BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRỊNH VĂN LƯƠNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG PROMETHAZIN BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI  TRỊNH VĂN LƯƠNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG PROMETHAZIN BẰNG ĐIỆN DI MAO QUẢN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS: Lê Đình Chi 2. ThS: Nguyễn Thị Thùy Linh Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất. HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Khóa luận tốt nghiệp được hoàn thành tại bộ môn Hóa phân tích – Độc chất, Trường Đại Học Dược Hà Nội dưới sự hướng dẫn chỉ bảo tận tâm của thầy TS. Lê Đình Chi và cô ThS. Nguyễn Thị Thùy Linh, cùng với sự giúp đỡ của các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích – Độ chất. Tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới hai người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi, đã dành nhiều thời gian và công sức giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và cùng toàn thể cán bộ nhân viên trường Đại Học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tận tình cho tôi trong quá trình hoàn thành nghiên cứu. Cuối cùng tôi vô cùng cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã luôn ở bên tôi, động viên và hết lòng giúp đỡ để tôi hoàn thành khóa luận này. Hà Nội, tháng 5 năm 2013 Sinh viên Trịnh Văn Lương MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ…………………………………………………………………… 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN …………………………………………………….… 3 1.1. Tổng quan về đối tượng nghiên cứu…………………………………………… 3 1.1.1. Tính chất………………………………………………………………………….3 1.1.2. Dược lý và cơ chế tác dụng…………………………………………………… 3 1.1.3. Chỉ định………………………………………………………………………….4 1.1.4. Một số quy trình phân tích đồng phân đối quang promethazin………………….5 1.2. Tổng quan về điện di mao quản 7 1.2.1. Nguyên tắc hoạt động của điện di mao quản (CE) 7 1.2.2. Phân loại các kiểu điện di mao quản………………………………………… 12 1.2.3. Đặc điểm của điện di mao quản …………………………………………… 15 1.3. Tổng quan về cyclodextrin …………………………………………………….16 1.3.1. Đôi nét về cyclodextrin …………………………………………………… 16 1.3.2. Cấu trúc phân tử và phân loại CD………………………………………… …16 1.3.3. Ứng dụng……………………………………………………………………… 17 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ………….….19 2.1. Nguyên liệu và thiết bị………………………………………………………… 19 2.1.1. Chất chuẩn làm việc…………………………………………………………….19 2.1.2. Đối tượng nghiên cứu………………………………………………………….19 2.1.3. Hóa chất…………………………………………………………………….….19 2.1.4. Dụng cụ và thiết bị…………………………………………………………… 19 2.2. Nội dung nghiên cứu………………………………………………………….…20 2.2.1. Chuẩn bị các dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu…………………………… 20 2.2.2. Xây dựng phương pháp…………………………………………………….… 21 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……… ……… …23 3.1. Khảo sát các điều kiện của quá trình điện di……………………………… 23 3.1.1. Lựa chọn các điều kiện dung dịch điện di………………………………….… 23 3.1.1.1.Lựa chọn bước sóng………………… …………………………………… 23 3.1.1.2. Bản chất dung dịch điện ly nền…………………………………………… 23 3.1.1.3. Nồng độ, pH dung dịch điện ly nền…………………………………….….…24 3.1.1.4. Khảo sát nồng độ chất chọn lọc đối quang β-CD……………………….… 26 3.1.1.5. Khảo sát điều kiện điện thế…………………………………………….….….28 3.1.1.6. Kết quả…………………………………………………………………… …29 3.2. Thẩm định phương pháp…………………………………….……………… 31 3.2.1.Độ đặc hiệu… …………………………………………………………… ….31 3.2.2.Độ tương thích hệ thống………………………………… ……………… ….32 3.2.3. Xác định khoảng tuyến tính……………………………………………… … 33 3.2.4. Độ lặp lại – độ chính xác trung gian……………………………………….… 34 3.2.5. Độ đúng của phương pháp………………………………………………… 38 3.2.6. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng……………………… ….41 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT………………………………….…… 43 4.1. Kết luận…………………………………….…………………………………… 43 4.2. Đềxuất………………………………………….