Chương 1 GIỚI THIỆU  1.1 Mở đầu Sốt rét là bệnh gây ra bởi ký sinh trùng protozoa thuộc chi Plasmodium. Chi này có bốn loài làm con người nhiễm bệnh. Nguy hiểm hơn cả là Plasmodium falciparum và Plasmodium vivax. Hai loài còn lại (Plasmodium ovale, Plasmodium malariae) cũng gây bệnh nhưng ít gây tử vong hơn. Nhóm các loài Plasmodium gây bệnh ở người thường được gọi chung là ký sinh trùng sốt rét. Bệnh lây truyền từ người này sang người khác khi những người này bị muỗi đốt, phổ biến ở các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới của châu Mỹ, châu Á và châu Phi. Mỗi năm có khoảng 515 triệu nguời mắc bệnh, từ 1 đến 3 triệu người tử vong. Tại Việt Nam, mỗi năm có khoảng 1 triệu ca sốt rét, trong đó, 85% là do Plasmodium falciparum đã đề kháng với chloroquine và fansidar. Do đó, các nhà khoa học vẫn không ngừng nghiên cứu nhằm tìm ra loại thuốc mới điều trị sốt rét hiệu quả hơn. Cây thanh hao hoa vàng đã được y học Đông phương biết đến từ lâu trong điều trị bệnh sốt rét. Tên khoa học của cây là Artemisina annua L. Tại Việt Nam, hai danh y Tuệ Tĩnh và Hải Thượng Lãn Ông cũng xác nhận thanh hao hoa vàng có khả năng trị được bệnh sốt rét, đổ mồ hôi trộm. Hoạt chất chính của cây thanh hao hoa vàng là artemisinine (tiếng Hoa gọi là qinghaosu) được phân lập và có cấu trúc xác định vào năm 1972 là một chất sesquiterpene lactone với một cầu nối peroxide bên trong. Việc kết hợp các dẫn xuất của artemisinin như artesunate, artemether tỏ ra có hiệu quả trong việc chống lại ký sinh trùng sốt rét đã đề kháng với thuốc cổ điển. 19 Artesunate là dẫn chất tan trong nước của dihydroartemisinin nhưng độ ổn định kém khi ở môi trường nước, có độ pH trung tính hay acid. Có tác dụng diệt thể phân liệt trong máu của ký sinh trùng sốt rét. Artesunate có thể dùng theo đường uống, đường trực tràng hoặc tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch. Tác dụng của thuốc chủ yếu là do sự có mặt của cầu nối peroxide, tạo ra oxy nguyên tử gây phá hủy các màng của ký sinh trùng. 17 1 Công nghệ nano là các công nghệ liên quan đến việc thiết kế, phân tích, chế tạo, ứng dụng các cấu trúc, thiết bị và hệ thống bằng việc điều khiển hình dáng, kích thước ở quy mô nanomet (từ 1-1000 nm). Công nghệ này được xem là cuộc cách mạng công nghiệp, thúc đẩy sự phát triển trong mọi lĩnh vực đặc biệt là y sinh học, năng lượng, môi trường, công nghệ thông tin, quân sự và tác động đến toàn xã hội. Đặc biệt trong y sinh học các hạt nano có đặc tính sinh học có thể dùng để hỗ trợ chẩn đoán bệnh, dẫn truyền thuốc, tiêu diệt các tế bào ung thư… Chính vì thế, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tổng hợp nano artesunate” với mong muốn đóng góp một phần vào việc làm tăng hoạt tính điều trị bệnh của artesunate. