I/ TÁCH CHIẾT VÀ ĐIỆN DI DNA Nguyên tắc: chiết tách DNA là cần thiết bởi các thực nghiệm của công nghệ gen đều tiến hành với DNA (hay ARN). AND chiết tách cần đảm bảo về độ tinh khiết và độ nguyên vẹn về cấu trúc với độ dài từ 50 – 100 kb để thực hiện được các khâu nghiên cứu tiếp theo trong công nghệ gen thực vật. Tùy thuộc mục đích nghiên cứu mà lựa chọn phương pháp chiết tách AND cho phù hợp. 1. Các phương pháp tách chiết axit nucleic Mục tiêu: thu nhận được các phân tủ axit nuclêic còn nguyên vẹn tối đa không bị đứt gãy bởi các tác nhân cơ học và hóa học. - Tác nhân cơ học ( bị đứt, gãy do nghiền, tắc mạch) - Tác nhân hóa học (bị cắt đứt do enzim nội bào như desoxyribonuclease – DNase và ribonuclease – Rnase) 1.1. Phương pháp tách chiết DNA - DNA có kích thước lớn do đó cần tránh các tác nhân gây đứt gãy. - DNA genome (ĐV, TV) sau khi tách chiết phải có kích thước lớn (15kb – 300kb). • Phương pháp tách chiết cơ bản gồm bốn bước chính sau : - Bước 1: phá vỡ màng tế bào và màng nhân. Ở tế bào ĐV hoặc TV, bằng cách nghiền tế bào hoặc mô trong nitơ lỏng – 196 0 C hoặc dùng hỗn hợp chất tẩy (SDS, Sarcosyl) và prôtêinase K. - Bước 2: loại bỏ thành phần không mong muốn trong mẫu như các prôtêin, polysacharide. Mẫu được bổ sung hỗn hợp dung dịch (phenol : chloroform : isoamine tỉ lệ 25:24:1), lắp mạnh cho đến khi dung dịch có dạng rắn sữa. Prôtêin sẽ biến tính và kết tủa. DNA, RNA được hòa tan trong nước 1 Sau li tâm cao tốc hỗn hợp dung dịch chia làm 3 pha: +Pha trên cùng là pha nước chứa DNA và RNA. +Pha giữa là pha chứa prôtêin và các chất thứ cấp bị kết tủa. +Pha dưới cùng là dung dịch phenol: chloroform: isoamine. - Bước 3: kết tủa acid nucleic + Tủa bằng ethanol tuyệt đối (tỉ lệ 2:1), tủa tốt nhất ở -20 0 C trong 30 phút hoặc 0 0 C qua đêm. Hầu như toàn bộ các phân tử acid nucleic đều kết tủa. + Tủa bằng isoprôpanol (tỉ lệ 1:1) ở 0 0 C, các phân tử DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị kết tủa. Sau đó li tâm ta sẽ thu được cặn (DNA, RNA), cặn được rửa bằng cồn 70% để loại bỏ muối và isoprôpanol còn lại. - Bước 4: hòa tan cặn (DNA, RNA) và xử lí loại bỏ RNA bằng enzyme Rnase. Sau đó kết tủa lại được DNA. 1.2. Phương pháp tách chiết RNA tổng số và mRNA - Chú ý : + Phân tử RNA không bền, dễ bị phân hủy bởi enzyme Rnase + Rnase lại có mặt khắp nơi (ở đầu ngón tay, trong nước bọt, trong không khí…). + Rnase là một enzyme có hoạt tính cao, bền nhiệt. Do đó thao tác tách chiết RNA tốt nhất là ở điều kiện vô trùng, tránh tiếp xúc bằng tay trần. • Phương pháp tách chiết RNA toàn phần cũng tương tự DNA. Chỉ khác là ở bước cuối cùng dùng enzyme Dnase loại bỏ DNA. • Tách chiết mRNA - Dựa vào phân tử mRNA có đuôi poly A - Do đó sau khi tách chiết được RNA toàn phần cho qua cột sắc ký ái lực ( oligod T-cenllulose hoặc các viên bi từ gắn đoạn oligode T ). - mRNA có đuôi poly A sẽ liên kết bổ sung với đoạn oligod T. 2 - Dùng dung dịch rửa cột. Các