………………………… ……43 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CD Cyclodextrin. CE Điện di mao quản (Capillary electrophoresis). CEC Điện sắc ký mao quản (Capillary electrochromatography). CGE Điện di mao quản gel (Capillary gel electrophoresis). CZE Điện di mao quản vùng (Capillary zone electrophoresis). DAD Detector mảng Diod (Diod array detector). EOF Dòng điện thẩm (Electro-osmotic flow). GC Sắc ký khí (Gas chromatography). HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography). MEKC Sắc ký điện động micel (Micellar electrokinetic chromatography). MS Khối phổ (Mass spectrometry). RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard deviation). SD Độ lệch chuẩn (Standard deviation). STT Số thứ tự. TB Trung bình. TKTƯ Thần kinh trung ương. t M Thời gian lưu. UV-VIS Bước sóng tử ngoại-khả kiến (Ultra violet-Visible). DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên nội dung các bảng Trang 1.1 Những yếu tố ảnh hưởng đến dòng điện thẩm EOF 11 3.1 Tính tương thích hệ thống của phương pháp 32 3.2 Quan hệ giữa nồng độ promethazin và diện tích pic đồng phân đối quang 1 33 3.3 Quan hệ giữa nồng độ promethazin và diện tíchpic đồng phân đối quang 2 34 3.4 Kết quả đánh giá độ lặp lại – độ chính xác trung gian, theo đáp ứng pic của đồng phân đối quang 1 36 3.5 Kết quả đánh giá độ lặp lại – độ chính xác trung gian theo đápứng pic của đồng phân đối quang 2 37 3.6 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp, tính toán theo đápứng pic của đồng phân đối quang 1 40 3.7 Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp, tính toán theo đápứng pic của đồng phân đối quang 2 41 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên nội dung các hình Trang 1.1 Công thức cấu tạo của promethazin 3 1.2 Sơ đồ hệ thống điện di mao quản 7 1.3 Bề mặt mao quản silica tích điện âm (SiO-) 9 1.4 Các cationhydrat hóa tập trung gần bề mặt mao quản 9 1.5 Khối dung dịch trong mao quản di chuyển về catoddưới tác dụng của dòng EOF 10 1.6 Hình ảnh mô tả tính chất của dòng, hình dạng pic của điện di mao quản (a) và sắc ký lỏng (b) 11 1.7 Cơ chế tách ở CZE 12 1.8 Cơ chế tách trong MEKC 14 1.9 Cơ chế tách của CGE 14 1.10 Cơ chế tách của CEC 15 1.11 Cấu trúc hóa học của các cyclodextrin 16 1.12 Cơ chế tạo phức của cyclodextrin 17 3.1 Phổ hấp thụ UV-VIS trên chuẩn của promethazin racemic với dung dịch điện ly nền acid phosphoric 50 mM pH = 2,5; [-CD] = 1,0 mM 23 3.2 Kết quả phân tích trên chuẩn promethazin racemic với dung dịch điện ly nền natri tetraborat 40 mM pH = 9,5 24 3.3 Kết quả phân tích trên chuẩn promethazin racemic với dung dịch điệnly nền acid phosphoric 50 mM pH = 2,5 24 3.4 Kết quả phân tích trên chuẩn promethazin racemic với dung dịch điện ly nền acid phosphoric 50 ở các pH khác nhau 26 3.5 Kết quả phân tích chuẩn promethazin racemic trên nền acidphosphoric50 mM pH = 2,5, [-CD] = 0,5 mM 27 3.6 Kết quả phân tích chuẩn promethazin racemic trên nền acid phosphoric50 mM pH = 2,5, [-CD] = 1,0 mM 28 3.7 Kết quả phân tích chuẩn promethazin racemic trên nền acid phosphoric50 mM pH = 2,5, [-CD] = 2,0 mM 28 3.8 Kết quả phân tích chuẩn promethazin racemic trên nền acid phosphoric50 mM pH = 2,5, [-CD] = 5,0 mM 28 3.9 Kết quả phân tích chuẩn promethazin racemic trên nền acid phosphoric 50 mM pH = 2,5, [β-CD] = 2,0 mM, điện thế 10kV 29 3.10 Kết quảphân tích chuẩn promethazin racemic trên nền acid phosphoric 50 mM pH = 2,5, [β-CD] = 2,0 mM, điện thế 15kV 29 3.11 Kết quả phân tích chuẩn promethazin racemic trên khi các điều kiện phân tích đã được khảo sát hoàn thành 30 3.12 Điện di đồ của mẫu promethazin chuẩn 31 3.13 Điện di đồ của mẫu thử chế phẩm promethazine 31 3.14 Điện di đồ của mẫu trắng 32 3.15 Đường biểu diễn quan hệ tuyến tính giữa nồng độ promethazin và diện tích đồng phân đối quang 1 33 3.16 Đường biểu diễn quan hệ tuyến tính giữa nồng độ promethazin và diện