Y học thực hành (8 69 ) - số 5 /201 3 22 Vị trí phía dới, cạnh rốn là lý tởng cho việc đặt lỗ vào trong phẫu thuật nội soi một lỗ. TàI LIệU THAM KHảO 1. Bùi Mạnh Côn, Lê Quang Nghĩa, Lơng Thanh Tùng, Nguyễn Thanh Liêm và cộng sự (2011). Kết quả bớc đầu phẫu thuật nội soi một lỗ vào ổ bụng. Tập San Y học- Bệnh viện Bình Dân. 2. Lê Văn Điển (2011), U nang buồng trứng, Sản phụ khoa-tập 2, nhà xuất bản y học, chi nhánh thành phố Hồ Chí Minh, trang 844-854. 3. Triệu Triều Dơng (2012), ứng dụng phơng pháp mổ nội soi một lỗ quanh rốn điều trị bệnh viêm túi mật tại bệnh viện TƯQĐ108, Tạp chí Y Dợc học quân sự, số đặc biệt, trang: 98-100. 4. Amanda Nickles Fader, Kimberly L Levinson, (2011), Laparoendoscopic single-site surgery in gynaecology: A new frontier in minimally invasive surgery, J Minim Access Surg; 7(1): 7177. 5. Amanda Nickles Fader, Pedro F. Escobar(2009], Laparoendoscopic single-site surgery (LESS) in gynecologic oncology: Technique and initial report, Gynecologic Oncology, 114, p: 157161. 6. Amanda Nickles Fader (2011), Laparoendoscopic single-site surgery in gynaecology: A new frontier in minimally invasive surgery J Minim Access Surg. 2011 Jan-Mar; 7(1): 7177. 7. Escobar PF, Starks D (2010), Laparoendoscopic single-site and natural orifice surgery in gynecology. Fertil Steril.94(7):2497-502. 8. Joon Gung Lee (2012).Single port access versus conventional laparoscopic ovarian cystectomy: comparison of surgical outcomes, Korean J Obstet Gynecol;55(5), pp: 325-331. LIÊN QUAN GIữA MộT Số GEN EPSTEIN BAR VIRUS VớI CáC THể MÔ BệNH CủA UNG THƯ VòM HọNG Nghiêm đức thuận - Học viện Quân y Tóm tắt Tổ chức nghiên cứu ung th quốc tế đã xếp ung th vòm họng vào 1 trong 8 bệnh ung th hay gặp và u tiên giải quyết. Việt Nam có tỷ lệ mắc bệnh đứng hàng thứ 4 so với các ung th nói chung và đứng hàng đầu trong các bệnh ung th vùng đầu, cổ. Có nhiều nghiên cứu về mối liên quan giữa Epstein-Barr virus (EBV) với các thể mô bệnh học của ung th vòm họng. Bằng kỹ thuật sinh học phân tử: PCR, ISH, RT-PCR, đã phát hiện ra sự có mặt của genom EBV và hoạt tính của gen EBV trong tế bào biểu mô khối u vòm họng. Đối tợng và phơng pháp: áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử PCR, lai dot blot, RT-PCR trong tách AND, ARN ở mô bệnh học 59 bệnh nhân ung th vòm các thể. Kết luận: Lai dot blot phát hiện ADN - EBV cho thấy thể ung th biểu mô không biệt hóa dơng tính ở 95,74% bệnh nhân, thể ung th biểu mô không sừng hóa dơng tính ở 55,55% bệnh nhân, dơng tính giả ở bệnh nhân ung th đầu cổ khác không phải ung th vòm họng là 9,09% và thể ung th biểu mô sừng hóa không có trờng hợp nào. Hoạt tính gen EBV (mARN - EBV) biểu lộ trực tiếp ở kỹ thuật RT - PCR cho thấy thể ung th biểu mô không biệt hóa dơng tính ở 100% (độ nhậy 100%, độ đặc hiệu 100%), thể ung th biểu mô không sừng hóa dơng tính ở 77,77% số bệnh nhân; không phát hiện thấy biểu lộ hoạt tính ở bệnh nhân thể ung th biểu mô sừng hóa và bệnh nhân ung th đầu, cổ khác không phải là ung th vòm họng. Summary Organizations International Cancer Research has classified throat cancer in 1 in 8 common cancer and priorities. Vietnam has the incidence ranks fourth against cancer in general and the leading cancers in the head and neck. There are many studies on the association between Epstein-Barr virus (EBV) with possible histopathology of throat cancer. In molecular biology techniques: PCR, ISH, RT-PCR, discovered the presence of EBV genome and EBV gene activity in tumor epithelial cells palate. Subjects and methods: Application of molecular biology techniques PCR, cross dot blot, RT-PCR in separating DNA, RNA histopathology in 59 cancer patients can arch. Conclusion: Mixed DNA dot blot detection - EBV can show carcinoma