rRNA, tRNA sẽ bị rửa trôi chỉ còn mRNA được giữ lại. - Sau đó dùng dung dịch có nồng độ muối thaáp rửa cột hoặc li tâm sẽ thu được các phân tử mRNA. 2. Điện di AND Acid nucleic là các đại phân tử tích điện âm, trong điện trường có điện thế và cường độ thích hợp AND, ARN di chuyển từ cực âm đến cực dương. Để kiểm tra và xác định tính chất của AND, cần điện di AND trên thạch ( gel ). Phân tử DNA càng nhỏ càng di động nhanh. Tùy theo kích thước của phân tử AND mà người ta dùng các loại gel khác nhau : - Phân tử AND có dưới 500 đôi Nu Dùng polyacrylamid gel - Phân tử AND có dưới 500 – 10000 Nu Dùng Agarose gel - Phân tử AND có nhiều đôi Nu hơn Dùng Agarose gel có lỗ to hơn (Pulsed field agarose gel). Để quan sát hình ảnh DNA khi điện di, người ta nhuộm màu DNA bằng ethidium bromise, dưới ánh sáng tử ngoại, AND gắn với ethidium bromise sẽ phát sáng. Khi cho chạy ddiện di AND nghiên cứu thường có AND mẫu (marker) cùng chạy để so sánh, xácx định số lượng nu của đoạn AND. Phương pháp điện di AND còn được dùng để kiểm tra kết quả tách chiết AND. II. PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE ( polymerase chain reacion : PCR) Phương pháp này được Mullis và cộng sự đề xuất vào năm 1985 Mục đích phương pháp : phát hiện và nhân đoạn AND nhiều lần trong ống nghiệm. 3 Để thực hiện được phương pháp cần có : phân tử AND ban đầu, hai đoạn AND mồi ( primers ), mỗi môù gồm khoảng 20 base, hai mồi này gắn ở hai đầu của phân tử AND ban đầu : mồi ngược và mồi xuôi. Bốn loại Nu ( dATP, dCTP, dGTP, dTTP ), Taq polymerase : enzyme polymerase có tính chịu nhiệt độ cao : enzyme này được chiết từ loià vi khuẩn Thermus aquaticus. Phương pháp PCR thực hiện qua nhiều chu kì, môic chu kì gồm 3 giai đoạn: - Giai đoạn biến tính : ủ AND ban đầu ở nhiệt độ cao 92-95 0 C để tách AND thành sợi đơn. - Giai đoạn lai ghép : AND mồi được lai ghép với sợi đơn của ADN ban đầu. Thực hiện ở nhiệt độ 50-52 0 C. - Giai đoạn tổng hợp AND : Taq polymerase điều khiển sự gắn tiếp các nu vào sau AND mồi dựa AND ban đầu làm khuôn. Thực hiện ở nhiệt độ 70-72 0 C. Sau mỗi chu kì, từ một phân tử AND ban đầu tổng hợp nên hai phân tử AND, đến chu kì sau hai phân tử này lại làm khuôn để tổng hợp nên bốn phân tử DNA. Qua các giai đoạn đã nêu ở trên và cứ như vậy thực hiện tiếp các chu kì sau. Sau 30 chu kì từ một phân tử DNA ban đầu sẽ có 2 30 phân tử được tạo thành. Phương pháp PCR là một phương pháp rất nhạy, từ một lượng AND rất ít ban đầu, với cặp mồi tương ứng. đặc hiệu, sau khi áp dụng phương pháp PCR sẽ có một lượng lớn AND đủ dùng cho những chẩn đoán, nghiên cứu. Phương pháp PCR trong nhiều trường hợp đã thay thế cho phương pháp Southern blotting vì phương pháp này thực hiện nhanh, cần lượng AND ít. Từ phương pháp PCR ban đầu, ngày nay người ta đã đề xuất nhiều cải biến để nâng cao tính năng của phương pháp. - PCR lồng ( Nested PCR ): trong kỹ thuật này dùng hai cặp mồi, quá trình tự các nu lồng