1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Nitơ (N) là nguyên tố dinh dưỡng quan trọng không chỉ với cây trồng mà ngay cả đối với vi sinh vật. Nguồn dự trữ N trong tự nhiên rất lớn chỉ tính riêng trong không khí N chiếm khoảng 78,16% thể tích. Người ta ước tính trong bầu không khí bao trùm lên 1ha đất đai chứa khoảng 8 triệu tấn N, lượng N này có thể cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng hàng chục triệu năm nếu như cây trồng đồng hóa được chúng. Trong cơ thể các loại vi sinh vật chứa khoảng 4,1015 tỷ tấn N. Cây trồng cũng như các loại động vật và người không có khả năng đồng hóa trực tiếp nguồn N 2 tự do từ không khí (Nester et al.,2004). Nhưng tất cả nguồn N trên cây trồng đều không tự đồng hóa được mà phải nhờ vi sinh vật. Hàng năm cây trồng lấy đi từ đất hàng trăm triệu tấn N. Bằng cách bón phân con người đã trả lại cho đất khoảng hơn 40%, lượng thiếu hụt còn lại cơ bản được bổ xung bằng Nitơ do hoạt động sống của vi sinh vật. Vì vậy việc nghiên cứu sử dụng loại đạm sinh học này được xem là một giải pháp quan trọng trong nông nghiệp, đặc biệt trong sự phát triển để hướng tới một nền nông nghiệp sinh thái bền vững Tuy nhiên tồn tại một số vi sinh vật có khả năng biến N 2 trong khí quyển thành NH 3 cung cấp đạm cho cây mà chỉ cần một lượng năng lượng rất ít (3-5kcal/M). Chúng được gọi chung là các vi sinh vật cố định đạm. Phân bón vi sinh (Nitragin) ra đời tại Đức năm 1896 do Noble Hiltner sản xuất là công trình ứng dụng cơ chế cố định đạm sinh học đầu tiên và sau đó đã phát triển mạnh mẽ ra các nước khác. Phân vi sinh có nhiều ưu điểm so với phân hóa học, ngoài tác dụng nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng, tiết kiệm phân vô cơ, giảm chi phí sản suất thì phân vi sinh còn góp phần quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và phát triển nông nghiệp bền vững. Ở Việt Nam phân vi sinh đã được nghiên cứu từ những năm 1960. Tuy nhiên tình hình sản xuất phân vi sinh ở nước ta vẫn chưa đáp ứng đủ nhu cầu thực tiễn sản xuất của nền nông nghiệp, do quy mô sản xuất nhỏ, chất lượng sản phẩm chưa hoàn thiện và ổn định. Do đó, nghiên cứu để hoàn thiện và nâng cao chất lượng phân vi sinh là việc làm hết sức cần thiết. Trong đó, việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật là khâu đầu tiên và quan trọng trong quy trình tạo ra chế phẩm [7]. Trong vài chục năm gần đây ngày càng gia tăng các nghiên cứu vi khuẩn có ích chúng có thể nội sinh hay ngoại sinh có khả năng cố định N tự do hoặc phân giải các phosphate khó tan làm tăng năng xuất cây trồng đồng thời hạn chế được những độc tính của đất khi sử dụng phân bón hoá học…Đặc biệt là các nhóm vi khuẩn khu trú trong vùng rễ của cây trồng. Nhóm vi sinh vật này gọi là PGPR “Plant Growth Promoting Rhizobacteria” và có những dòng thể hiện ưu điểm mạnh như: Pseudomonas, Azospirillum, Burkhoderia, Bacillus, Enterobacter, Rhizobium, Erwinia, Serratia, Alcaligenes, Arthobacter, Acinetobacter và Flavobacterium. Nhóm vi khuẩn này có khả năng cố định N, tổng hợp nhiều chất kích thích sinh trưởng thực vật IAA, GA 3 … góp phần nâng cao độ phì nhiêu của đất, kích thích tăng trưởng, tăng năng suất cây trồng, hạn chế bón phân hóa học và phát triển nền nông nghiệp sinh thái bền vững [38] Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu, phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh trong rễ lúa, rễ cây lạc, cây cà phê Tuy nhiên, những nghiên cứu về vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây ngô còn rất ít. Đặc biệt, hiện nay chưa có một nghiên cứu nào về thành phần loài của vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây ngô trên địa bàn tỉnh Đăk Lăk. 2 Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây ngô tại một số địa điểm của tỉnh Đăk Lăk”. 