Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1 Lý do chọn đề tài Mắm là một trong những loài cây nhiệt đới được trồng rất nhiều ven các con sông, bờ biển trãi dài khắp Việt Nam. Đây là một loại cây có khả năng sống trong môi trường ô nhiễm và ngập nước. Nhờ hệ thống rễ phổi gồm nhiều lổ xốp giúp cây hấp thu khí nitơ và oxy trực tiếp từ không khí để vận chuyển khắp các bộ phận của cây, nó có khả năng làm giảm dòng chảy và cho phép các chất hữu cơ trong nước có thể bám vào trên rễ thể hiện như một chiếc máy lọc giúp nước sạch hơn. Đây cũng là nơi cung cấp nguồn dinh dưỡng cho các loài vật nuôi và là chổ ở của nhiều loài như: cá, tôm, cua, ốc biển, côn trùng. Cây Mắm được biết nhiều với công dụng chính là chắn sóng, giữ môi trường trong lành, làm củi đốt. Ngoài ra nó còn được xem như nguồn dược liệu có sẵn trong tự nhiên dùng để chữa các bệnh: thấp khớp, lỡ loét, đau họng, bệnh về da. Những nghiên cứu khoa học gần đây cho thấy rễ Mắm có chứa những hợp chất hóa học thể hiện hoạt tính oxi hóa kháng tế bào ung thư. Những công trình nghiên thành phần hóa học của rễ Mắm trên thế giới cũng như trong nước còn rất hạn chế và góp phần nghiên cứu của nhóm chúng tôi thêm toàn diện về thành phần hóa học của cây Mắm, được thực hiện trên các bộ phận lá và vỏ thân. Do đó, tôi sẽ tiến hành nghiên cứu trên bộ phận rễ với đề tài: “Khảo sát thành phần hóa học của rễ Mắm (Avicennia marina)”. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập các hợp chất tinh khiết và nhận danh cấu trúc các hợp chất này từ cây Mắm (Avicennia marina). - Thử hoạt tính sinh học trên các cao chiết và các hợp chất phân lập được. 1.3 Ý nghĩa khoa học của đề tài - Góp phần tìm hiểu sâu hơn về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của rễ Mắm ở Việt Nam, làm cơ sở khoa học cho các bài thuốc sử dụng dân gian. - Tìm ra các hợp chất có hoạt tính cao nhằm cung cấp những chất có tính thuốc phục vụ trong y học. 1 1.4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 1.4.1 Đối tượng nghiên cứu Mẫu nguyên liệu dùng trong nghiên cứu là phần rễ phổi của cây Mắm ổi, được thu hái tại xã Định Thành, huyện Đông Hải, tỉnh Bạc Liêu. 1.4.2 Phạm vi nghiên cứu Khảo sát trên cao petroleum, cao ethyl acetate, cao n-butanol chiết được từ vỏ rễ phổi của cây Mắm (Avicennia marina). Chương 2: TỔNG QUAN 2.1 ĐẶC TÍNH THỰC VẬT [1] Tên khoa học: Avicennia marina Forsk. Vierh. Tên Việt Nam: Mắm. Giới: Thực vật (Plantae). Ngành: Thực vật có hoa (Magnoliophyta). Lớp: Thực vật hai lá mầm (Magnoliopsida). Bộ: Hoa môi (Lamiales). Họ:Ôrô (Acanthaceae) hay Mắm (Avicenniaceae). Chi: Mắm (Avicennia L.). 