vào nhau ( có nghĩa rằng cặp mồi thứ hai có trình tự các nu nằm gtrong cặp mồi thứ nhất ). Đoạn AND được tổng hợp bởi cặp mồi thứ nhất được dùng làm khuôn mẫu cho PCR lần thứ hai. Điều này đã làm tăng độ đặc hiệu 4 của phản ứng PCR. Nó chỉ nhân lên đoạn đặc hiệu của AND lần một, đồng thời nó sẽ không nhân lên với nhũng sản phẩm không đặc hiệu của lần một. - Nhân đoạn AND nhân lượng huỳnh quang : QS – PCR ( quantitative – fluorescense – polymerase chain reaction ) : năm 1993, Mansield lần đầu tiên ứng dụng phương pháp nhân đoạn AND định lượng huỳnh quang – từ năm 1998 đến nay, một số phòng thí nghiệm đã thực hiện thành công kỹ thuật này trong chẩn đoán trước sinh hội chứng Down. Ví dụ : dựa vào kết quả định lượng gen DSCR1 ( gen được định vị ở vùng 21q21.1 – q22.2 liên quan đến dị tật tim và chậm phát triển tâm thần của hội chứng Down ), để xác định thai bị Down hoặc không. III. XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT TRONG PHÂN TỬ AND ( Sequencing ) Về nguyên lý người ta có thể xác định trình tự các Nu trong cả bộ gen (genome) nhưng trong điều kiện hiện nay người ta mới chỉ xác định trình tự Nu ở những đoạn AND xác định. Sau đây là hai phương pháp đã được ứng dụng để thực hiện xác định trình tự Nu : phương pháp hóa học và phương pháp enzyme học, trong đó phương pháp enzyme học được ứng dụng nhiều. 1. Phương pháp enzyme học (phương pháp Sanger) Nguyên lý của phương pháp này là dùng các dideoxyribonucleotid để tránh gắn thêm các Nu tiếp theo. Phương pháp gồm các bước : - Bước 1: phân tử cần xác định trình tự các Nu được dùng làm khuôn để tổng hợp nên một số đoạn AND cùng bắt đầu ở một vị trí giống nhau nhưng kết thúc ở vị trí khác nhau. Phản ứng tổng hợp có AND polymerase xúc tác in vitro. 5 Trong bốn ống nghiệm có các thành phần giống nhau là sợi AND khuôn, bốn loại Nu ( dATP, dCTP, dGTP, dTTP ). Đánh dấu phóng xạ 32 P cho một loại dideoxỷibonucleotid khác nhau. Ví dụ ống 1 cho ddATP, ống 2 cho ddGTP, ống 3 cho ddCTP và ống 4 cho ddTTP. - Bước 2: trong quá trình tổng hợp dùng dideoxyribonucleotid là Nu bị mất nhóm OH ở vị trí thứ 3 nên khi nó được gắn vào chuỗi AND thì không có sự gắn thêm Nu nữa. Hiện tượng này sẽ tạo ra một thang gồm các đoạn AND có chiều dài khác nhau hiện rõ khi điện di. - Bước 3: để xác định được vị trí của tất cả bốn loại Nu phải có sự kết hợp hình ảnh điện di của cả bốn ống thể hiện trên bốn làn với các băng khác nhau mà vị trí của từng băng đặc trưng cho vị trí từng Nu và đọc cũng theo thứ tự từ dưới lên. Tất cả các băng được đọc bằng phương pháp tự chụp hình phóng xạ hoặc đánh dấu huỳnh quang. 