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Hiện nay một số dẫn xuất của artemisinnin như artemether, arteether và artesunate đã được sử dụng rộng rãi, có hiệu quả cao trong điều trị sốt rét ở Trung Quốc, Việt Nam và nhiều nước khác. Tuy nhiên, các dẫn xuất này còn có một số nhược điểm, đáng kể nhất là thời gian tác dụng của thuốc ngắn dẫn đến khả năng tái phát cao. Do đó, mục tiêu của đề tài là nghiên cứu tổng hợp nano artesunate có kích thước nanomet ứng dụng trong y sinh học và chứng minh sự có mặt của artesunate trong nano β-cyclodextrin-alginate-artesunate tổng hợp được. 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Ứng dụng phương pháp mới trong tổng hợp nano từ β-cyclodextrin, sử dụng hợp chất nano mới β-cyclodextrin–alginate được điều chế từ β-cyclodextrin và alginate để làm chất mang thuốc artesunate. Đây là đề tài mới, góp phần làm cho lĩnh vực công nghệ nano ứng dụng trong y sinh học ở trong nước ngày càng phát triển. Chương 2 TỔNG QUAN 2  2.1 Khái quát về β-cyclodextrin 2.1.1 Cấu trúc và tính chất của β-cyclodextrin β-Cyclodextrin là một trong những cyclodextrin thuộc họ oligosaccharide vòng với lỗ hổng trung tâm ưa chất béo và bề mặt ngoài ưa nước. 10,14 Phân tử β-cyclodextrin chứa số lượng hydro cho và nhận tương đối lớn. 10 β-Cyclodextrin được mô tả đầu tiên bởi Villiers vào năm 1891. 13 Các tên khác thường sử dụng là cyclomylose, cyclomalto oligisaccharide, cyclomaltose hoặc schardinger dextrin. O OH HO OH O O HO HO OH O O HO OH OH O O HO OH HO O O OH OH HO O O OH HO HO O O OH HO HO O Hình 1 Cấu trúc hóa học của β-cyclodextrin β-Cyclodextrin ổn định về mặt hóa học trong các dung dịch kiềm, dễ bị thủy phân trong điều kiện acid mạnh. β-Cyclodextrin có độ hòa tan trong nước thấp hơn nhiều so với dextrin tuyến tính hay nhánh và thấp hơn so với saccharide không vòng. 5,9,20,27 Do độ tan trong nước giới hạn nên phức chất của β-cyclodextrin có độ tan giới hạn, dẫn đến sự kết tủa của phức β- cyclodextrin rắn từ nước và những hệ thống có nước khác. 2.1.2 Ứng dụng của β-cyclodextrin β-Cyclodextrin được sử dụng trong nhiều nghiên cứu vì kích thước lỗ hổng của nó (0,60-0,65 nm) lớn hơn và ít độc tính hơn so với các cyclodextrin tự nhiên khác. 10 β-Cyclodextrin làm tăng sự dẫn truyền thuốc cục bộ khi có mặt của nước. 6,15 Vì vậy, 3 β-cyclodextrin có thể được sử dụng trong nhiều lĩnh vực: thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, bảo vệ môi trường, chuyển hóa sinh học, đóng gói và ngành công nghiệp dệt. 2.2 Công nghệ nano và những ứng dụng 2.2.1 Khái niệm về công nghệ nano 1,3 Chữ nano, gốc Hy Lạp, được gắn vào trước các đơn vị đo để tạo ra đơn vị ước giảm đi 1 tỷ lần (10 -9 ). Ví dụ: nanogram = 1 phần tỷ của gram, nanomet = 1 phần tỷ mét. Công nghệ nano là công nghệ xử lý vật chất ở mức nanomet. Trong công nghệ nano, các hạt nano là những hạt phân tán hoặc các hạt rắn có kích thước trong khoảng từ 10-100 nm. Các hạt nano cũng có thể được định nghĩa là các hạt có đường kính nhỏ hơn 100 nm thể hiện các tính chất mới hoặc các tính chất phụ thuộc vào kích thước so với các hạt lớn hơn của cùng một vật liệu. Hệ thống dẫn truyền thuốc hạt nano là những chất mang có kích thước nanomet được sử dụng để dẫn truyền thuốc hoặc các phân tử sinh học. 2.2.2 Những ứng dụng của công nghệ nano 20,21 Khoảng 20 năm trước, công nghệ nano chỉ ứng dụng trong quang học, điện học, quang - điện tử. Ứng dụng công nghệ nano, ngành y dược cũng chỉ đạt được ở mức độ cải tiến nhiều thiết bị cận lâm sàng. Tuy nhiên, công nghệ nano luôn là ngành khoa học mũi nhọn. Ở Việt Nam, hiện nay các nhà khoa học đã chế tạo được hạt nano từ tính bằng các phương pháp hóa, cơ học và tập trung vào định hướng y sinh học trong việc phân tách tế bào, dẫn thuốc, nung nóng cục bộ. Dưới đây là một số lĩnh vực đang hướng đến ứng dụng mạnh mẽ công nghệ nano: o Điện tử: Nhiều phòng thí nghiệm đang bắt tay vào nghiên cứu thế hệ máy tính nano, máy tính có các chi tiết được thiết kế bằng việc sắp xếp những nguyên tử mới có khả năng lưu giữ (chứa được nhiều terabyte thông tin), xử lý thông tin với tốc độ lớn hơn hiện nay rất nhiều lần và đặc biệt là giá thành rẻ. o Y học: Trong công nghệ dược phẩm và hóa sinh, ứng dụng công nghệ nano, người ta có thể bào chế ra nhiều loại thuốc trên cơ sở cấu trúc nano để có thể tập trung chính xác vào khu vực cơ thể cần dùng đến thuốc. 4 o Năng lượng: Nhờ công nghệ nano, những loại pin mới có khả năng quang hợp nhân tạo sẽ giúp con người sản xuất năng lượng sạch. Với công nghệ nano, người ta cũng có thể chế tạo ra những thiết bị ít tiêu tốn năng lượng hơn do sử dụng những loại vật liệu nhỏ nhẹ hơn. o Môi trường: Để giải quyết những vấn đề môi sinh, người ta có thể tạo ra những màng lọc các phân tử gây ô nhiễm nhỏ bé nhất. Hiện nay một số công ty đã bắt tay vào sản xuất hạt nano dùng trong sơn, kính che nắng và ống carbon dùng trong công nghiệp điện tử. 2.3 Sơ lược về artesunate 17,19 Công thức phân tử: C 19 H 28 O 8 OHO O O O O H H O O H Hình 2 Cấu trúc phân tử artesunate Artesunate là thuốc chống sốt rét thế hệ mới, có nguồn gốc từ một loại dược thảo truyền thống được dùng trong thuốc bắc hàng ngàn năm nay để chữa sốt, có tác dụng nhanh hơn, dễ sử dụng hơn và ít hiệu ứng phụ hơn. Artesunate được chỉ định điều trị sốt rét ác tính, sốt rét thể não do các chủng ký sinh trùng sốt rét gây ra kế cả chủng đề kháng chloroquine và các thuốc khác. Artesunate là dẫn chất tan trong nước của dihydroartemisinin, có tác dụng diệt thể phân liệt trong máu của ký sinh trùng sốt rét. Artesunate có thể dùng theo đường uống, đường trực tràng hoặc theo đường tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch. 2.4 Tình hình nghiên cứu trong nước 5 Đề tài luận văn thạc sĩ của Trần Thị Hồng Ngân - Trường Đại học Cần Thơ thực hiện “Nghiên cứu và ứng dụng β-cyclodextrin làm chất mang thuốc ketoprofen” đã được hội đồng khoa học thông qua ngày 30/09/2010. 3 Đề tài luận văn thạc sĩ của Phan Anh Đào - Trường Đại học Cần Thơ thực hiện “Nghiên cứu tổng hợp nano β-cyclodextrin-alginate-nicotine” đã được hội đồng khoa học thông qua ngày 04/06/2011. 1 Công trình của Trần Đại Lâm, Nguyễn Thị Thúy Nga, Vũ Đinh Hoàng, Trần Việt Hùng thực hiện “Nghiên cứu sự phân hủy sinh học và quá trình giải phóng thuốc in vitro từ chất mang nano chitosan gắn hoạt chất artesunate”. 