undifferentiated positive in 95.74% of patients, carcinoma can not be positive horn in 55.55% of patients, positive false in patients with head and neck cancer other than nasopharyngeal cancer was 9.09% and carcinoma can no horn circumstances. EBV gene activity (mRNA - EBV) expressed directly in RT - PCR showed carcinoma can not differentiate positive in 100% (sensitivity 100%, specificity 100%), cancer can thickening of the epithelium is not positive in 77.77% of patients, found no expression activity in patients with carcinoma can horn and head cancer, neck cancer other than nasopharyngeal. ĐặT VấN Đề Tổ chức nghiên cứu ung th quốc tế đã xếp ung th vòm họng (UTVH) vào 1 trong 8 bệnh ung th hay gặp và u tiên giải quyết. Khu vực có nguy cơ mắc cao nhất là vùng phía nam Trung Quốc, vùng Đông nam á, kế đó là vùng Bắc Phi, vùng biển Caribê, Châu Âu và Châu Mỹ tỷ lệ mắc rất thấp. Việt Nam là nớc nằm trong nhóm có tỷ lệ mắc trung bình, theo Phạm Thụy Liên (1984) bệnh đứng hàng thứ 4 so với các ung th nói chung và đứng hàng đầu trong các bệnh ung th vùng đầu, cổ. UTVH chủ yếu là ung th biểu mô không biệt hoá. Có nhiều nghiên cứu về mối liên quan giữa Epstein- Barr virus (EBV) với các thể mô bệnh học của UTVH. Bằng kỹ thuật sinh học phân tử nh: PCR, ISH, RT- PCR, các tác giả đã phát hiện ra sự có mặt của genom EBV và hoạt tính của gen EBV trong tế bào biểu mô khối u vòm họng, đó là yếu tố quyết định sự mã hoá Y học thực hành (8 69 ) - số 5/2013 23 các dấu ấn ung th trong huyết thanh bệnh nhân. Đến nay nhiều tác giả của nhiều quốc gia đã ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện nguy cơ mắc bệnh và chẩn đoán sớm UTVH. Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên chúng tôi tiến hành nghiên cứu: Xác định mối liên quan giữa một số gen EBV, hoạt tính của gen (mARN - EBV) với các thể mô bệnh học và ứng dụng trong chẩn đoán. ĐốI TƯợNG Và PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 1. Đối tợng nghiên cứu. Bệnh phẩm sinh thiết ở 59 bệnh nhân ung th vòm họng (các thể ung th biểu mô không biệt hóa - UTBMKBH, ung th biểu mô không sừng hóa - UTBMKSH, ung th biểu mô sừng hóa - UTBMSH) điều trị tại khoa Tai - Mũi - Họng Viện quân y 103 đợc lựa chọn theo tiêu chuẩn thống nhất, đợc lu ở -70 0 C cho tới khi tách ADN và ARN. 2. Phơng pháp nghiên cứu. Nghiên cứu mô tả cắt ngang. Các chỉ tiêu nghiên cứu - áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử: PCR, lai dot blot, RT-PCR trong tách AND, ARN. 3. Hóa chất Hóa chất của Amersham pharmacia biotech, Perkin - Elmer (USA), ECL: direct nucleic acid labelling and detection systems. 4. Xử lý số liệu. Theo chơng trình phần mềm Epi - Info. KếT QUả NGHIÊN CứU 1. Xác định mối liên quan giữa EBV và hoạt tính của gen EBV với ung th vòm họng Bảng 1: Kết quả phát hiện ADN - EBV bằng kỹ thuật PCR ở các thể mô bệnh học. Thể MBH UTBMKBH n = 47 UTBMKSH n = 9 UTBMSH n = 3 Dơng tính Âm tính Dơng tính Âm tính Dơng tính Âm tính N 40 7 2 7 0 3 % 85,11 14,89 22,23 77,77 0 100 Bảng 2. Kết quả phát hiện ADN - EBV bằng kỹ thuật lai dot blot sử dụng ADN dò là sản phẩm của PCR. Thể MBH UTBMKBH n = 47 UTBMKSH n = 9 UTBMSH n = 3 Dơng tính Âm tính Dơng tính Âm tính Dơng tính Âm tính N 45 2 5 4 0 3 % 95,74 4,26 55,55 45,45 0 100 Thể UTBMKBH: phát hiện 45/47 (95,74%) trờng hợp có ADN - EBV trong mẫu sinh thiết khối u vòm họng. Trong đó 2/47 (4,25%) dơng tính trớc khi có chẩn đoán mô bệnh học 6 tháng và 9 tháng. Có chấm sáng: dơng tính Không có chấm sáng: âm tính ảnh 3.1. Kết quả phát hiện ADN - EBV bằng kỹ thuật lai dot blot trên màng Hybond - N + Bảng 3. Tỷ lệ phát hiện ADN - EBV ở mô sinh thiết ung th đầu, cổ không phải là UTVH bằng kỹ thuật PCR và kỹ thuật lai dot blot. Kỹ thuật Nhóm chứng PCR Lai dot blot