2. Phương pháp hóa học (phương pháp Maxam và Gilbert) Nguyên lý của phương pháp là dùng hóa chất liều ít để phá hủy một trong bốn loại Nu tạo nên chuỗi AND. Các bước của phương pháp như sau : - Bước 1: tách AND sợi kép thành sợi đơn, cho sợi đơn tiếp xúc với hóa chất để phá hủy một trong bốn loại base (ví dụ base A). Vì chỉ xử lý liều ít nên hóa chất chỉ phá hủy một trong số A có mặt. cách xử lý này tạo ra một số đoạn AND có chiều dài khác nhau phản ánh vị trí của A đã bị phá hủy theo trình tự chuỗi. - Bước 2: các đoạn AND này được điện di trên gel, được phát hiện bằng tự chụp hình phóng xạ: chỉ những đoạn AND đã được đánh dấu 32 P ở đầu 5’ mới được hiện rõ trên gel, kích thước của chúng biểu hiện khoảng cách từ đầu đánh dấu đến vị trí A cần xác định. 6 - Bước 3: để xác định vị trí của tất cả các Nu trong phân tử AND, cách xử lý như trên được thực hiện đồng thời với bốn ống cho bốn loại Nu thông thường T cho mẫu 1, C cho ống 2, G cho ống 3 và A cho ống 4. - Bước 4: đọc vị trí các Nu tương tự như phương pháp enzyme. Vị trí của 4 loại Nu biểu hiện bằng 4 làn băng, vị trí được đọc từ dưới lên vì các đoạn nhỏ khi điện di chạy nhanh hoen các đoạn có kích thước lớn. IV. ENZYME GIỚI HẠN VÀ CHỨC NĂNG CỦA ENZYME GIỚI HẠN 1. Enzyme giới hạn ( Restriction enzyme ) Enzyme giới hạn (restriction enzyme, RE) là một enzyme endonuclease có vị trí nhận biết điểm cắt DNA đặc hiệu. Những enzyme này phân hủy liên kết phosphodieste của bộ khung DNA mạch đôi mà không tổn hại đến bases. Các liên kết hóa học mà bị enzyme này cắt có thể được nối trở lại bẳng loại enzyme khác là các ligases, vì thế các đoạn giới hạn (sản phẩm của phản ứng cắt RE) mà bị cắt từ các nhiễm sắc thể hoặc gene khác nhau có thể được ghép cùng nhau nếu có trình tự đầu dính bổ sung với nhau. Nhiều kỹ thuật sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền đều dựa vào các enzyme giới hạn. Thuật ngữ giới hạn xuất phát từ việc các enzyme được khám pha từ các chủng E.coli mà đang hạn chế sự phát triển của các “thực khuẩn thể”. Vì thế enzyme giới hạn được cho là cơ chế của vi khuẩn nhằm ngăn chặn sự tấn công của virus và giúp loại bỏ các trình tự của virus. 2.Phân loại enzyme giới hạn Các nhà sinh hóa chia enzyme cắt giới hạn nõi chung thành 3 loại, gọi là Loại I, Loại II và Loại III. Đối với hai loại I và III, cả hoạt tính phân giải acid nucleic hay phân giải nhóm methyl đều thực hiện chung bởi một phức hợp enzyme lớn. mặc dù những enzyme thuộc hai loại này cũng nhận biết những trình tự DNA đặc hiệu, vị trí cắt thường cách xa vị trí nhận biết, có khi đến cả trăm base. 7 Chúng cũng cần ATP để hoạt động. những enzyme này bắt đầu bằng việc kiểm tra tình trạng methyl hóa của 2 adenine trong vùng nhận biết Nếu cả hai adenine đều không được methyl hóa (dấu hiệu cho thấy đây là DNA ngoại lai), phức hợp enzyme thay đổi cấu hình và thực hiện hoạt tính phân giải. Tuy nhiên nếu một trong hai adenine được methyl hóa, chứng tỏ là DNA của tế bào, enzyme khi đó sẽ thực hiện chức năng của một enzyme methyl hóa cho gốc adinine còn lại để duy trì sự ổn định cho DNA bộ gene. Với enzyme giới hạn loại II, chức năng phân giải cảu nó không liên quan đến chức năng methyl hoaá hay phân giải nhóm methyl, và vị trí cắt cũng nằm ngay bên trong hyay