2. Mục tiêu của đề tài - Phân lập và tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn cố định đạm trong rễ cây ngô ở Đăk Lăk. - Xây dựng qui trình nhân sinh khối một số chủnng vi khuẩn có hoạt tính cố định đạm cao làm phân sinh học chuyên dụng cho cây ngô. 3. Ý nghĩa của đề tài Ý nghĩa khoa học Xác định được một số chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, sống nội sinh trong rễ cây ngô. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của đề tài là cơ sở cho việc lựa chọn các chủng vi khuẩn sống nội sinh trong rễ cây ngô có hoạt tính cố định đạm cao để sản xuất phân vi sinh có hiệu quả, nâng cao độ phì nhiêu của đất, hạn chế bón phân hóa học, tăng năng suất cây ngô và góp phần phát triển một nền nông nghiệp sinh thái bền vững. 3 PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây ngô 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại thực vật Ngô có tên khoa học là Zea mays L (Zea: Từ Hi Lạp để chỉ cây ngũ cốc và từ Mays là từ “Mahix” tên gọi cây ngô của người bản địa da đỏ [9]. Cũng có thể Mays là từ “Maya” tên một bộ tộc da đỏ ở vùng Trung Mỹ - xuất xứ của cây ngô) [17]. Cây ngô thuộc: Ngành : Maopholiophyta Lớp : Liliopsida Bộ : Poales Chi : Zea Loài : Mays Bộ nhiễm sắc thể (2n=20). Có nhiều cách để người ta phân loại ngô, một trong các cách đó là dựa vào cấu trúc nội nhũ của hạt và hình thái bên ngoài của hạt. Ngô được phân thành các loài phụ: Ngô đá rắn, ngô răng ngựa, ngô nếp, ngô đường, ngô nổ, ngô bột, ngô nửa răng ngựa. Từ các loài phụ dựa vào màu hạt và màu lõi ngô được phân chia thành các thứ. Ngoài ra ngô còn được phân loại theo sinh thái học, nông học, thời gian sinh trưởng và thương phẩm. Có rất nhiều giả thuyết về nguồn gốc của ngô tại châu Mỹ như ngô là sản phẩm thuần dưỡng trực tiếp từ cỏ ngô (Zea mays ssp. parviglumis) một năm ở Trung Mỹ, có nguồn gốc từ khu vực thung lũng sông Balsas ở miền nam Mexico. Cũng có giả thuyết khác cho rằng ngô sinh ra từ quá trình lai ghép giữa ngô đã thuần hóa nhỏ (dạng thay đổi không đáng kể của ngô dại) với cỏ ngô thuộc đoạn Luxuriantes. Song điều quan trọng nhất nó đã hình thành vô số loài phụ, các thứ và nguồn dị hợp thể của cây ngô, các dạng cây và biến dạng của chúng đã tạo cho nhân loại một loài ngũ cốc có giá trị đứng cạnh lúa mì và lúa nước . 1.1.2. Đặc điểm hình thái cây ngô [9]. Cơ quan sinh dưỡng của ngô gồm rễ, thân và lá làm nhiệm vụ duy trì đời sống cá thể. Hình 1.1 Các bộ phận của cây ngô Rễ ngô: Trong quá trình sinh trưởng phát triển, cây ngô có 3 loại rễ. Đó là: rễ mầm, rễ đốt và rễ chân kiềng. Thân ngô: Thân đặc, đường kính thân khoảng 2 – 4cm tùy thuộc vào giống, mùa vụ và trình độ thâm canh, thân có nhiều lóng. Trong điều kiện bình thường ngô cao từ 1,8 – 2m, từ khi mọc đến khi cây có 6 – 7 lá thân phát triển chậm, từ lúc 8 – 9 lá đến nhú cờ, nở hoa cây phát triển nhanh và đến khi hoa đực phơi màu, bắp phun râu cây vẫn tiếp tục lớn. Sau khi thụ phấn thì thân ngừng phát triển. 4 Lá ngô: Gồm có lá mầm, lá thân, lá ngọn và lá bẹ. Lá được chia thành các bộ phận như: bẹ lá, phiến lá và thìa lá. Phiến lá rộng và dài, mép lá gợn sóng, có nhiều lông tơ. Gân lá song song. Lá mang bắp có chiều dài dài nhất. Hoa ngô: Gồm hoa đực (bông cờ) và hoa cái. Bông cờ có nhiều nhánh, mỗi nhánh có nhiều hoa xếp thành từng chùm, mỗi chùm có hai hoa, mỗi hoa có 3 nhị đực, mỗi nhị đực có 1 bao phấn, một bao phấn có hai ô, một ô chứa từ 1000 – 2500 hạt phấn. Hoa cái sinh ra từ nách lá gồm có lõi bắp có nhiều đốt ngắn có lá bao bi, mỗi hoa cái có một râu. Hoa cái mọc từng đôi trên hoa tự. Mỗi chùm hoa có hai hàng hoa nhưng hoa thứ hai bị thoái hóa chỉ một hoa hình thành hạt, một đôi chùm hoa cho hai hàng hạt nên hàng hạt ở trên bắp luôn luôn chẵn. Bắp ngô: Phát sinh từ mầm nách lá trên thân, số mầm nách lá trên cây ngô nhiều, nhưng chỉ 1-3 mầm nách trên cùng phát triển thành bắp. Tuỳ thuộc vào giống, điều kiện sinh thái, chăm bón, mật độ, mùa vụ… mà tỷ lệ cây 2-3 bắp, số hạt trên bắp, vị trí đóng bắp, thời gian phun râu, trỗ cờ…có