2.1.1 Mô tả thực vật - Hình dáng: cây gỗ, cao đến 10 m với đường kính 0,5 m, nhánh thấp, tán rộng, cành non, có lông tơ màu trắng hay xám, thân ít khi thẳng, vỏ không nứt, màu trắng với lớp vỏ cóc có dạng phiến mỏng (giống như vỏ ổi). - Lá: lá đơn, mọc đối, phiến nguyên láng, mỏng, thường quăn queo, hình xoan, đầu nhọn hay tù, chân nêm, dài 3-5 cm, bìa nguyên, hơi dợn sóng và có lông ở gân phụ, cuống dài 0.5 cm, nhiều lông nhỏ. - Rễ: rễ phổi đứng. - Hoa: hoa vàng, to từ 5-8 mm, có mùi thơm mạnh, tạo thành tán ở ngọn, thường có 3 nhánh, lá bắc phụ hình bầu dục, lõm, tai đài không bằng nhau và có lông tơ, vành hình ống, ngắn hơn cánh, có thùy bằng nhau, dài 1-2 mm, tròn dài, 4 tiểu nhị: (2 dài, 2 ngắn), bầu nhụy hình trụ, tròn ở dưới, không vòi nhụy. 2 - Trái: trái hình tim, dài 1.5-2 cm, vỏ màu vàng xanh, đầy lông mịn. 2.1.2 Phân bố sinh thái Nơi sống: rừng ngập mặn Việt Nam (Cà Ná, Phan rang, Ba Ngòi, Cà Mau, Bạc Liêu và dọc theo bờ biển của các tỉnh phía bắc), Thái Lan, Indonesia, (Malabar, Malacca, Sumatra, Borneo, Java), Philippin, Ai Cập, Soudan, Erythee, Somalie, Anglaise, Ả Rập, Celenres, Genobil, Socotra, Zanzibar, Kenila, Phi Châu, Bồ Ðào Nha, Pakistan, Ấn Ðộ, Myanma, Sơrilanca, Andaman, Trung Hoa (Hải Nam), Ðài Loan, Hồng Kông, Nhật (Ryukyu), Tân Tây Lan … Bộ phận dùng - Lá làm phân xanh, chứa nhiều đạm, có thể xua đuổi muỗi. - Quả ăn được. - Vỏ thân và vỏ rễ dùng để làm thuốc. - Cây lấy gỗ làm củi đốt. 2.2 CÔNG DỤNG CỦA CÂY MẮM [1,2] 2.2.1 Theo y học dân gian Ngoài việc cung cấp gỗ là chính, cây mắm còn là cây dược liệu có thể chữa được một số bệnh cho con người. Trong dân gian, bài thuốc từ cây Mắm mà chủ yếu là các cao trích từ thân, rễ, lá, hoa và quả của nó với các công dụng tùy thuộc vào mỗi loài Mắm như sau; • Avicennia africana: chữa bệnh tưa miệng (ở trẻ em sơ sinh); bệnh nấm Candida (ở âm đạo của phụ nữ), chữa vết thương hoại thư, diệt chấy rận, chữa bệnh ghẻ lở, diệt giun sán và các động vật ký sinh khác; riêng vỏ của nó có thể chữa bệnh ung thư. • Avicennia alba: chữa các bệnh về da, khối u, lở loét, ung thư, chống sự sinh sản quá nhanh của động vật. • Avicennia ebracteatus: chữa những chỗ sưng lên dưới da do nhiễm trùng và sinh ra mủ, nhọt, riêng quả của nó có thể giải trừ chất độc khi bị rắn cắn. • Avicennia germinans: chữa bệnh ung thư, thấp khớp, đau họng, riêng lá và vỏ của nó có thể chữa bệnh viêm loét trong miệng. • Avicennia marina: chữa bệnh thấp khớp, đậu mùa, lở loét, thân của nó có thể chữa bệnh ung thư. 3 • Avicennia officinalis: chữa bệnh tưa miệng (ở trẻ em sơ sinh); làm thuốc kích thích tình dục, lợi tiểu, viêm gan (dùng lá và quả), dùng vỏ chữa bệnh phong. • Avicennia nitida: (vỏ và lá) chữa bệnh tưa miệng (ở trẻ em sơ sinh); bệnh nấm Candida (ở âm đạo của phụ nữ), chữa các bệnh về da, khối u, lở loét. 2.2.2 Một số bài thuốc kinh nghiệm thường dùng trong dân gian A.Petelot (1953) có thu thập một số tài liệu cho biết nhân dân nhiều nước trên thế giới (Cuba, Guyan, Tân Caledonia, ) dùng vỏ Mắm chữa hủi dưới dạng cao mềm hay cao lỏng. Cao mềm ngày cho uống từ 6 đến 8 giờ dưới dạng thuốc viên, có thể dùng vỏ Mắm ngâm rượu uống. Trên những vết loét của người ta đắp dung dịch pha 50% cao lỏng Mắm và 50% nước. 2.3 MỘT SỐ CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU VỀ CÂY MẮM [2-9] 2.3.1 Các công trình nghiên cứu ở Việt Nam Năm 2010 Phạm Thị Thùy Trang (khoa Khoa Học Tự Nhiên – Đại học Cần Thơ) đã phân lập và xác định cấu trúc của