kế cạnh vị trí nhận biết. Ngày nay người ta biết rất nhiều enzyme khác nhau loại này và chúng là một trong những công cụ sinh học phân tử thiết yếu, đặc biệt thường gặp trong các ứng dụng dòng hóa gene hay phân tích DNA. 3. Vị trí điểm cắt Enzyme giới hạn chỉ cắt các trình tự lặp đối xứng khi đọc theo chiều 5’-3’ trên mạch DNA (palindrome) gọi là trình tự nhận biết. Vị trí điểm cắt của enzyme giới hạn có thể nằm trong hoặc ngoài trình tự nhận biết này. Một số enzyme tạo ra các vết cắt trên mạch đối diện tức thời, tạo ra các đoạn DNA “đầu bằng (blunt)”. Hầu hết các enzyme đều tạo ra các vết cắt hơi chéo nhau (hình chữ chi), tạo ra các “đầu dính “. Các enzyme giới hạn có ba chức năng quan trọng, mỗi chức năng cắt DNA bằng các cơ chế khác nhau. 4.Đoạn bổ sung và đoạn nối Vì các enzyme giới hạn khác nhau ở các trình tự nhận biết và điểm cắt, nên chiều dài và trình tự chính xác của đầu dính “nhô ra”, cũng như không biết nó có phải là mạch đầu 5’ hay đầu 3’ mà những phân tử nhô ra phụ thuộc vào enzyme tạo ra sản xuất ra nó. Tính bổ sung giữa những phần nhô ra và các trình 8 tự bổ sung cho phép hai phân đoạn có thể nhập lại với nhau hay “splice” bởi DNA ligase. Phân đoạn có đầu dính có thể được gắn không chỉ vói phân đoạn lúc mới bị cắt đầu tiên, mà còn với bất kỳ phân đoạn nào mà có đầu dính thích hợp. Kiến thức về điểm cắt cho phép các nhà sinh học phân tử dự đoán được cách mà các phân đoạn có thể gắn kết và từ đó, có thể chọn ra enzyme thích hợp. 5. Chức năng của enzyme giới hạn Enzyme giới hạn ở vi khuẩn có vai trò phân giải AND của vius khi vius thâm nhập vào vi khuẩn. Trong vi khuẩn có enzyme biến đổi để methyl hóa enzyme giới hạn làm cho enzyme giới hạn mất hoạt tính, không tác động đến AND của vi khuẩn. Chức năng cắt của enzyme giới hạn đã làm cho phân tử AND có thể bị cắt ra từng đoạn để phân tích. Sau khi bị cắt, các đoạn AND có thể được điện di trên agarose gel để xác định tính chất, hoặc dùng để tạo nên các phân tử ADN lai. V. LAI ACID NUCLEIC 1. ADN dò (DNA probes) Trước khi thực hiện các kỹ thuật lai acid nucleic người ta phải tạo ra các AND dò. ADN dò là một đoạn AND sợi đơn mà trình tự Nu, tính chất của chúng đã được biết. Một số loại AND dò đã được bán tại thị trường. Có tên như vậy vì AND dò có chức năng dò tìm những đoạn AND sợi đơn tương ứng trên các phân tử AND cần được phân tích, ví dụ các đoạn AND bất thường trong một số bệnh cần chẩn đoán. Phương pháp tạo AND dò: - Phương pháp sao mã ngược: Protein mRNA - cADN Ví dụ: - Phe – Trp – Met – Asp – Cys – Arg - 9 AND sợi đơn TTT – TCC – TAC – CTA – TCT – GCT – Hoặc (TTG) (CTG) (TCG) (GCC) - Phương pháp tổng hợp từ các Nu theo một trình tự đã biết. - Phương pháp tách chiết từ AND của bộ gen Trong phương pháp lai acid nucleic có sử dụng phương pháp lai các alen với các mẫu dò đặc hiệu (allele specific oligonucleotide), phương pháp thường dùng với các kyc thuật sau 2. Các phương pháp lai acid