SL mẫu % n % N % Ung th Amidan Ung th sàng hàm Ung th hạ họng Ung th lỡi 2 1 0 0 18,18 9,09 0 00 1 0 0 0 9,09 0 0 0 4 4 2 1 36,36 36,36 18,18 9,09 Tổng số 3 27,27 1 9,09 11 100 Bảng 4. Xác định độ nhậy, độ đặc hiệu của kỹ thuật PCR và kỹ thuật lai dot blot. Kỹ thuật PCR Lai dot blot SL mẫu % Thể MBH n % N % UTBMKBH UTBMKSH UTBMSH 40 2 0 67,79 3,39 0 45 5 0 76,27 8,47 0 47 9 3 79,66 15,25 5,09 TS 42 71,18 50 84,74 59 100 Chứng 3 27,27 1 9,09 11 100 Độ nhậy Độ đặc hiệu 71,18% 72,72% 84,74% 90,90% Bảng 5. So sánh tỷ lệ phù hợp của kỹ thuật PCR và kỹ thuật lai dot blot. Kỹ thuật Thể MBH PCR (+) Dot blot (+) PCR (+) Dot blot (-) PCR ( - ) Dot blot (+) PCR ( - ) Dot blot (-) n % n % n % n % Y học thực hành (8 69 ) - số 5 /201 3 24 UTBMKBH 40 67,79 0 0 5 8,47 2 3,38 UTBMKSH 2 3,38 0 0 3 5,08 4 6,77 UTBMSH 0 0 0 0 0 0 3 5,08 Tổng số 42 71,18 0 0 8 13,55 9 15,25 Chứng 1 9,09 2 18,18 0 0 8 72,72 Không có trờng hợp nào PCR dơng tính, mà dot blot âm tính. 51/59 trờng hợp có kết quả phù hợp giữa hai kỹ thuật PCR và lai dot blot, còn 8/59 trờng hợp bằng kỹ thuật lai phát hiện đợc ADN - EBV, trong khi kỹ thuật PCR âm tính. Bảng 6. Tỷ lệ phát hiện mARN - EBV bằng kỹ thuật RT - PCR. Thể MBH UTBMKBH n = 47 UTBMKSH n = 9 UTBMSH n = 3 Dơng tính Âm tính Dơng tính Âm tính Dơng tính Âm tính N 4 7 0 7 2 0 3 % 100 0 77,77 22,23 0 100 Thể UTBMSH không phát hiện thấy trờng hợp nào có hoạt tính mARN - EBV trong mẫu sinh thiết khối u vòm họng. Bảng 7. Tỷ lệ phát hiện mARN - EBV ở nhóm chứng bằng kỹ thuật RT - PCR. Kỹ thuật Nhóm chứng RT PCR SL mẫu N % Ung th Amidan Ung th sàng hàm Ung th hạ họng Ung th lỡi 0 0 0 0 0 0 0 0 4 4 2 1 Tổng số 0 0 11 Không phát hiện thấy trờng hợp nào có hoạt tính mARN - EBV trong mẫu sinh thiết khối u ung th đầu, cổ không phải là UTVH. Bảng 8. Xác định độ nhậy, độ đặc hiệu của kỹ thuật RT - PCR. Kỹ thuật Thể MBH RT PCR SL mẫu % N % UTBMKBH UTBMKSH UTBMSH 47 7 0 100 77,77 0 47 9 3 79,66 15,25 5,09 Tổng số 54 91,52 59 100 Chứng 0 0 11 100 Độ nhậy Độ đặc hiệu 91,52% 100% Sử dụng 2 cặp mồi EBNA-1 cho kỹ thuật RT - PCR, với độ nhậy là: 91,52% và độ đặc hiệu là: 100%. Không phát hiện thấy hoạt tính gen EBV trong mẫu sinh thiết khối u của nhóm chứng Bảng 9. So sánh tỷ lệ phù hợp của kỹ thuật lai dot blot và kỹ thuật RT - PCR. Kỹ thuật Thể MBH RT - PCR (+ ) Dot blot (+) RT - PCR (+) Dot blot (-) RT - PCR ( - ) Dot blot (+) RT - PCR ( - ) Dot blot (-) n % n % n % n % UTBMKBH 45 76,27 2 3,38 0 0 0 0 UTBMKSH 5 8,47 2 3,38 0 0 2 3,38 UTBMSH 0 0 0 0 0 0 3 5,08 TS 50 84,74 4 6,77 0 0 5 8,47 Chứng 0 0 0 0 1 9.09 10 9 0,91 So sánh kỹ thuật RT - PCR và kỹ thuật lai dot blot. Cùng dơng tính 50/59 (84,74%) trờng hợp, cùng âm tính 5/59 (8,47%) trờng hợp. 4/59 (6,77%) trờng hợp RT - PCR dơng tính, trong khi lai dot blot âm tính. Không có trờng hợp nào RT - PCR âm tính mà lai dot blot dơng tính. BàN LUậN Các kỹ thuật sinh học phân tử đã đợc ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh ở các nớc phát triển, có những bệnh xét nghiệm sinh học phân tử đã đợc coi nh là xét nghiệm thờng quy. Trong nghiên cứu này chúng tôi ứng dụng kỹ thuật PCR và triển khai thêm các kỹ thuật sinh học phân tử khác đó là: lai dot blot, RT - PCR trong việc phát hiện nguy cơ mắc bệnh và chẩn đoán sớm UTVH. Các kỹ thuật này có thể ứng dụng rộng rãi ở phòng xét nghiệm của các bệnh viện lớn, giúp cho chẩn đoán bệnh ngày càng sớm và chính xác, đặc biệt là phát hiện đợc những gia đình có nguy cơ cao mắc UTVH. 1. Tách ADN và ARN từ mô sinh thiết khối u. Đối với ADN chúng tôi tách từ mẫu sinh thiết khối u vòm họng của bệnh nhân UTVH đã đợc chẩn đoán xác định bằng mô bệnh học, mẫu sinh thiết đợc bảo quản ở -70 0 C cho đến khi sử dụng, tách chiết theo bộ chuẩn của hãng Pharmacia biotech (Rapid