bốn hợp chất là: lupeol, stigmasterol, kaemferol, và esculetin. Trong đó hai chất kaemferol và esculetin thể hiện hoạt tính kháng oxi hóa với giá trị SC 50 (μg/mL) lần lượt là 19.9 và 14.21; ngoài ra theo phương pháp thử nghiệm độc tính trên Brine Shrimp đều cho kết quả dương tính. 2.3.2 Các công trình nghiên cứu trên thế giới - Năm 2000 Chihiro I TO và các cộng sự đã có nghiên cứu trên cây Mắm kết quả thu được ba hợp chất của naphthoquinone và ba hợp chất tương tự, có tên avicequinone-A (1), -B (2), -C (3) và avicenol-A (4), -B (5), -C (6), lần lượt được phân lập từ vỏ thân của cây Avicennia alba (Avicenniaceae) được thu hái ở Singapore và cấu trúc được xác định bằng các phương pháp phổ. Gillan và các cộng sự đã đề xuất các cấu trúc mới phytoalexin được phân lập từ cây Avicennia marina là 1,2-naphthoquinones 8 và 9. Các nghiên cứu về tổng hợp và phổ kế cho thấy rằng các cấu trúc này được xem xét kỹ lần lượt là 1,4-naphthoquinones 2 và 3, có tên là avicequinone- B và avicequinone-C. - Năm 2006 4 + MARIUM TARIQ và các cộng sự đã phân lập các loại nấm từ cây Mắm cho biết tổng số 37 loài nấm thuộc 21 loại đã được phân lập từ các thành phần khác nhau của cây Avicennia marina được thu thập từ các vùng bờ biển khác nhau ở Pakistan. Trong đó 16 loài mới được báo cáo ở Pakistan. Ở các phần khác nhau trên cây, số lượng cao nhất của nấm đã được phân lập từ lá kế đến là thân và rễ phổi. + Yan FENG và các cộng sự cũng đã phân lập được một hợp chất mới có tên là, 2′-O-(5-Phenyl-2E, 4E-pentadienoyl)- mussaenosidic acid, bài báo cho biết đã phân lập từ phần phía trên không của cây Mắm. + C Subrahmanyam và cộng sự đã nghiên cứu về hoạt tính sinh học của cây Avicennia officinalis Linn. cho biết dịch chiết hexan từ rễ được thu hái ở bờ biển Ongole, A.P., thu được ent-16-hydroxy-3-oxo-13-epi-manoyl oxide, rhizophorin-B và hợp chất diterpen mới ent-(13S)-2,3-seco-14-labden-2,8-olide-3-oic acid. Trong khi dịch chiết từ ethylacetate cho các hợp chất triacontan-1-ol, ribenone, excoecarin A, ent-16-hydroxy-3-oxo-13-epi-manoyl oxide, ent-15-hydroxy-labda-8(17),13E-dien-3- one, ent-3α,15-dihydroxy-labda-8(17),13E-dien. Excoecarin A, ent-16-hydroxy-3-oxo- 13-epi-manoyl oxide, ent-15-hydroxy-labda-8(17),13E-dien-3-one thể hiện các hoạt tính kháng nấm Rhizopus oryzae and Aspergillus niger trong khi rhizophorin-B thể hiện các hoạt tính kháng khuẩn Bacillus subtilis. - Năm 2009 + Miguel López-Lázaro và các cộng sự đã nghiên cứu sự đóng góp hoạt tính sinh học của các flavonoid luteolin, trong đó cây Avicennia marina có các hợp chất: luteolin 7-O-methylether, luteolin 7-O-methylether 3'-O-β-D-glucoside, luteolin 7-O-methylether 3'-O-β-D-galactoside các hợp chất này được phân lập từ dịch chiết methanol của những phần trên không của cây. + Feng Zhu và các cộng sự có sự nghiên cứu tổng kết thành phần hóa học trên các bộ phận của cây Avicennia marina và các loại nấm ký sinh trên cây này kết quả phân tích cho biết phân lập được 123 hợp chất trong đó có những hợp chất đã phát hiện cũng như những hợp