khác nhau. Hạt ngô: Hạt được coi là cơ quan khởi đầu của cây. Thuộc loại quả dĩnh, gồm các bộ phận chính là vỏ hạt, lớp alơron, phôi và nội nhũ, phía dưới của hạt có gốc hạt là phần dính liền hạt với lõi ngô. Hạt ngô được hình thành gồm các giai đoạn: từ thụ phấn đến chín sữa là 10 – 15 ngày, từ chín sữa đến chín sáp là 15 – 20 ngày và từ chín sáp đến chín hoàn toàn là 10 – 15 ngày. 1.1.3. Yêu cầu sinh thái của cây ngô [17],[21] 1.1.3.1. Yêu cầu nhiệt độ Ngô là cây trồng ưa khí hậu ẩm, nhiệt độ thích hợp vào khoảng 20 0 C - 28 0 C. Nhiệt độ có thể ảnh hưởng đến thời gian sinh trưởng của cây ngô. Trong cả chu kỳ sống cũng như trong từng thời kỳ sinh trưởng phát triển của cây ngô cần một lượng tích nhiệt nhất định. Đủ lượng nhiệt cây mới sinh trưởng phát triển bình thường. Tùy vào từng giống khác nhau mà cần một lượng nhiệt khác nhau. Giống càng chín muộn thì cần lượng tích nhiệt càng cao. 1.1.3.2. Yêu cầu về ánh sáng Ngô là cây có nguồn gốc nhiệt đới thuộc nhóm cây ngày ngắn. Ánh sáng là yếu tố quan trọng cho sinh trưởng và phát triển của cây ngô, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tích luỹ chất dinh dưỡng và ảnh hưởng đến độ dài của quá trình sinh trưởng. Trung bình cần 12 giờ chiếu sáng/ngày. Nghiên cứu phản ứng của cây ngô với độ dài ngày cho thấy cây ngô hình thành các kiểu hình thái khác nhau. D.Azit đã chỉ ra rằng: Các giống ngô ở châu Âu do kết quả chọn lọc đã hoàn thành được chu kỳ ánh sáng trong điều kiện ngày dài, loại trừ được yêu cầu ngày ngắn. Cuperman và Razumov cho rằng rút ngắn thời gian chiếu sáng ban ngày đến 12 giời sẽ thúc đẩy sự trổ cờ và hình thành bắp. Ánh sáng ảnh hưởng đến sinh trưởng của cây ngô ở hai mặt là số giờ chiếu sáng và chất lượng ánh sáng. Những tia sáng dài đã kìm hãm sự sinh trưởng của cây ngô, các tia sáng ngắn lại thúc đẩy sự phát triển. Nghiên cứu của Cuperman đã xác định thời gian chiếu sáng và chất lượng ánh sáng đã gây ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của bắp và bông cờ của cây ngô. Trong điều kiện chiếu sáng bằng ánh sáng trắng và xanh lam thì sự phát triển của cây diễn ra nhanh nhất. Trong điều kiện chiếu sáng bằng ánh sáng đỏ thì sự phát triển của bông cờ hầu như không bị ảnh hưởng nhưng sự hình thành của bắp chậm lại. Ánh sáng lục kìm chế sự sinh trưởng và phát dục của bắp. 1.1.3.3. Yêu cầu về nước 5 Ngô là cây trồng cạn, bộ rễ ngô phát triển rất mạnh, hút nước khỏe và sử dụng tiết kiệm nước. Cây ngô sinh trưởng nhanh tạo ra sinh khối lớn. Do vậy cây cần một lượng nước rất lớn. Trung bình cây ngô trong một chu kỳ sống cần khoảng 200 lít nước để sinh trưởng và phát triển. Ở các thời kì sinh trưởng khác nhau cây ngô yêu cầu lượng mưa và lượng nước tưới khác nhau. Cây ngô không chịu được úng, độ ẩm của đất quá cao, lớn hơn 80% có ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng phát triển của cây ngô, đặc biệt là từ lúc cây mọc đến khi cây được 8 lá. Vào giai đoạn này chỉ cần ngập nước 1 – 2 ngày cây ngô cũng có thể bị chết úng. Ẩm độ thích hợp khoảng 70%. 1.1.3.4. Yêu cầu về đất Đất rất quan trọng trong sản xuất ngô, đất trồng ngô phải tơi xốp, nhiều mùn, hàm lượng dinh dưỡng cao, dễ thoát nước, tầng canh tác dày, pH từ 6 – 7, thuận lợi cho việc tưới nước vào mùa khô và tiêu nước vào mùa mưa. Hầu hết, ngô được trồng ở trên đất cạn, không ngập nước, đất có thành phần cơ giới nhẹ, đất cát pha, trên các loại đất vụ trước trồng các cây họ đậu, hoặc các cây phân xanh cải tạo đất. 1.1.3.5. Yêu cầu chế độ không khí trong đất Để thu hoạch sản lượng ngô cao, ngoài việc cung cấp nước và dinh dưỡng còn phải chú ý đến chế độ không khí ở trong đất. Chế độ không khí ảnh hưởng gián tiếp thông qua nhiều khâu khác nhau như là vi sinh vật, quá trình biến đổi hóa học trong đất. Cây ngô đặc biệt là rễ ngô phát triển tốt trong điều kiện háo khí, nếu đất chặt bí thiếu tơi xốp thì rễ ngô phát triển kém, ăn nông, rễ ngắn ít