prep micro genomic ADN isolation), kết quả thu đợc điện di kiểm tra trên thạch 2%. So với các tác giả khác nh Uraiwan Kositanont (1993) sử dụng quy trình tách ADN của Chan (1988) với phenol - chloroform - isoamyl và ethanol, thì kỹ thuật của chúng tôi áp dụng quy trình đơn giản hơn, mất ít thời gian hơn, nhng ADN thu đợc vẫn tinh khiết đáp ứng đợc những yêu cầu của kỹ thuật PCR và lai dot blot. Đối với ARN chúng tôi cũng tách từ mẫu sinh thiết khối u vòm họng của bệnh nhân UTVH đã đợc chẩn đoán xác định bằng mô bệnh học, mẫu sinh thiết đợc bảo quản ở -70 0 C cho đến khi sử dụng, quy trình kỹ thuật tách là: acid guanidinium thiocyanate - phenol - chloroform extraction (Chomczynski và Sacchi -1987). Kết quả thu đợc điện di kiểm tra trên thạch 1%, quy trình này đợc nhiều tác giả trên thế giới áp dụng, Hu L. F. (1994) sử dung kỹ thuật này để tách ARN, u điểm của kỹ thuật là không sử dụng biện pháp cơ học để nghiền tổ chức, mà sử dụng hoá chất để làm tan tổ chức, chính vì vậy ARN sẽ không bị nhiễm trong quá trình tách và sợi ARN không bị gãy do tác động cơ học. 2.Chọn mồi sử dụng cho kỹ thuật. Các kỹ thuật sinh học phân tử nói chung và kỹ thuật PCR, lai dot blot, RT - PCR nói riêng việc lựa chọn mồi (primer) thích hợp, phục vụ đúng yêu cầu của kỹ thuật là điều hết sức quan trọng. Theo dữ liệu từ ngân hàng gen (EMBL DATABASE) thì genom của EBV dài 184113 bp. Trong cấu trúc genom của EBV chủng HEHS4B95-8, từ vị trí khoảng 13200 đến khoảng 47700 có đoạn ADN dài 3072 bp đợc lặp lại 11 lần và có ký hiêụ EBIRL. Biên giới của các đoạn này là điểm cắt của enzym BamH1. Ngoài ra trong vùng này còn một đoạn ADN khác dài 2044 bp có ký hiệu HEHS4PAL đợc lặp lại 12 lần. Chính vì vậy các nhóm Y học thực hành (8 69 ) - số 5/2013 25 nghiên cứu khác nhau khi sử dụng các kỹ thuật để phát hiện gen EBV đều sử dụng các cặp mồi khác nhau. Tác giả Sato I. (1989) sử dụng cặp mồi dài 27 bp để phát hiện gen EBV chủng HEHS4B95-8, chiều dài của đoạn ADN khuyếch đại lên bằng PCR là 288 bp. Nhóm của Sixbey J.W. (1989) đã dùng cặp mồi dài 20 bp để phát hiện gen EBV chủng HEHS4B95-8, chiều dài của đoạn ADN khuyếch đại lên bằng PCR là 89 bp. Nhóm nghiên cứu của Trơng Nam Hải (1997) sử dụng cặp mối là chủng lai đợc với chủng EBV - HEHS4B95-8, tai vị trí 1133 - 1157 (TH1) và 1352 - 1376 (TH2) dài 24 bp để phát hiện ADN - EBV trong mô sinh thiết khối u của ung th vùng đầu, cổ bằng kỹ thuật PCR, chiều dài của đoạn ADN khuyếch đại lên là 243 bp. Nhóm nghiên cứu của chúng tôi sử dụng cặp mồi EBNA-2A để phát hiện ADN - EBV trong mô sinh thiết khối u vòm họng bằng kỹ thuật PCR, đây là cặp mồi của chủng HEHS4B95-8 tại vị trí 49213 - 49233 và 49309 - 49329, có trình tự: 5 - AAC TTC AAC CCA CAC CAT CA-3 5 - TTC TGG ACT ATC TGG ATC AT -3 và độ dài là 20bp, khi khuyếch đại lên bằng PCR sẽ có độ dài 115 bp. Để tăng độ nhậy của kỹ thuật lai dot blot chúng tôi không dùng trực tiếp cặp mồi EBNA- 2A làm ADN dò, mà sử dụng ADN dò là sản phẩm của PCR với cặp mồi EBNA-2A, khi đó ADN dò có độ dài là 115 bp. Đối với 2 kỹ thuật PCR và lai dot blot khi sử dụng cặp mồi EBNA-2A chỉ chứng minh đợc sự có mặt của ADN - EBV trong mô sinh thiết khối u vòm họng, còn để chứng minh hoạt tính của gen EBV (mARN) chúng tôi đã sử dụng 2 cặp mồi Fp. EBNA-1 có trình tự và vị trí nh sau: 5 - G TG CGC TAC C GG AT G GCG - 3 5 - CAA TGC AAC TTG GACGTTTT - 3 5 - AGC TTC CCT GGG ATG AGC GT - 3 5 - TCT TCC CCG TCC TCG TCC AT - 3 sử dụng cho kỹ thuật RT - PCR, sau khi khuyếch đại sẽ có độ dài là 293 bp, kỹ thuật này diễn ra làm 2 giai đoạn: trớc tiên từ mARN nhờ quá trình sao chép ngợc tạo ra cADN, tiếp theo nhờ kỹ thuật PCR tạo ra sản phẩm là ADN có độ dài 293 bp. Đây là cặp môi rất đợc a sử dụng để xác định hoạt tính của mARN bằng kỹ thuật RT - PCR, Hu, L.F. (1994) đã sử dụng kỹ thuật này với mồi EBNA-1 để xác định hoạt tính của mARN. 3. Xác định ADN - EBV trong mô sinh thiết khối u. Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi EBNA-2A để phát hiện ADN EBV, chúng tôi nhận thấy thể UTBMKBH phát hiện thấy 85.11% trờng hợp có ADN - EBV trong mẫu sinh thiết khối u vòm họng, thể UTBMKSH phát hiện thấy 22.23% trờng hợp có ADN - EBV trong mẫu sinh thiết khối u vòm họng còn thể UTBMSH không phát hiện thấy trờng hợp nào có ADN - EBV. Sử dụng ADN là sản phẩm của PCR với cặp mồi EBNA-2A làm ADN dò cho kỹ thuật lai dot blot kết quả cho thấy thể UTBMKBH phát hiện thấy 95,74% trờng hợp có ADN - EBV trong mẫu sinh thiết khối u vòm họng, trong đó 2/47 (4,25%) dơng tính trớc khi có chẩn đoán mô bệnh học 6 tháng và 9 tháng, thể UTBMKSH phát hiện thấy 55,55% trờng hợp có ADN - EBV trong mẫu sinh thiết khối u vòm họng, thể UTBMSH không phát hiện thấy trờng hợp nào có ADN - EBV. Cũng sử dụng 2 kỹ thuật PCR và lai dot blot với cặp mồi EBNA-2A, để xác định ADN - EBV trong mô sinh thiết khối u của 11 bệnh nhân nhóm chứng bao gồm ung th đầu, cổ không phải là UTVH, cho kết quả với kỹ thuật PCR phát hiện thấy 3/11 (27,27%) trờng hợp có ADN - EBV trong mẫu sinh thiết khối u, trong đó 2/11 (18,18%) là ung th amidan khẩu cái, còn lại 1/11 (9,09%) là ung th sàng hàm, với kỹ thuật lai dot blot chỉ phát hiện thấy 1/11 (9,09%) trờng hợp đó là bệnh nhân ung th amidan có ADN - EBV trong mẫu sinh thiết khối u. Nh vậy nếu xét riêng kỹ thuật PCR đối với 70 bệnh nhân (59 bệnh nhân nghiên cứu, 11 bệnh nhân chứng) thì tỷ lệ PCR dơng tính thật và âm tính thật là 50/70 (71,42%), dơng tính giả và âm tính giả là 20/70 (28,58%) với độ nhậy là: 71,18% và độ đặc hiệu là: 72,72%. Nếu xét riêng kỹ thuật lai dot blot đối với 70 bệnh nhân trên thì tỷ lệ lai dot blot dơng tính thật và âm tính thật là 60/70 (85,71%), dơng tính giả và âm tính giả là 10/70 (14,29%) với độ nhậy là: 84,74% và độ đặc hiệu là: 90,90%. Trong số bệnh nhân nghiên cứu có 2 trờng hợp làm kỹ thuật lai dot blot phát hiện thấy ADN - EBV trớc khi có chẩn đoán xác định mô bệnh học 6 tháng và 9 tháng. Việc phát hiện ADN - EBV bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi EBNA-2A chỉ thấy ở 85,11% số bệnh nhân thể UTBMKBH, khi sử dụng kỹ thuật lai dot blot với ADN dò là sản phẩm của PCR đã nâng tỷ lệ phát hiện thấy ADN - EBV lên 95,74% số bệnh nhân thể UTBMKBH. Tơng tự với thể UTBMKSH ở kỹ thuật PCR chỉ phát hiện thấy 22,23% số bệnh nhân, khi sử dụng kỹ thuật lai dot blot nâng tỷ lệ lên 55,55%, trong khi đó thể UTBMSH cả 2 kỹ thuật đều không phát hiện thấy ADN - EBV. Đối với nhóm chứng ung th đầu, cổ không phải UTVH, dơng tính giả của PCR là: 3/11 (27,27%), của lai dot blot là: 1/11 (9,09%) bệnh nhân, theo nghiên cứu của Andersson A.M. (1977) không phát hiện thấy ADN - EBV trong mô sinh thiết khối u của các ung th đầu, cổ khác không phải là UTVH bằng kỹ thuật PCR. Kết quả lai dot blot có tỷ lệ dơng tính cao hơn kỹ thuật PCR có thể giải thích: kỹ thuật lai dot blot sử dụng ADN dò, là sản phẩm khuyếch đại PCR từ cặp mồi EBNA- 2A nên có độ dài lớn (115bp), do đó khi lai xác suất bắt gặp giữa ADN dò đặc hiệu với ADN khuôn sẽ lớn, mặt khác kết quả lai lại đợc phát hiện bằng phơng pháp nhận biết phát quang trên phim X - ray, nên độ nhậy của kỹ thuật tốt hơn. Nghiên cứu của Phan Thị Phi Phi và cs, (1997) sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi TH1 và TH2 để phát hiện ADN - EBV trong mô sinh thiết khối u của bệnh nhân ung th vùng đầu, cổ có cả UTVH cho thấy tỷ lệ PCR dơng tính thật và âm tính thật phù hợp với mô bệnh học là 71%, dơng tính giả là 29%, tác giả không thấy trờng hợp nào âm tính giả đối với UTVH và 1 có trờng hợp ADN - EBV dơng tính trớc khi có chẩn đoán xác định mô bệnh học 3 tháng. Tác giả Raphael Feinmesser (1992) thực hiện Y học thực hành (8 69 ) - số 5 /201 3 26 PCR trên 9 bệnh nhân ung th vòm họng và 12 bệnh nhân ung th đầu, cổ không phải ung th vòm họng thấy 100% bệnh nhân UTVH thể UTBMKBH đều phát hiện thấy ADN - EBV, không phát hiện thấy ở các loại ung th đầu, cổ khác. Theo Shigeyuki (1997) bằng kỹ thuật PCR để phát hiện ADN - EBV trong mô sinh thiết khối u vòm họng cho kết quả, thể UTBMKBH là 82,50%, thể UTBMKSH là 71,66%, không phát hiện thấy ở thể UTBMSH. Theo Choon - Kook - Sam (1996) cũng bằng kỹ thuật PCR đã phát hiện thấy ADN - EBV ở 76% các bệnh nhân UTBMKBH và có thể phát hiện ADN - EBV trong mô sinh thiết khối u vòm họng 1 năm đến 2 năm trớc khi có chẩn đoán xác định bằng mô bệnh học. Các tác giả Uranwan Kositanont (1993) thấy 100% bệnh nhân UTVH thể UTBMKBH có ADN - EBV trong mô sinh thiết khối u vòm họng và chỉ âm tính trong UTVH thể biệt hoá (UTBMKSH và UTBMSH). Bằng kỹ thuật lai dot blot nhng sử dụng alkaline phosphatase (AP) gắn vào ADN dò, tác giả Chen Y. (2000) đã phát hiện ADN - EBV ở mô sinh thiết khối u vòm họng của 8 bệnh nhân UTVH và không phát hiện thấy ở mô sinh thiết vòm họng của bệnh nhân có tổ chức limphô quá phát vòm họng. Nh vậy khi sử dụng kỹ thuật lai dot blot kết quả nghiên cứu của chúng tôi (95,74%) cao hơn so với một số nghiên cứu của nhiều tác giả khác và trong nghiên cứu của chúng tôi có 2 trờng hợp dơng tính trớc khi có chẩn đoán mô bệnh học 6 tháng và 9 tháng và chỉ phát hiện thấy ADN - EBV ở 3 bệnh nhân chứng đối với kỹ thuật PCR và 1 bệnh nhân chứng đối với kỹ thuật lai dot blot. 4. Xác định hoạt tính mARN - EBV trong mô sinh thiết khối u. Nhiều tác giả đã chứng minh rằng các gen EBV hoạt động rất mạnh trong giai đoạn toàn phát, tái phát và di căn xa, các kháng thể kháng VCA và kháng EA đặc biệt các IgA/ VCA và IgA/ EA trong huyết thanh bệnh nhân UTVH, có hiệu giá rất cao so với ngời bình thờng và đã sử dụng các loại kháng thể IgA này để giúp chẩn đoán sớm UTVH. Quản lý những ngời có IgA/ VCA dơng tính, nhất là có PCR- EBV dơng tính, coi họ là những ngời có nguy cơ cao bị UTVH và khám lại, sinh thiết nhiều lần ở các vị trí khác nhau của khối u vòm họng để tìm tế bào ác tính là việc làm cần thiết. Các IgA/ VCA và IgA/ EA trong huyết thanh bệnh nhân UTVH, giúp tiên lợng bệnh, đánh giá kết quả điều trị. Các gen EBV (ADN - EBV, ARN - EBV) và protein đặc hiệu EBV phát hiện thấy ở mô sinh thiết khối u vòm họng, đặc biệt là thể UTBMKBH. Các gen EBV biểu hiện trên mô sinh thiết khối u vòm họng đã tìm thấy là: EBNA-1, EBNA-2, các gen LMP (LMP1, LMP2A, LMP2B), các gen EBER. Gen LMP1 - EBV đợc coi nh là một yếu tố cơ bản dẫn đến biến đổi ác tính liên bào vòm họng, nhng quá trình tác động qua nhiều giai đoạn này của các gen EBV còn liên quan đến các hiện tợng mất hay biến dị các gen ức chế ung th. Khả năng tổng hợp kháng thể ngoài việc phụ thuộc vào nồng độ kháng nguyên là sản phẩm của các gen EBV, còn phải kể đến chức năng hệ miễn dịch. Trong giai đoạn toàn phát của bệnh hiệu giá kháng thể cao phản ánh nồng độ kháng nguyên EBV cao do hoạt tính gen EBV mạnh và chức năng đáp ứng miễn dịch dịch thể tốt. IgA/VCA có thể xuất hiện nhiều tháng, nhiều năm trớc khi phát bệnh, nếu không bị các cơ chế bất hoạt hay trung hoà. Tái phát huyết thanh học sau xạ trị, hiệu giá IgA/VCA tăng cao trở lại cũng nói lên rằng sự tái hoạt hoá của gen mã hoá kháng nguyên này của EBV, ở các giai đoạn tái phát và di căn xa của bệnh, nhiều tác giả đã sử dụng dấu ấn này trong thực tế lâm sàng để tiên đoán tái phát và di căn xa của bệnh. Chúng tôi sử dụng kỹ thuật RT - PCR với mồi EBNA-1 để xác định hoạt tính của gen EBV (mARN) trong mô sinh thiết khối