 ppm) tối thiểu trong vòng 12 h. 4. KẾT LUẬN B. amylolyquefaciens D1768 (6.3 x 10 5 cfu/g) bổ sung vào thức ăn để nâng cao sức khỏe của tôm