TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y TẾ CÔNG CỘNG www.hsph.edu.vn ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E. coli BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN www.hsph.edu.vn MỤC TIÊU • Trình bày được nguyên lý của phương pháp MPN (Most Probable Number) • Trình bày được phạm vi áp dụng của thử nghiệm • Nêu và thực hiện được các bước của qui trình định lượng Coliforms và E. coli bằng phương pháp MPN www.hsph.edu.vn PHƯƠNG PHÁP MPN (Phương pháp số có xác suất cao nhất) www.hsph.edu.vn Phương pháp MPN • Đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong một thể tích mẫu • Được thực hiện dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố VSV trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu • Thông thường các độ pha loãng được chọn liên tiếp nhau www.hsph.edu.vn Phương pháp MPN (tt) • Mỗi độ pha loãng được cấy lặp lại nhiều lần (3 lần hoặc 5 lần) • Kết quả thống kê tính trên số lần dương tính của mỗi độ pha • Định lượng được mật độ vi sinh vật thấp trong một thể tích mẫu lớn www.hsph.edu.vn Phương pháp MPN (tt) www.hsph.edu.vn Phương pháp MPN (tt) B1: Chuẩn bị các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng VSV cần định lượng www.hsph.edu.vn Phương pháp MPN (tt) B2: Cấy một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp B3: Ủ mẫu đã cấy ở nhệt độ thích hợp www.hsph.edu.vn Phương pháp MPN (tt) B4: Ghi nhận sự phát triển của vi sinh vật trong MT B5: ghi nhận số ống dương tính 3 www.hsph.edu.vn Lựa chọn các độ pha loãng Thứ tự ưu tiên chọn từ 1→4 1.Chọn nồng độ thấp nhất có tất cả ống (+) → chọn 2 nồng độ nhỏ hơn để tính, ví dụ1; nếu có nhiều hơn 1 trong 3 nồng độ được chọn này không có ống (+) → chọn nồng độ lớn nhất không có ống (+) và 2 nồng độ lớn hơn để tính, ví dụ 4, 5 2.Nếu các nồng độ nhỏ hơn nồng độ lớn nhất có tất cả các ống (+) → chọn 3 nồng độ mẫu nhỏ nhất trong cả dãy. Ví dụ 2 3.Chọn 3 nồng độ thấp nhất trong cả dãy, trong đó có ít nhất 1 ống (+). Ví dụ 3 4.Chỉ nồng độ đầu tiên có ống (+) chọn thêm 2 nồng độ pha loãng tiếp theo để tính ngay cả khi 2 nồng độ này không có ống (+) nào, ví dụ 6, 7 [...].. .Phương pháp MPN (tt) 3 KẾT QUẢ B6: Tra bảng Mac Crady để suy ra mật độ VSV www.hsph.edu.vn Phương pháp MPN (tt) Kết quả: • Số VSV (MPN/ g) = kết quả tra bảng x (f/10) • f: độ pha loãng thấp nhất được chọn (10n) www.hsph.edu.vn MPN calculator software www.hsph.edu.vn PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS/ E coli GIẢ ĐỊNH BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN www.hsph.edu.vn Coliforms • • • • Trực khuẩn... coli là một Coliforms phân www.hsph.edu.vn Phạm vi áp dụng • Thực phẩm, thức ăn chăn nuôi • Các mẫu môi trường khu vực sản xuất và xử lý thực phẩm www.hsph.edu.vn Nguyên lý của phương pháp • Coliforms: Định lượng vi sinh vật lên men lactose sinh khí khi nuôi cấy trong môi trường tăng sinh chọn lọc ở 30oC, 37oC và phù hợp trong phép thử khẳng định • E coli: là nhóm coliforms phân, được xác định dựa trên... acid và sinh hơi ở 370C trong 24 – 48 giờ www.hsph.edu.vn Coliforms (tt) • Gồm 4 giống: E coli Citrobacter Klebsiella Enterobacter • Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị vệ sinh, trong đó có vệ sinh ATTP www.hsph.edu.vn Coliforms (tt) • Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi trong khoảng 24h khi ủ ở 440C trong môi trường canh EC • Coliform phân: Coliforms. .. www.hsph.edu.vn Coliforms Bước 4: Nuôi cấy trên môi trường chọn lọc 2 • Chọn các ống môi trường TLS có kết quả dương tính (đục/sinh khí) • Cấy chuyển huyền dịch vi khuẩn từ môi trường TLS sang môi trường canh thang Brilient green • Ủ 37oC/24-48h www.hsph.edu.vn Coliforms • Xác định các ống môi trường Brillient green cho kết quả dương tính (có sinh hơi) → Coliforms dương tính • Xác định số ống môi trường... hoá www.hsph.edu.vn Coliforms and E coli Bước 1: Đồng nhất mẫu • Cân 10 g/10ml mẫu • Đồng nhất mẫu trong 90 ml dd NMSL trong bình tam giác → nồng độ 10-1 www.hsph.edu.vn Coliforms and E coli Bước 2: Pha loãng mẫu • Hút 1ml mẫu đã đồng nhất ở trên • Pha loãng mẫu trong 9ml dd NMSL trong ống nghiệm → nồng độ 10-2 • Pha loãng tiếp tục để được các nồng độ 10-3 và 10-4… www.hsph.edu.vn Coliforms and E coli... khuẩn ở các ống EC dương tính sang môi trường Trypton • Ủ 44oC/24 h • Nhỏ vào mỗi mống Trypton sau nuôi cấy 0,5ml dung dịch Kowack • Xác định các ống có phản ứng Idol dương tính → E coli www.hsph.edu.vn E coli www.hsph.edu.vn E coli • Xác định số ống môi trường TLS dương tính với E coli tại mỗi nồng độ pha loãng mẫu sử dụng • Tra bảng MPN → tính kết quả www.hsph.edu.vn ... www.hsph.edu.vn Coliforms • Xác định các ống môi trường Brillient green cho kết quả dương tính (có sinh hơi) → Coliforms dương tính • Xác định số ống môi trường TLS dương tính với Coliforms tại mỗi nồng độ pha loãng mẫu sử dụng • Tra bảng MPN → tính kết quả www.hsph.edu.vn E coli Bước 4: Nuôi cấy trên môi trường chọn lọc 2 • Chọn các ống môi trường TLS có kết quả dương tính (đục/sinh khí) • Cấy chuyển huyền... lactose sinh khí khi nuôi cấy trong môi trường tăng sinh chọn lọc ở 30oC, 37oC và phù hợp trong phép thử khẳng định • E coli: là nhóm coliforms phân, được xác định dựa trên khả năng lên men lactose sinh khí và tạo thành Indol từ Tryptophan khi nuôi cấy trong canh thang tăng sinh chọn lọc ở 44oC www.hsph.edu.vn TIẾN HÀNH www.hsph.edu.vn Chuẩn bị môi trường • Canh thang LTS • Canh thang Brilient green • Canh . và thực hiện được các bước của qui trình định lượng Coliforms và E. coli bằng phương pháp MPN www.hsph.edu.vn PHƯƠNG PHÁP MPN (Phương pháp số có xác suất cao nhất) www.hsph.edu.vn Phương pháp. CÔNG CỘNG www.hsph.edu.vn ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS VÀ E. coli BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN www.hsph.edu.vn MỤC TIÊU • Trình bày được nguyên lý của phương pháp MPN (Most Probable Number) • Trình bày được. giờ www.hsph.edu.vn Coliforms (tt) • Gồm 4 giống: E. coli Citrobacter Klebsiella Enterobacter • Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị vệ sinh, trong đó có vệ sinh ATTP www.hsph.edu.vn Coliforms