chất mới. - Năm 2011 S.A. MAHERA và các cộng sự đã nghiên cứu về diterpen và triterpen trên cây Mắm cho biết sự nghiên cứu hóa thực vật trên rễ phổi của cây Avicennia marina (Forssk.) Vierh., kết quả phân lập được hai sterol, stigmasterol-3-O-β-D- 5 galactopyranoside (1) và stigmasterol (2) và ba triterpenoid, lupeol (3), taraxerol (4) and betulinic acid (5). Hợp chất (1) được báo cáo lần đầu của cây, còn lại bốn hợp chất đã được báo cáo nhưng không phải là cây Mắm ở Pakistan. Hợp chất (1) đã tìm thấy hoạt chất có khả năng đường hóa, đây cũng là hợp chất được báo cáo lần đầu tiên. 2.3.3 Thành phần hóa học của cây Mắm Kết quả phân tích Mắm Avicennia tomentosa của một tác giả khác cho thấy tro 7.96% (chủ yếu có natri, kali, sắt, cacbonat), tinh dầu 0.6%, nhựa 2%, tanin 17%, chất đường 11%, không thấy có alkaloid, rất ít glucoside. Một chất màu đỏ chuyển thành đỏ xim trong môi trường kiềm và vàng rồi kết tủa trong môi trường axit. Ngoài ra cây Mắm còn chứa các hợp chất như: steroid, triterpenoid, flavonoid, saponin, và các nguyên tố kim loại như Zn, Cu, Fe, Một số hợp chất tiêu biểu được phân lập từ cây Mắm: (1) Lupeol CTPT: C 30 H 50 O Lupeol kết tinh trong MeOH, tinh thể không màu dạng sợi. Tan tốt trong các dung môi petroleum ether, ethyl acetate, cồn … mp 210-212°; [α] D +30.4° HO (2) Taraxerol CTPT: C 30 H 50 O Tinh thể hình kim màu trắng Nhiệt độ nóng chảy: 281-282° R f = 0.53 (n-Hexan : CH 2 Cl 2 1 : 4) [α] 25 D +1.4° 6 HO (3) Betulinic acid CTPT: C 30 H 48 O 3 Là chất tinh thể màu trắng hình kim, kết tinh trong methanol Thu được từ cao ethylacetate, nóng chảy ở 316-318°C Tan tốt trong các dung môi ít phân cực, khó tan trong nước. HO O OH (4) Kaemferol CTPT: C 15 H 10 O 6 - Chất bột màu vàng. - Kết tinh trong CHCl 3 . - Điểm tan chảy: 276-278°C - Sắc ký lớp mỏng với dung môi giải ly (CHCl 3 :EtOAc = 1:1) cho một vết tròn màu vàng đậm có R f = 0,42. OHO OH O OH OH 7 (5) 2′-O-(5-Phenyl-2E, 4E-pentadienoyl)-mussaenosidic acid CTPT: C 27 H 32 O 11 Tồn tại dạng bột, không có dạng tinh thể, không màu mp 149-150°C [α] 22 D -122.1° O HO H H O COOH O HO OH OH O O Chương 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU − Thu hái, xử lý mẫu vỏ rễ cây mắm. − Điều chế cao petroleum ether, ethyl acetate, n-butanol. − Phân lập các chất tinh khiết từ các cao phân đoạn. − Xác định cấu trúc các chất phân lập được. − Khảo sát hoạt tính sinh học của các chất phân lập được. 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Thiết bị hóa chất a. Thiết bị - Máy cô quay chân không, cân điện tử, máy sấy, bình lóng. - Máy soi UV ở 2 bước sóng 254 nm và 365 nm. - Cột sắc ký đường kính 1-4 cm. - Becher, erlen, pipet, giấy lọc… b. Hóa chất Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel KG 60 F 254 . 