lông hút, khả năng hút dinh dưỡng khoáng và nước kém. Dẫn đến tình trạng cây ngô thiếu dinh dưỡng sẽ sinh trưởng, phát triển kém. 1.1.4. Vai trò các chất dinh dưỡng với cây ngô [17],[21] 1.1.4.1. Vai trò của đạm Đạm là yếu tố dinh dưỡng quan trọng nhất, đóng vai trò tạo năng suất và chất lượng của ngô, 66% đạm được tích luỹ trong hạt. Cây ngô hút đạm tăng dần từ khi cây có 3 – 4 lá tới trước trổ cờ. Ở nước ta, một số kết quả nghiên cứu cho thấy thời kỳ hút đạm mạnh nhất là 6 – 12 lá và trước khi trổ cờ, nếu các giai đoạn này mà thiếu đạm thì năng suất giảm rõ rệt. Triệu chứng thiếu đạm ở ngô: cây thấp, lá nhỏ có màu vàng, các lá già có vệt xém đỏ, cây sinh trưởng chậm, cằn cỗi, cờ ít, bắp nhỏ, năng suất thấp. 1.1.4.2. Vai trò của lân Lân có vai trò quan trọng với cây ngô tuy nhiên khả năng hút lân ở giai đoạn cây non lại rất yếu. Thời kỳ 3 – 4 lá, cây ngô hút không được nhiều lân, đó là thời kỳ khủng hoảng lân của ngô, nếu thiếu lân trong giai đoạn này sẽ làm giảm năng suất nghiêm trọng. Cây ngô hút nhiều lân nhất ( khoảng 62% tổng lượng lân yêu cầu) ở thời kỳ 6 – 12 lá sau đó giảm đi ở các thời kỳ sau. Triệu chứng thiếu lân của ngô biểu hiện bằng màu huyết dụ trên bẹ lá và gốc cây, trái cong queo. Trường hợp thiếu nặng lá sẽ chuyển vàng và chết. Hiện tượng này xảy ra ở lá già trước, sau đó chuyển sang lá non và phổ biến ở ngô vụ đông trong điều kiện thời tiết khắc nghiệt. 1.1.4.3.Vai trò của kali Kali có vai trò rất quan trọng tới sự sinh trưởng, phát triển và năng suất của ngô. Kali tích luỹ nhiều ở thân, lá (khoảng 80%) và tích luỹ trong hạt ít hơn. Cây ngô hút kali mạnh ngay từ giai đoạn sinh trưởng ban đầu. Từ khi cây mọc tới trổ cờ ngô đã hút khoảng 70% lượng kali cây cần. 6 Thiếu kali, protein và sắt sẽ tích tụ gây cản trở quá trình vận chuyển chất hữu cơ. Thiếu kali là nguyên nhân rễ ngang phát triển mạnh, rễ ăn sâu kém phát triển, do đó cây dễ đổ. Thiếu kali thể hiện ở các triệu chứng như chuyển nâu và khô dọc theo mép và chóp lá, bắp nhỏ, nhiều hạt lép ở đầu bắp (bắp đuôi chuột) và năng suất thấp. 1.1.4.4.Vai trò các nguyên tố vi lượng Đối với cây ngô, các chất vi lượng thường thiếu là kẽm và molypđen. Thiếu kẽm lá có màu trắng (bệnh bạch tạng), giữa các gân lá có những dải màu vàng sáng, các lóng ngắn lại. Hiện tượng thiếu kẽm thường xảy ra trên đất kiềm, nghèo mùn, đất giàu lân dễ tiêu hay bón quá nhiều lân. Thiếu molypđen lá chuyển xanh nhạt, lá non teo lại và héo, nặng hơn lá ngọn không bung ra được, có nhiều vết xém vàng. 1.1.5.Vai trò cây ngô trong nền kinh tế Ngô làm lương thực cho con người: Ngô là cây lương thực nuôi sống gần 1/3 dân số trên toàn thế giới, tất cả các nước trồng ngô nói chung đều ăn ngô ở mức độ khác nhau. Toàn thế giới sử dụng 21% sản lượng ngô làm lương thực cho người. Các nước ở Trung Mỹ, Nam Á và Châu Phi sử dụng ngô làm lương thực chính. Các nước Đông Nam Phi sử dụng 85% sản lượng ngô làm lương thực cho người, Tây Trung Phi 80%, Bắc Phi 42%, Tây Á 27%, Nam Á 75%, Đông Nam Á và Thái Bình Dương 39%, Đông Á 30%, Trung Mỹ và các vùng Caribe 61% Nếu như ở Châu Âu khẩu phần ăn cơ bản là: bánh mỳ, khoai tây, sữa; Châu Á: cơm (gạo), cá, rau xanh (canh) thì châu Mỹ La Tinh là bánh ngô, đậu đỗ và ớt. Vì vậy, trên phạm vi thế giới, ngô vẫn còn là cây lương thực rất quan trọng, vì ngô rất phong phú các chất dinh dưỡng hơn lúa mỳ và gạo. Ngô làm thức ăn gia súc: Ngô là thức ăn gia súc quan trọng nhất hiện nay. Hầu như 70% chất tinh trong thức ăn tổng hợp là từ ngô, điều đó phổ biến trên toàn thế giới. Ngoài việc cung cấp chất tinh, cây ngô còn là thức ăn xanh và ủ chua lí tưởng cho đại gia súc. Những năm gần đây cây ngô còn là cây thực phẩm, người ta dùng bắp ngô bao tử làm rau cao cấp. Sở dĩ, ngô rau được dùng vì nó sạch và có hàm lượng dinh dưỡng cao. Các thể loại ngô nếp, ngô đường (ngô ngọt) được dùng làm thức ăn tươi (luộc, nướng) hoặc đóng hộp làm thực phẩm xuất