2 Chưa có đề tài nào nghiên cứu tổng hợp β-cyclodextrin-alginate làm chất mang thuốc artesunate được công bố. 2.5 Tình hình nghiên cứu ngoài nước  Quy trình tổng hợp nano hình cầu amphiphilic β-cyclodextrin 5, 7 Pha hữu cơ (1 mL) chứa 1 mg amphiphilic β-cyclodextrin hoặc phức amphiphilic β-cyclodextrin/progesterone (tỷ lệ 1:1, 1:2) hòa tan trong acetone hoặc ethanol. Sau đó, hỗn hợp được thêm vào 2 mL nước và khuấy khoảng 1 h ở nhiệt độ phòng. Dung môi hữu cơ được làm bay hơi trong chân không và thu được nano hình cầu. Progesterone được đưa vào nano hình cầu amphiphilic β-cyclodextrin bằng cách thêm 200 µg progesterone vào pha hữu cơ.  Quy trình tổng hợp hạt nano hình thành từ β-cyclodextrin của A. Wongmekiat 4 Cyclodextrin và thuốc được trộn theo tỷ lệ 1:1, 1,5:1, 2:1 trong lọ thủy tinh bằng cách sử dụng máy trộn. Để kiểm soát độ ẩm trong suốt quá trình đồng nghiền, lượng nước cất được thêm vào và trộn đồng nhất với hỗn hợp vật lý trong máy nghiền (CMT TI-200, Nhật) khoảng 30 phút.  Quy trình tổng hợp nano bọt biển từ β-cyclodextrin 11 4,54 g β-cyclodextrin khan và 0,428 g diphenyl carbonate được trộn trong bình cầu 250 mL. Bình cầu này được đặt trong bồn siêu âm và đốt nóng lên 90°C. Hỗn hợp được đánh siêu âm khoảng 5 h. Sau đó, hỗn hợp được làm lạnh và thu được sản phẩm. 6 Sản phẩm được rửa với nước để loại bỏ phần cyclodextrin không phản ứng và phenol tạo thành được loại bỏ bằng cách làm bay hơi trong dòng khí nitrogen ở 130°C. Sản phẩm thu được là chất bột màu trắng không tan trong nước và dung môi hữu cơ thông thường.  Quy trình tổng hợp nano từ carboxymethyl-β-cyclodextrin 12 1 mL dung dịch carboxymethyl-β-cyclodextrin (3-10,5 mg/mL) hoặc 1 mL hỗn hợp dung dịch của TPP (0,375-1,125 mg/mL) và carboxymethyl-β-cyclodextrin (0,75-10,5 mg/mL) được thêm vào 3 mL dung dịch chitosan (0,2%, pH = 4,9) và hỗn hợp này được khuấy ở nhiệt độ phòng khoảng 10 phút. Hạt nano được tách bằng cách ly tâm trên lớp glycerol và sau đó tái tạo huyền phù trong 100 µL nước khử ion. Cuối cùng các thành phần của hệ thống (tỷ lệ chitosan/cyclodextrin) được thay đổi tùy theo điều kiện hình thành. Hạt nano thu được có kích thước nhỏ.  Quy trình tổng hợp hạt nano cyclodextrin–poly(anhydride) 9 25 mg cyclodextrin được phân tán trong 2 mL acetone. Sau đó, 100 mg poly(methyl vinyl ether - maleic anhydride) được hòa tan trong 3 mL acetone và được thêm vào huyền phù cyclodextrin. Hỗn hợp được khuấy ở nhiệt độ phòng. Hạt nano được thu bằng cách thêm hỗn hợp ethanol/nước (tỷ lệ 1:1) và dung môi hữu cơ được loại bỏ bằng cách làm bay hơi dưới áp suất thấp. Sau đó, ly tâm để loại bỏ phần cyclodextrin không phản ứng và đem đông khô thu sản phẩm. Chưa có tác giả nào nghiên cứu về nano β-cyclodextrin-alginate làm chất mang cho thuốc artesunate. Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  7 3.1 Nguyên liệu và hóa chất - Nguyên liệu: β-cyclodextrin, artesunate. - Hóa chất: sodium alginate, calcium chloride, diethyl ether, ethanol, methanol, acetonitril, amonium acetate, nước cất, nước khử ion. 3.2 Phương tiện nghiên cứu 3.2.1 Thiết bị - Máy khuấy từ gia nhiệt (Heating Magnetic Stirrer–VELP Scientifica). - Cân điện tử Mettler Toledo Ab204, Sartorius GP 1503 P. - Kích thước và hình dạng hạt nano được đo bởi SEM và TEM. - Máy đo SEM (JEOL–JSM-7401F, Field Emission Scanning Electron Microscope), nơi thực hiện Viện Công nghệ Hóa học. - Máy đo TEM (JEM-1400, kính hiển vi Hitachi H8100 có thế gia tốc 200kV, nguồn phát electron LaB6, độ phân giải 0,14 nm), nơi đo Trường Đại học Bách Khoa. - Phổ hồng ngoại (IR) được đo trên máy IR-Equinox 55–Bruker (Đức), nơi thực hiện Viện Công nghệ Hóa học. - Máy đông khô (Micromodulyo Freeze Dryer–Thermo Electron Corporation), nơi thực hiện Viện Công nghệ Sinh học. - Máy đo DSC (NETSZCH–DSC 204–Đức), nơi thực hiện Trường Đại học Bách Khoa. - Định tính và định lượng artesunate trên máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Agilent 1100 series, nơi thực hiện Viện Công nghệ Hóa học. - Tủ sấy thường, cân thường và cân vi lượng. - Thanh siêu âm: Fisher Scientific Sonic Dismembrator Model 100; outut power Watts (RMS): 10. - Máy điều chỉnh pH Hannan Instrument. 3.2.2 Dụng cụ 8 - Bình tam giác loại 50 mL, 100 mL, 250 mL. - Bescher loại 50 mL, 100 mL, 250 mL. - Ống hút, pipet, đũa thủy tinh, cá từ, lọ thủy tinh, chai đựng mẫu, ống đong 50 mL, 25 mL, 10 mL, 5 mL. - Bình định mức 100 mL, 500 mL. 3.3 Phương pháp nghiên cứu - Tổng hợp nano β-cyclodextrin–alginate có kích thước nano làm chất mang thuốc artesunate ứng dụng trong y sinh học bằng phương pháp khuấy từ và khuấy từ- siêu âm. - Tổng hợp nano β-cyclodextrin–alginate-artesunate có kích thước nano ứng dụng trong y sinh học bằng phương pháp khuấy từ và khuấy từ - siêu âm. - Xác định đặc điểm hình dạng và kích thước hạt nano tổng hợp được bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) và kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). - Xác định hàm lượng artesunate có trong mẫu nano tổng hợp được bằng phân tích HPLC.  Các phương pháp phân tích sản phẩm o Xác định đặc điểm hình dạng, kích thước của các hạt nano tổng hợp được bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) và kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM). o Dùng các phương pháp phân tích phổ IR, sắc ký bản mỏng TLC để chứng minh sự có mặt của artesunate trong nano β-cyclodextrin–alginate–artesunate thu được. o Dùng phương pháp phân tích nhiệt quét vi sai DSC để xác định sự hiện diện của artesunate trong nano β-cyclodextrin–alginate–artesunate, đồng thời ghi nhận sự chuyển pha (nếu có) từ cấu trúc tinh thể sang vô định hình. o Xác định hàm lượng artesunate có trong mẫu nano β-cyclodextrin-alginate-artesunate thu được bằng phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Chương 4 KẾT QUẢ DỰ KIẾN  9 - Tổng hợp được nano β-cyclodextrin–alginate–artesunate. - Chứng minh sự có mặt của artesunate trong nano tổng hợp được. - Xác định hàm lượng artesunate bằng HPLC. - Xác định khả năng phóng thích thuốc. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM LÀM LUẬN VĂN  10 [...]... (2011), Nghiên cứu tổng hợp nano β-cyclodextrin alginate-nicotine, Luận văn Thạc sĩ Hóa học, Trường Đại học Cần Thơ [2] Trần Đại Lâm (2006), Nguyễn Thị Thúy Nga, Vũ Đinh Hoàng, Trần Việt Hùng, Nghiên cứu sự phân hủy sinh học và quá trình giải phóng thuốc in vitro từ chất mang nano chitosan gắn hoạt chất artesunate, Tạp chí Phân tích hoá lý và sinh học, 11 (1), tr 73-80 [3] Trần Thị Hồng Ngân (2010), Nghiên. .. en.wikipedia.org/wiki /Artesunate [18] pharmainfo.net/reviews/nanoparticles-and-its-applications-field-pharmacy [19] thuocbietduoc.com.vn [20] suckhoedoisong.vn/2011011403050790p0c19/cong-nghe -nano- va-ung-dung-ng oan-muc.htm [21] fotech.org/forum/index.php?showtopic=5845 13 MỤC LỤC - 2.1.1 Cấu trúc và tính chất của β-cyclodextrin 3 2.1.2 Ứng dụng của β-cyclodextrin 3 2.2 Công nghệ nano và... Cyclodextrins in targeting: Application to nanoparticles, Advanced Drug Delivery Reviews, 1999, 36, pp 29-40 [6] D Mathew, A study on suitability of nimesulide-betacyclodextrin complex in oral and topical dosage forms, Inter J of Pharm and Pharm Sciences, 2009, 1 [7] E Bilensoy, O Gurkaynak, M Ertan, M Sen, A A Hincal, Development of Nonsurfactant Cyclodextrin Nanoparticles Loaded With Anticancer Drug... Review, Sci Pharm, 2008, 76, pp 567-598 [11] R Cavalli, F Trotta, W Tumiatti, Cyclodextrin-based Nanosponges for Drug Delivery, Journal of Inclusion Phenomena and Macrocyclic Chemistry, 2006, 56, pp 209-213 [12] S Sangeetha, D N Venkatesh, R Adhiyaman, K Santhi, B Suresh, Formulation of Sodium Alginate Nanospheres Containing Amphotericin B for the Treatment of Systemic Candidiasis, Tropical Journal... Tạp chí Phân tích hoá lý và sinh học, 11 (1), tr 73-80 [3] Trần Thị Hồng Ngân (2010), Nghiên cứu và ứng dụng β-cyclodextrin làm chất mang thuốc ketoprofen, Luận văn Thạc sĩ Hóa học, Trường Đại học Cần Thơ Tài liệu tiếng Anh [4] A Wongmekiat, S Yoshimatsu, Y Tozuka, K Moribe, K Yamamoto, Investigation of Drug Nanoparticle Formation by Co-grinding with Cyclodextrins: Studies for Indomethacin, Furosemide... fotech.org/forum/index.php?showtopic=5845 13 MỤC LỤC - 2.1.1 Cấu trúc và tính chất của β-cyclodextrin 3 2.1.2 Ứng dụng của β-cyclodextrin 3 2.2 Công nghệ nano và những ứng dụng 4 2.2.1 Khái niệm về công nghệ nano1 ,3 4 3.1 Nguyên liệu và hóa chất 8 i . tài là nghiên cứu tổng hợp nano artesunate có kích thước nanomet ứng dụng trong y sinh học và chứng minh sự có mặt của artesunate trong nano β-cyclodextrin-alginate -artesunate tổng hợp được pháp nghiên cứu - Tổng hợp nano β-cyclodextrin–alginate có kích thước nano làm chất mang thuốc artesunate ứng dụng trong y sinh học bằng phương pháp khuấy từ và khuấy từ- siêu âm. - Tổng hợp nano. KẾT QUẢ DỰ KIẾN  9 - Tổng hợp được nano β-cyclodextrin–alginate artesunate. - Chứng minh sự có mặt của artesunate trong nano tổng hợp được. - Xác định hàm lượng artesunate bằng HPLC. - Xác