u vòm họng. Nghiên cứu 59 bệnh nhân UTVH thể UTBMKBH có 47 bệnh nhân thì phát hiện thấy 47/47 (100%) trờng hợp có hoạt tính mARN - EBV trong mẫu sinh thiết khối u vòm họng, thể UTBMKSH có 9 bệnh nhân thì phát hiện thấy 7/ 9 (77,77%) trờng hợp có hoạt tính mARN - EBV trong mẫu sinh thiết khối u vòm họng, thể UTBMSH không phát hiện thấy trờng hợp nào có hoạt tính mARN - EBV trong mẫu sinh thiết khối u vòm họng. Nghiên cứu 11 bệnh nhân chứng bao gồm ung th đầu, cổ không phải là UTVH, chúng tôi cũng sử dụng kỹ thuật RT - PCR với mồi EBNA-1 để xác định hoạt tính của gen EBV (mARN) trong mô sinh thiết khối u, không phát hiện thấy trờng hợp nào có hoạt tính gen EBV. Nh vậy hoạt tính gen EBV chỉ phát hiện thấy trong mô sinh thiết khối u vòm họng của bệnh nhân UTVH thể UTBMKBH và UTBMKSH. Kết quả thu đợc gợi ý rằng dùng mồi EBNA-1 cho kỹ thuật RT- PCR sẽ cho thông tin đồng thời về gen và hoạt tính gen EBV ở bệnh nhân UTVH tốt hơn là sử dụng kỹ thuật PCR và lai dot blot với các cặp mồi có bản chất là intron (TH1/ TH2 hay EBNA-2A), những kỹ thuật này chỉ phát hiện đợc sự có mặt của gen mà không xác định đợc hoạt tính của gen trong mô sinh sinh thiết khối u vòm họng. Halmilton Dutoit (1994), bằng kỹ thuật lai in situ ARN/ARN để phát hiện mARN - EBV, thấy trong 86 bệnh nhân UTVH thì 82 bệnh nhân thể UTBMKBH đều dơng tính (100%), 3 bệnh nhân thể UTBMKSH thì 2 bệnh nhân dơng tính (66,66%), còn 1 bệnh nhân thể UTBMSH thì âm tính, tác giả Shigeyuki Murono (1997) cũng bằng kỹ thuật lai in situ phát hiện thấy mARN - EBV trong 100% bệnh nhân thể UTBMKBH và 91,66% bệnh nhân thể UTBMKSH, còn thể UTBMSH không phát hiện thấy trờng hợp nào. Điều này cho thấy bệnh sinh của ung th vòm họng thể UTBMSH không liên quan với sự tồn tại của gen EBV trong liên bào vòm họng, khác với hai thể UTBMKBH và UTBMKSH là có liên quan với gen EBV và hoạt tính của gen. KếT LUậN Lai dot blot phát hiện ADN - EBV cho thấy: thể UTBMKBH dơng tính (95,74%) số bệnh nhân nghiên cứu, thể UTBMKSH dơng tính (55,55%) số bệnh nhân nghiên cứu, dơng tính giả ở bệnh nhân ung th đầu cổ khác không phải UTVH là: (9,09%) và thể UTBMSH không có trờng hợp nào dơng tính. Y học thực hành (8 69 ) - số 5/2013 27 Hoạt tính gen EBV (mARN - EBV) đợc biểu lộ trực tiếp ở kỹ thuật RT - PCR cho thấy: thể UTBMKBH dơng tính (100%) (với độ nhậy 100% và độ đặc hiệu 100%), thể UTBMKSH dơng tính (77,77%) số bệnh nhân nghiên cứu và không phát hiện thấy sự biểu lộ hoạt tính ở bệnh nhân UTVH thể UTBMSH và bệnh nhân ung th đầu, cổ khác không phải là UTVH. TàI LIệU THAM KHảO 1. Nguyễn Bá Đức (1998), Tình hình ung th ở Việt Nam và công tác phòng chống, Tài liệu chuyên đề những ngày khoa học Việt - Pháp về ung th tháng 3, tr.1 - 8. 2. Phan Thị Phi Phi, Trần Ngọc Dung (2000), Hoạt tính EBV và các biến đổi HLA ở ngời trong sự xuất hiện và phát triển UTVH, Tạp chí thông tin y dợc, Hội thảo quốc tế phòng chống ung th - Hà Nội 2000, tr.36 -41. 3. Chen Y.; Lii H.; Lu Z. (2000), Chemiluminescence detection of Epstein - Barr virus DNA with an oligonucleotit probe, Clin. Chim. Acta., 298(1 - 2), pp.45 - 53. 4. Lin C.T.; Kao H.J.; Lin J.L.; Chan W.Y.; Wu H.C.; Liang S.T. (2000), Response of nasopharyngeal carcinoma cells to EBV infection in vitro, Lab. Invest., Aug., 80(8), pp.1149 - 1160. 5. Lin J.C.; Tsai C.s.; Wang W.Y.; Jan J.S. (2000), Detection of circulating tumor cells in venous blood of nasopharyngeal carcinoma patients by nested reverse transcriptase -polymerase chain reaction, Kao Hsiung I Hsueh Ko Hsueh Tsa Chih, Jan., 16(1), pp.1 - 8. 6. Sheen T.S.; Huang Y.T.; Chang Y.L.; Ko J.Y. et al. (1999), Epstein-Barr virus - encoded latent membrane protein 1 co - expresses epidermal growth factor receptor in nasopharyngeal carcinoma, J. Cancer Res., dec., 90(12), pp.1285 - 1292. 