khẩu. Ngô là nguyên liệu chính cho các nhà máy thức ăn gia súc tổng hợp, ngô còn là nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất rượu, tinh bột, bánh kẹo… Người ta đã sản xuất ra các mặt hàng khác nhau cho các ngành công nghiệp lương thực - thực phẩm, công nghiệp dược và công nghiệp nhẹ. Ngô cũng là hàng hoá xuất khẩu. Hàng năm lượng ngô xuất khẩu khoảng 70 triệu tấn. Đó là nguồn lợi lớn của các nước xuất khẩu. Các nước xuất khẩu chính là Mỹ, Pháp, Argentina, Trung Quốc, Thái Lan. Các nước nhập chính là Nhật Bản, Hàn Quốc, Liên Xô cũ, Châu Phi, Mexico… [9]. Ngô vừa là cây lương thực, vừa là cây thức ăn cho gia súc. Chính vì vậy diện tích trồng ngô trên thế giới tăng không ngừng. Năm 1979 diện tích trồng ngô chỉ đạt khoảng 127 triệu ha với tổng sản lượng là 475,4 triệu tấn, đến năm 2007 diện tích trồng ngô đạt 145,1 triệu ha với sản lượng 705,3 triệu tấn (theo số liệu thống kê của FAO, 2008). Ở Việt Nam, cây ngô đã được trồng cách đây khoảng 300 năm và được trồng trên những điều kiện sinh thái khác nhau của cả nước. ĐăkLak là vùng có sản lượng bắp cao nhất nước đạt 622 nghìn tấn, kế đến là Sơn La, Đồng Nai với sản lượng lần lượt là 506 và 305,3 nghìn tấn mỗi năm. 7 Nguồn: www.asiacreative.vn Biểu đồ: 1.1 Sản lượng bắp của Việt Nam 2013 Hàm lượng chất dinh dưỡng của ngô tùy thuộc vào từng giống, đặc biệt là các giống ngô nếp địa phương tuy năng suất không cao nhưng chất lượng của hạt ngô tốt phù hợp với thị hiếu của người tiêu dùng. 1.2. Tổng quan về vi khuẩn cố định Nitơ (N ) 1.2.1. Nitơ và quá trình cố định nitơ Nitơ phân tử được cấu tạo từ 2 nguyên tử nitơ liên kết với nhau bằng liên kết III bền vững N ≡ N. Nitơ trong khí quyển tồn tại dưới dạng khí N 2 và chiếm khoảng 79% thể tích không khí. Mặc dù sống trong "đại dương nitơ" nhưng thực vật nói chung không có khả năng đồng hóa trực tiếp được. N 2 là phân tử rất khó phản ứng với các phân tử khác để tạo thành hợp chất. Liên kết N ≡ N có năng lượng liên kết rất lớn nên muốn xảy ra phản ứng giữa N 2 với các nguyên tố khác thành các hợp chất vô cơ, trong kỹ thuật người ta phải dùng lượng năng lượng rất cao. Trong khi đó nhóm vi khuẩn cố định nitơ có thể biến khí nitơ thành hợp chất đạm ở các điều kiện bình thường về nhiệt độ và áp suất. Vậy cơ chế cố định của nó là như thế nào. Đó là điều các nhà khoa học nghiên cứu trong lĩnh vực này hết sức quan tâm. Từ trước tới nay có rất nhiều giả thiết về cơ chế của quá trình cố định đạm sinh học. Đa số nhà nghiên cứu đều thống nhất cho rằng: Quá trình cố định nitơ sinh học là một quá trình khử N 2 thành NH 3 dưới tác dụng của enzyme Nitrogenaza sinh ra bởi vi sinh vật bằng phương trình: Năm 1961 - 1962, người ta đã tách từ Clostridium pasteurrianum hai tiểu phần hoạt hóa H 2 và N 2 . Sau này người ta tìm thấy ở Azotobacter có các tiểu phần, 1 phần gồm protein và Fe, 1 thành phần gồm protein, Fe, Mo. Nguồn H 2 để khử N 2 có thể là hydro phân tử (H 2 ). Trong trường hợp này thì dưới tác dụng của enzyme hydrogenase, điện tử được chuyền theo hệ thống. 8 Nguồn cho điện tử và hydro là acid pyruvic. Đáng chú ý là trong quá trình chuyền điện tử có sự tham gia tích cực của feredocine (Fd). Fd là cầu nối giữa 2 hệ enzyme hydrogenase và nitrogenase để cố định N2. Sự cố định N 2 của vi khuẩn nốt sần có thể xảy ra theo sơ đồ phức tạp hơn. Trong các nốt sần có một chất có bản chất hem rất giống với hemoglobin trong máu gọi là leghemoglobin. Nó dễ liên kết với O 2 để biến thành oxyhemoglobin. Leghemoglobin chỉ được tạo nên khi vi khuẩn sống cộng sinh với cây bộ đậu, còn khi nuôi cấy tinh khiết các Rhizobium sẽ không tạo leghemoglobin và không cố định được N 2 . Mối quan hệ giữa thực vật và vi khuẩn trong quá trình cố định nitơ cộng sinh có thể biểu diễn bởi sơ đồ sau: 1.2.2. Vi khuẩn cố định N Vi sinh vật cố định N có một vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn N 2 và cung cấp một lượng N đáng