nucleic 1.1. Phương pháp lai trên pha rắn 1.1.1. Nguyên tắc Lai trên pha rắn có cùng nguyên tắc với lai trên pha lỏng. Điểm khác biệt ở đây là một trong hai trình tự bổ sung (thường là trình tự đích, tức trình tự cần tìm) được cố định trên một giá thể đặc biệt. Thuận lợi của việc sử dụng giá thể rắn là tạo dễ dàng trong thao tác và trong việc tách các trình tự không lai ra các phân tử lai, mặt khác còn ngăn sự tái bắt cặp giữa hai mạch của cùng một phân tử. bù lại, việc phân tích định lượng các phân tử lai sau đó kém chính xác và hiệu quả thấp. Thật vậy, vận tốc lai trên pha rắn thấp hơn gấp 10 lần so với vận tốc lai trên pha lỏng do một phần các nucleic acid được cố định trên giá thể bị che khuất , không tiếp xúc được với các trình tự bổ sung. 1.1.2. Các yếu tố kỹ thuật quan trọng trong các phương pháp lai trên pha rắn Giá thể rắn dùng cố định nucleic acid là các màng lai. Có hai loại màng lai : màng lai bằng nitrocellulose – là loại giá thể được sử dụng đầu tiên – hiện nay không còn thông dụng do hai nhược điểm : độ bền cơ học kém nên khó thao tác, không thể tách rời các phân tử lai trên màng để lai trở lại với một mẫu dò khác; 10 [...]... được xác định vì chúng làm thay đổi đoạn do enzyme giới hnạ tạo nên, làm thay đổi số lượng, chiều dài đoạn được cắt ví dụ: trên phân tử AND có ba vị trí cắt, như v y hai đoạn AND được tạo thành, nhưng nếu có hai vị trí cắt thì chỉ có một đoạn cắt được tạo thành Những sự thay đổi của các đoạn như v y có thể được nhận di n bằng phương pháp điện di Sự nhận di n của các đoạn n y phụ thuộc vào AND dò được... biến tính) sẽ được phân tách theo kích thước nhờ điện di truyền gel agarose có chứa các chất làm biến tính Các chất làm biến tính có tác dụng khiến các liên kết y u quy định cấu trúc bậc 2 của RNA không thể hình thành trở lại sau khi RNA đã biến tính Và do đó không cản trở sự di truyền cũng như sự phân tách các RNA trong gel - Sau đó RNA được chuyển lên màng lai - RNA cố định trên màng lai được đem... nghiệm với ống li tâm (5- 100 ml) hoặc li tâm ống nhỏ (0,5- 2 ml) M y li tâm lạnh - Tủ ấm, bình cách th y (tốt nhất là bình có lắc) - Tủ lạnh từ 40C - -200C hoặc -800C : t y mức độ bảo quản mẫu, có thể bảo quảntrong nitơ lỏng với thời gian dài hàng chục năm - Tủ ấm 370C, m y đo pH, m y lắc, m y s y khô, m y hấp ẩm (tiệt trùng), tủ s y với nhiệt độ cao, cân (có thể cân được g, mg) - Micropipet các loại:... bước chuyển VNTR sang gi y nitrocellulose nhưng sau đó lai AND đích với AND dò để phát hiện phân tử lai Ng y nay, sau khi phát hiện ra kỹ thuật PCR người ta có thể phát hiện trực tiếp các VNTR với các đôi mồi đặc hiệu Một số trang thiết bị cơ bản cho phòng thí nghiệm phân tử Để ứng dụng một số kỹ trhuật sinh học phân tử ứng dụng trong y học như tách chiết AND – PCR 1 Trang thiết bị cơ bản - M y li tâm... không mọc được trong môi trường đó vì đoạn AND mang tính chất kháng kháng sinh đã được thay bằng đoạn AND cảm ứng với