8 Silica gel KG 60 F 254 dùng cho sắc ký cột pha thường cỡ hạt 0.040-0.063 mm. Thuốc hiện vết chất hữu cơ trên bản mỏng: dung dịch H 2 SO 4 10% trong methanol. Các dung môi được dùng: Tên hóa chất Nước sản xuất Ethanol 96° Việt Nam Petroleum ether (PE) Việt Nam Na 2 SO 4 Trung quốc Silica gel KG 60 F 254 pha thường Merck Bảng SKLM Merck Ethyl acetate (EA, EtOAc) Việt Nam Acetone Trung quốc n-Butanol Việt Nam Methanol Việt Nam Nước cất Việt Nam 3.2.2 Phương pháp tiến hành a) Phương pháp cô lập hợp chất Sử dụng sắc ký cột với silica gel pha thường và theo dõi quá trình sắc ký bằng sắc ký lớp mỏng. Phát hiện vết bằng đèn UV ở bước sóng 254 nm và 365 nm kết hợp với dung dịch thuốc hiện vết H 2 SO 4 10% trong methanol. b) Phương pháp xác định cấu trúc Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1 H-NMR (500 MHz) và 13 C-NMR (125 MHz) đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer, Viện hóa học, Viện khoa học và công nghệ Việt Nam, số 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. c) Phương pháp xác định kháng oxi hóa 9 Hoạt tính kháng oxi hóa của các chất tinh khiết xác định bằng phương pháp DPPH ở Phòng sinh học thực nghiệm, Viện hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. 3.2.3 Nguyên liệu a. Thu hái nguyên liệu Mẫu nguyên liệu dùng trong nghiên cứu là phần rể phổi nằm chỉa thẳng phía trên mặt đất, được thu hái tại xã Định Thành – Đông Hải - Bạc Liêu vào tháng 06 năm 2011. b. Xử lý nguyên liệu Rễ sau khi thu hái được rửa sạch bằng nước (loại bỏ tạp chất), sau đó để ráo, tách vỏ, phơi khô, xay nhuyễn. c. Quy trình chiết cao 10 [...]... Nhiên – Đại học Cần Thơ 12 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Đỗ Tất Lợi et al, 2004 Những Cây Thuốc Và Vị Thuốc Việt Nam, NXB Y Học, tr 557-558 [2] Phạm Thị Thùy Trang, 2010 Khảo sát thành phần hóa học của rễ Mắm Avicennia marina, Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ hóa hữu cơ TÀI LIỆU TIẾNG ANH [3] C.Subrahmanyam et al, 2006 Bioactive diterpenes from the mangrove Avicennia officinalis Linn, India journal... acetate, n-butanol Thử hoạt tính sinh học của ba cao chiết và các hợp chất tinh khiết đã tách ra từ các cao petroleum ether, cao ethyl acetate, cao butanol: 01/08/2011-30/03/2012 - Viết bài luận văn 04/2012 - Báo cáo luận văn 3.3.2 Địa điểm thực hiện đề tài: Phòng hóa hữu cơ chuyên sâu – Bộ môn Hóa Học – Khoa Khoa Học Tự Nhiên – Đại học Cần Thơ 12 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Đỗ Tất Lợi...RỄ MẮM KHÔ Ngâm dầm với cồn 96°, chiết, lọc BÃ DỊCH CỒN Loại dung môi dưới áp suất kém CAO EtOH Chiết với PE, cô quay loại dung môi PHA NƯỚC CAO PE Chiết với EtOAc cô quay loại dung môi CAO EtOAc PHA NƯỚC . tài: Khảo sát thành phần hóa học của rễ Mắm (Avicennia marina) . 1.2 Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập các hợp chất tinh khiết và nhận danh cấu trúc các hợp chất này từ cây Mắm (Avicennia marina). -. nghiên cứu khoa học gần đây cho thấy rễ Mắm có chứa những hợp chất hóa học thể hiện hoạt tính oxi hóa kháng tế bào ung thư. Những công trình nghiên thành phần hóa học của rễ Mắm trên thế giới. hoạt tính sinh học trên các cao chiết và các hợp chất phân lập được. 1.3 Ý nghĩa khoa học của đề tài - Góp phần tìm hiểu sâu hơn về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của rễ Mắm ở Việt Nam,