kể cho cây trồng. Theo tính toán của các nhà khoa học, các nhóm vi sinh vật cố định đạm BNF (Biological nitrogen fixation) có thể cung cấp tới 240 x 10 6 tấn N/năm trên cả hành tinh, gấp 6 lần lượng N mà cả thế giới sản xuất bằng con đường hóa học. Vi sinh vật cố định N là các nhóm vi sinh vật có khả năng chuyển hóa khí N 2 dồi dào trong không khí (79%) thành dạng NH 4 + cung cấp cho cây. Vi khuẩn cố định N gồm có hai nhóm lớn:[7]. - Vi khuẩn cố định N tự do gồm: + Vi khuẩn cố định N tự do hiếu khí: Azotobacter và Beijerinskia sp. + Vi khuẩn cố định N kỵ khí: Vi khuẩn thuộc nhóm Clostridium. 9 - Vi khuẩn cố định N cộng sinh như cộng sinh với rễ cây họ đậu Rhizobium, cộng sinh với rễ lúa Azoarcus, 1.2.2.1. Vi khuẩn cố định N tự do 1.2.2.2. Vi khuẩn cố định N tự do hiếu khí Nhóm này gồm hai chi chính là Beijerinskia sp và Azotobacter sp.[7] - Beijerinskia sp. Được phân lập bởi Starkey (1939), là loại có đặc điểm giống với Azotobacter sp. Tế bào có hình dạng thay đổi như hình cầu, hình que, hình bầu dục. Beijerinski là vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử. Có khả năng sống tốt trong môi trường axit ( pH=3). Vi khuẩn có khả năng cố định được 16 - 20 mg N khi đồng hóa hết 1g dinh dưỡng Carbon. Ngoài khả năng cố định N chúng còn có khả năng tổng hợp các chất kích thích sinh trưởng cho cây trồng. - Azotobacter sp. Là vi khuẩn gram âm, không sinh bào tử có khả năng cố định N tự do. Khi chưa trưởng thành tế bào thường có hình que, sinh sản bằng cách phân cắt, di chuyển nhờ tiêm mao. Khi trưởng thành mất khả năng di chuyển, kích thước thu nhỏ thành dạng cầu được bao bọc bởi một lớp nhầy. Khuẩn lạc của Azotobacter có dạng cầu lồi, nhẵn bóng, có khi nhăn nheo. Các nòi phân lập từ tự nhiên có khả năng cố định 10 - 15mg N khi tiêu thụ hết 1g dinh dưỡng Carbon. Một số nòi tuyển chọn có khả năng cố định tới 30mg/1g dinh dưỡng Carbon. Trong đất, Azotobacter tập trung ở vùng đất xung quanh rễ cây. Ngoài khả năng cung cấp dinh dưỡng N cho cây nó còn có khả năng kích thích nảy mầm, kích thích sinh trưởng. Trong đất, Azotobacter thường phổ biến các nòi sau: + Azotobacter chrococum: Kích thước tế bào 2,0 x 3,1 micromet, có khả năng di động khi còn non. Khi già hình thành nang xác. Khuẩn lạc có màu nâu hoặc đen khi về già, không khuếch tán ra môi trường. + Azotobacter beijerinckii: Có kích thước 2,4 x 4,6 micromet. Không có khả năng di động và hình thành nang xác. Khuẩn lạc khi già có màu nâu sáng, sắc tố không khuếch tán ra môi trưòng nuôi cấy. + Azotobacter vinelandii: Tế bào có kích thước 1,5 x 3,4 micromet, có khả năng di động và hình thành nang xác. Khuẩn lạc màu lục huỳnh quang, sắc tố khuếch tán vào môi trường. + Azotobacter agilis: Tế bào có kích thước 2,8 x 3,3 micromet, có khả năng di động, không hình thành nang xác, khuẩn lạc màu vàng lục huỳnh quang, sắc tố khuếch tán vào môi trường [7]. 1.2.2.3. Vi khuẩn cố định N tự do kỵ khí Clostridium Clostridium được phát hiện lần đầu tiên bởi Vinogradxki (1893). Vi khuẩn Clostridium có kích thước 2,5 – 7,5 x 0,7 – 1,3 micromet, có thể đứng riêng rẽ hoặc kẹp đôi thành chuỗi ngắn. Bào tử hình bầu dục, có khả năng chịu được nhiệt độ cao và khô hạn. Clostridium có khả năng tích lũy được 10 - 15mg N phân tử khi đồng hóa hết 1g đường Carbon [7]. 1.2.3. Vi khuẩn cố định N cộng sinh 1.2.3.1. Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây họ Đậu Vi khuẩn cố định N cộng sinh với cây họ đậu còn gọi là vi khuẩn nốt sần. Chúng hình thành các nốt sần với rễ cây họ đậu như cây đậu tương, lạc, điền thanh, muồng, cốt khí, trinh 10 nữ, chúng sử dụng dinh dưỡng carbon của cây và cố định N không khí để sử dụng và cung cấp một phần cho cây chủ. Gồm có: Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium và Sinorhizobium[11]. - Rhizobium Năm 1868, nhà khoa học Hà Lan M.W.Beijrinck đã phân lập được loài vi khuẩn sống cộng sinh trong nốt sần ở rễ một cây thuộc bộ đậu, ông đã đặt tên là Basilusradicicola. Năm 1889, vi khuẩn này được xếp vào chi Rhizobium ( B.Frank, 1989). Trên môi trường đặc, chúng có khuẩn lạc trơn bóng, nhầy, khi còn non có khả năng di động nhờ tiêm mao, khi tế bào già trở nên bất động. Rhizobium thuộc loại hảo khí ưa pH trung tính hoặc kiềm ( pH từ 6,5 - 7,5), nhiệt độ thích hợp 24 – 26 0 C. Chúng xâm nhiễm vào rễ cây bộ đậu thông qua lông hút, đôi khi qua vết thương ở vỏ rễ. Dưới ảnh hưởng của vi khuẩn, rễ tiết ra enzyme polyalacturonase phân huỷ thành lông hút tạo điều kiện cho vi khuẩn xâm nhập vào rễ. Theo tính toán của các nhà khoa học nhóm vi khuẩn này có khả năng cung cấp cho cây 80 -120kg N/ ha. - Bradyrhizobium Vi khuẩn hình que, kích thước trung bình 0,5 - 0,9 x 1,2 - 3,0 µm, thường chứa chất dự trữ PHB. Trên môi trường đặc, khuẩn lạc của chúng có dạng trơn, bóng, nhầy, không màu. Bradyrhizobium là vi khuẩn hiếu khí, tuy nhiên chúng có thể phát triển được ngay trong trường hợp chỉ có một áp lực oxy rất thấp khoảng 0,001atm. Chúng phát triển thích hợp ở pH= 6,5 - 7,5. Nhiệt độ phát triển thích hợp là 24 – 26 0 C, nhiệt độ 37 0 C sự phát triển của chúng bị cản trở một cách rõ rệt. - Azorhizobium Azorhizobium Là một giống mới được đề nghị với một loài là Azorhizobium caulinodans chính là các vi khuẩn cộng sinh ở rễ và thân của Sesbania rostrata - Sinorhizobium Gồm các vi khuẩn phát triển nhanh, cộng sinh ở nốt rễ cây đậu nành được phân lập từ Trung Quốc. Giống Sinorhizobium gồm có 2 loài là Sinorhizobium fredii và Sinorhizobium xinjiangensis. 1.2.3.2. Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây không thuộc họ đậu - Vi khuẩn lam (Cyanobacteria): Một số vi khuẩn lam tự dưỡng đạm hay thanh tảo sống chung với nhiều vi sinh vật chân hạch, từ các loại nấm cho đến các thực vật hạt kín [7]. - Azospirillum Phát hiện năm 1974, là vi khuẩn Gram âm có dạng xoắn, sống tự do, đường kính 1µm, dài 2,1 - 3,8µm chuyển động trong môi trường lỏng bởi một tiêm mao dài ở đầu ( polan flagellum), trong môi trường đặc ở 30 0 C nhiều tiêm mao bên (lateral flagellum) ngắn hơn cũng được thành lập. Trong những năm gần đây người ta phát hiện nhiều nhóm vi khuẩn này sống ở trong vùng rễ, trong rễ cây, thân cây và lá các cây không thuộc họ đậu như lúa, bắp, mía, sorghum, và một số loại cỏ. Azospirillum giúp tăng năng suất lúa từ 32 - 81% ở điều kiện nhà lưới (Mirza và ctv, 2000; Malik và ctv, 2002). Nhưng ở điều kiện ngoài đồng vi khuẩn nầy chỉ làm tăng năng suất lúa được 10 - 30% [11]. Azospirillum tăng sinh ở cả trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí với sự hiện diện hoặc không có hợp chất nitơ trong môi trường, nhưng thích hợp là vi hiếu khí. Nhiệt độ tối hảo từ 35 - 37 0 C. Một số dòng Azospirillum là những vi sinh vật tự dưỡng không bắt buộc. Vi khuẩn Azospirillum phát triển tốt trên muối của những acid hữu cơ như malate, succinate, hay [...]... vi khuẩn cố định đạm cộng sinh trong rễ cây ngô Tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm bằng nghiên cứu thử nghiệm trên cây ngô Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng vi khuẩn nội sinh được tuyển chọn 2.2 Vật liệu và địa điểm nghiên cứu 2.2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu * Vật liệu: - Các chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh được phân lập từ rễ cây ngô trong. .. Nghiên cứu trong nước Ở Vi t Nam, phân vi sinh vật cố định đạm ở cây họ đậu và phân vi sinh vật phân giải lân đã được nghiên cứu từ năm 1960 Đến năm 1987, phân Nitragin trên nền đất mang than bùn mới được hoàn thiện Đến 1991 đã có hơn 10 đơn vị trong cả nước tập trung nghiên cứu phân vi sinh vật Các nhà khoa học đã phân lập được nhiều chủng vi sinh vật cố định đạm và một số vi sinh vật phân giải lân... tố (Nguyễn Ngọc Đệ, 2008.) Hàm lượng đạm tổng số có trong mẫu lá là một trong những tiêu chí quan trọng để tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm Bảng ANOVA (CV=3,99%), với mức ý nghĩa 0,01 Bảng trác nghiệm phân hạng cho thấy: Đa số các nghiệm thức xử lý hạt với các chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh làm cho hàm lượng đạm tổng số tích lũy trong lá tăng 5-45% so với đối chứng... với đối chứng 0,18% Như vậy sự khu trú của các chủng vi khuẩn cố định đạm trong hệ rễ của cây không chỉ giúp cây trồng cố định đạm mà còn có tác dụng phân giải các phosphat khó tan cung cấp nguồn phosphat cho cây sử dụng Bảng trắc nghiệm phân hạng cho thấy đa số các cây ngô có xử lý hạt với các chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh làm tăng hàm lượng lân tổng số lên gấp 1,1 - 1.8 lần tăng tích luỹ P tổng... được vi khuẩn tổng hợp và tiết ra môi trường bằng phương pháp so màu Salkowski ở bước sóng 530 nm, thí nghiệm được lặp lại 3 lần 2.3.5 Phương pháp xác định khả năng cố định N của các chủng vi khuẩn Đánh giá hoạt tính cố định đạm của các chủng vi khuẩn nội sinh phân lập được dựa trên N tổng số có trong lá và các chỉ tiêu sinh trưởng của cây ngô N tổng số có trong lá và các chỉ tiêu sinh trưởng của cây ngô. .. tế bào/ml Thí nghiệm gồm nghiệm thức không bón phân nhiễm với các chủng vi khuẩn nội sinh phân lập được và đối chứng là không bón phân không nhiễm vi khuẩn Khi cây ngô được 45 ngày chúng tôi tiến hành lấy kết quả Kết quả được thể hiện trong bảng 3.5 3.4.1 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn nội sinh đến số lượng lá của cây ngô trong bầu đất Bảng trắc nghiệm phân hạng Duncan’s Multiple Rang Test cho thấy... chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh làm cho khối lượng sinh khối tươi của cây tăng gấp 1,2-2,0 lần tức tăng từ 12,5-53,5% so với đối chứng Cụ thể chủng C23 có khối lượng sinh khối tươi /cây cao nhất 206,90g, chủng C27 cho khối lượng sinh khối tươi thấp nhất 99,36g /cây so với đối chứng 99,97g /cây 3.4.8 Ảnh hưởng của các chủng vi khuẩn nội sinh đến hàm lượng sinh khối khô của cây ngô trong bầu đất Bảng... đa số nghiệm thức nhiễm các chủng vi khuẩn cố định đạm và không bón phân cho số lượng lá tăng từ 23-33% số lá trên cây, chiều dài lá tăng từ 8-45%, chiều cao cây tăng từ 10-60%, và đường kính gốc thân tăng 8 - 44% so với đối chứng không nhiễm vi khuẩn không bón phân Chứng tỏ các chủng vi khuẩn nội sinh này có ảnh hưởng tích cực lên sự phát triển của cây ngô Bên cạnh đó kết quả thí nghiệm trong. .. ruộng 13 chủng vi khuẩn nội sinh này cho nồng độ IAA từ 6,24-13,51mg/ml và có phản ứng tốt với sự sinh trưởng của cây ngô như: Tăng tích lũy cholrophyll, N tổng số , P tổng số Vì vậy chúng tôi lựa chọn các chủng này cho những nghiên cứu tiếp theo 3.7 Kết quả tuyển chọn các chủng vi khuẩn cố định đạm bằng phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn nội sinh mang gen nifH Các chủng vi khuẩn đã được tuyển... được phân loại sơ bộ theo hình thái, màu sắc và kích thước Kết quả phân loại khuẩn lạc được ghi nhận trong bảng 3.1 cho thấy hầu hết các chủng có đặc điểm chung là khuẩn lạc tròn, bìa khuẩn lạc nguyên, kích thước từ 1-2 mm, màu trắng sữa đến vàng nhạt khi sinh trưởng trên môi trường Nfb đặc Bảng 3.1 Hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn cố định N nội sinh trong rễ cây ngô Chủng STT Vi Đặc điểm hình thái khuẩn . Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố định đạm nội sinh trong rễ cây ngô tại một số địa điểm của tỉnh Đăk Lăk”. 2. Mục tiêu của đề tài - Phân lập và tuyển chọn được một số chủng vi. tả đặc điểm sinh học và định danh bằng sinh học phân tử một số chủng vi khuẩn cố định đạm cộng sinh trong rễ cây ngô. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm bằng nghiên. học Xác định được một số chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, sống nội sinh trong rễ cây ngô. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả của đề tài là cơ sở cho vi c lựa chọn các chủng vi khuẩn sống nội sinh trong