kháng sinh - Bằng phương pháp vi sinh vật học, người ta c y truyền các khuẩn lạp mang tính chất cần nghiên cứu - Người ta cũng còn dùng phương pháp chuyển các khuẩn lạc từ đĩa c y petri sang gi y thấm, sau đó cho lai với AND dò sau khi đã làm biến tính AND đích, kết quả lai được đánh... qua điện di trên gel agarose - DNA được làm biến tính (biến thành hai mạch đơn) ngay trên gel rồi được chuyển lên một màng lai Trong quá trình chuyển, vị trí các đoạn được giữ nguyên - DNA cố định trên màng được đem lai với mẫu dò có dánh dấu phóng xạ Sau quá trình lai, người ta rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp chuyên biệt với DNA cố định trên màng - Cuối cùng, người ta dùng kyc thuật... dụng antibody protein có gắn phóng xạ hoặc gắn huỳnh quang để phát hiện một loại protein nào đó Western blot là kỹ thuật phát hiện protein bằng phương pháp điện di trên gel SDS-PAGE ( sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis), được dùng rộng rãi trong chẩn đoán các bệnh miễn dịch như chẩn đoán HIV, viêm gan virus… Western blot còn có tên gọi khác là Western blotting hay là phương... giả đã chứng minh rằng trong gia đình có bệnh hồng cầu liềm (HbS) enzyme cắt Hpa I đã cắt AND và tạo nên các đoạn có kích thước khấc nhau, một đoạn phân li với gen lành, đoạn khác phân li với gen HbS Kiến thức n y được dùng cho chẩn đoán trước sinh Hiện tượng đa hình chiều dài của các đoạn do enzyme giới hạn được di truyền theo quy luật Mendel RFLP là một phương pháp được dùng để lập bản đồ gen VII... kỹ thuật n y nhằm phân biệt được người n y với người khác, cá thể cùng loài dựa vào sự có mặt và phân bố của các vạch AND giống như khi dùng dấu vân da bàn tay - Nguyên lý của kỹ thuật: một dấu ấn AND có tên là VNTR (variable number of tamdem repeats) hay còn gọi là microsatellite, có 11 – 60 đôi base, dấu ấn n y có mặt nhắc đi nhắc lại nhiều lần trong bộ gen sự có mắt của đoạn AND dấu ấn n y đặc trưng... nuôi c y vì v y, sau 24- 48 giờ đã có kết quả Mẫu tế bào có thể l y sớm từ tuần 12 ( số lượng mẫu dịch ối 2- 5ml) Kỹ thuật FISH là một kỹ thuật di truyền tế bào – phân tử ssử dụng trình tự chuỗi ngắn AND sợi đơn (AND dò), các AND dò sẽ được lai với AND đích trên tiêu bản NST ở kỳ giữa hoặc gian kỳ dưới kính hiển vi huỳnh quang ta có thể phát hiện, định vị những chỗ AND dò lai với AND đích Nhờ v y, phát . quan sát hình ảnh DNA khi điện di, người ta nhuộm màu DNA bằng ethidium bromise, dưới ánh sáng tử ngoại, AND gắn với ethidium bromise sẽ phát sáng. Khi cho chạy ddiện di AND nghiên cứu thường có. cắt được tạo thành. Những sự thay đổi của các đoạn như vậy có thể được nhận di n bằng phương pháp điện di. Sự nhận di n của các đoạn này phụ thuộc vào AND dò được dùng, và phụ thuộc vào vị trí. sẽ thu được các phân tử mRNA. 2. Điện di AND Acid nucleic là các đại phân tử tích điện âm, trong điện trường có điện thế và cường độ thích hợp AND, ARN di chuyển từ cực âm đến cực dương. Để