7. Shim Y.S.; Kim C.W. and Lee W.K. (1998), Sequence variation of EBNA2 of Epstein - Barr virus isolates from Korea, Mol. Cell, 8, pp.226 - 232. 8. Shin Cho; Sung - Gyu Cho; Young - Shik Shim and Won - Keun Lee. (1998), Sequence analysis of the LMP1 gene of EBV isolates in Korea, J. Micr., Jun, 36(2), pp.130 - 138. 9. Shotelersuk K.; Khorprasert C.; Sakdikul S.; Pornthanakasem W.; Voravut N.; Mutirangura A. (2000), Epstein - Barr virus DNA in serum/plasma as a tumor marker for nasopharyngeal cancer, Clin. Cancer Res., Mar., 6(3), pp.1046 - 1051. Nhận xét sự tơng quan giữa hình thể răng cửa giữa hàm trên với hình dạng cung răng và với hình dạng khuôn mặt Đặng Thị Vỹ - Bệnh viện Răng Hàm Mặt TW Hà Nội Đặt vấn đề Sự chọn lựa răng giả sao cho phù hợp với bệnh nhân mất răng toàn bộ vẫn là một vấn đề thách thức đối với các nhà phục hình. Từ lâu các nhà nghiên cứu đã cố gắng đa ra các tiêu chí trong việc lựa chọn răng giả và cố gắng tìm ra mối liên quan về hình thể răng cửa với hình dạng khuôn mặt, giữa hình thể răng cửa với hình dạng cung răng, với hình dạng của vòm miệng Năm 1920, Williams [5] đã chứng minh rằng có sự liên quan chặt chẽ giữa hình dạng của khuôn mặt với răng cửa giữa hàm trên và của cung răng ở đa số mọi ngời, và mối tơng quan này đã đợc ứng dụng rộng rãi trong việc lựa chọn răng giả ở ngời mất răng toàn bộ. Sau đó, Nelson [1] đã tập hợp những dấu hiệu nêu rõ mối liên quan hình thái của cung răng, khuôn mặt và thân răng cửa và gọi đó là bộ ba Nelson (Triade de Nelson). Trên thế giới có rất nhiều tác giả đã đồng ý với thuyết này, nhng một số nghiên cứu lại có kết quả không ủng hộ cho thuyết Williams về mối tơng quan giữa hình thể răng cửa, hình dạng cung răng và hình dạng khuôn mặt. ở Việt Nam các nghiên cứu về vấn đề này còn rất ít, chính vì vậy chúng tôi thực hiện nghiên cứu này với hai mục tiêu sau: Xác định tỷ lệ các loại hình thể răng cửa giữa hàm trên Đánh giá sự tơng quan giữa hình thể răng cửa giữa hàm trên với hình dạng cung răng và với hình dạng khuôn mặt. đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 1. Đối tợng nghiên cứu. - 100 sinh viên - Trờng Đại Học Y Khoa Hà Nội, tuổi từ 18-25. * Tiêu chuẩn lựa chọn: - Có đủ các răng trên cung hàm. - Cha điều trị về chỉnh hình răng mặt. - Không có dị dạng hàm mặt, không có tiền sử chấn thơng hay phẫu thuật vùng hàm mặt. 2. Phơng pháp nghiên cứu. Là phơng pháp nghiên cứu cắt ngang mô tả đợc tiến hành theo các bớc sau: - Xác định hình dạng khuôn mặt. - Tiến hành lấy dấu, đổ mẫu nghiên cứu. - Phân tích trên mẫu: xác định hình thể răng cửa giữa hàm trên, hình dạng cung răng 2.1. Xác định hình dạng khuôn mặt: Đo các kích thớc sau: - Chiều rộng giữa hai xơng thái dơng (Ft-Ft): Ft là điểm ở phía ngoài nhất của xơng thái dơng (đợc xác định bằng cách đo khoảng cách lớn nhất của hai xơng thái dơng theo chiều ngang). - Chiều rộng giữa hai xơng gò má (Zyg-Zyg): Zyg là điểm ở phía ngoài nhất của cung gò má (đợc xác định bằng cách đo khoảng cách lớn nhất của hai cung gò má theo chiều ngang). - Chiều rộng hàm dới (Go-Go): Go là điểm ở phía ngoài của góc hàm xơng hàm dới. Điểm này đợc . 325-331. LIÊN QUAN GIữA MộT Số GEN EPSTEIN BAR VIRUS VớI CáC THể MÔ BệNH CủA UNG THƯ VòM HọNG Nghiêm đức thuận - Học viện Quân y Tóm tắt Tổ chức nghiên cứu ung th quốc tế đã xếp ung th vòm họng. cứu về mối liên quan giữa Epstein- Barr virus (EBV) với các thể mô bệnh học của ung th vòm họng. Bằng kỹ thuật sinh học phân tử: PCR, ISH, RT-PCR, đã phát hiện ra sự có mặt của genom EBV và. cứu về mối liên quan giữa Epstein- Barr virus (EBV) với các thể mô bệnh học của UTVH. Bằng kỹ thuật sinh học phân tử nh: PCR, ISH, RT- PCR, các tác giả đã phát hiện ra sự có mặt của genom EBV