tích đồng phân đối quang 2 34 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Promethazin là dẫn xuất của phenothiazin có cấu trúc khác các phenothiazin chống loạn thần ở mạch nhánh phụ và không có thay thế ở vòng. Là một thuốc kháng histamin thế hệ I [2]. Do trong cấu trúc phân tử của promethazin có một nguyên tử carbon bất đối nên hoạt chất này tồn tại dưới dạng hỗn hợp racemic của hai đồng phân đối quang, dạng racemic cũng đang là dạng nguyên liệu dược dụng được sử dụng. Hiện nay chưa có một nghiên cứu cụ thể nào về sự khác biệt trong tác dụng dược lý giữa hai đồng phân đối quang của promethazin.Tuy nhiên, với các dược chất hoạt quang, chuyển từ dạng racemic sang một đồng phân đối quang tinh khiết đang là một xu hướng phổ biến, như đã được chứng minh qua trường hợp của nhiều được chất phổ biến như: từ omeprazol sang esomeprazol, hay clorpheniramin sang dexclorpheniramin, ofloxacin sang levofloxacin… Cho dù về lâm sàng, trong nhiều trường hợp lợi ích của việc chuyển đổi này còn đang được bàn luận, xu thế đó đã đặt ra một bài toán thực tế với những người làm phân tích dược. Vì bất cứ nghiên cứu nào về hai đồng phân đối quang của một dược chất dưới dạng racemic cũng sẽ cần tới một quy trình đáng tin cậy cho phép tách riêng, phân biệt đặc hiệu hai đồng phân đối quang, xu thế chuyển từ hỗn hợp racemic sang đơn đồng phân càng nâng cao thêm tầm quan trọng của các nghiên cứu tách các hỗn hợp đồng phân đối quang, làm các quy trình này có ý nghĩa thực tiễn lớn hơn. Cũng chính xu thế này là lý do chúng tôi lựa chọn hướng nghiên cứu là phân tích đồng phân đối quang của promethazin, với kỳ vọng đưa ra sản phẩm là một quy trình phân tích đáng tin cậy, sẵn có cho bất cứ ứng dụng nghiên cứu nào trong tương lai về hoạt chất promethazin. Có rất nhiều kỹ thuật phân tích khác nhau dùng để phân tích các đồng phân đối quang, trong đó hiện tại phổ biến nhất là sắc k ý lỏng hiệu năng cao (High performance liquid chromatography – HPLC). HPLC là một kỹ thuật phân tích hiện đại có thể phân tích các mẫu đa thành phần có nhiều ưu điểm:hiệu lực tách cao, có nhiều loại pha tĩnh hoạt quang thương mại hóa sẵn có phù hợp cho đa số các đối tượng cần tách, kết quả phân tích ổn định. Nhưng phương pháp HPLCcũng có [...]... hành khóa luận với đề tài Xây dựng quy trình phân tích đồng phân đối quang promethazin bằng điện di mao quản vớimục tiêu chính: Xây dựng quy trình phân tích đồng phân đối quang promethazin bằng điện di mao quản 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.2 TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Công thức cấu tạo:[1],[6] Công thức phân tử: C17H20N2S.HCl Khối lượng phân tử: 320,9 Tên khoa học: (2RS)-N,N-dimethyl-l-10H-phenothiazin-10-yl)propan-2-amin... lưu không quá 15 phút LOD lần lượt 27,5 và 31,0 ng/ml 1.1.4.2 Bằng phương pháp điện di mao quản – CE - Phân tích các đồng phân đối quang của promethazin bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng chất chọn lọc đối quang2 -O-(2-hydroxybutyl)-beta-cyclodextrin [18] Phương pháp phân tích: Điện di mao quản vùng CZE có bổ sung chất chọn lọc đối quang2 -O-(2-hydroxybutyl)-beta-cyclodextrin Chiều dài cột 45 cm... Được dùng phân tích dược chất có nhiều nhóm khác nhau + Sinh học: Các phân tử sinh học, các đồng phân quang học Thường được kết nối với MS và quang phổ 1.2.5 Đặc điểm của điện di mao quản [4], [8], [10] Điện di thực hiện trong một mao quản rất hẹp có đường kính trong từ 25-75µm, mao quản làm bằng silica nung chảy Điện thế áp vào hai đầu mao quản thường rất cao từ 10 đến 30kV Điện trở của mao quản giới... QUAN VỀ ĐIỆN DI MAO QUẢN 1.2.1 Nguyên tắc hoạt động của điện di mao quản (CE) [4], [8] Điện di mao quản là một kỹ thuật tách các chất trong mao quản silica dài 25-100 cm, đường kính trong thường từ 2575µm có khi lên tới 100µm, đường kính ngoài từ 300-400µm Điện thế áp vào hai đầu mao quản có thể lên tới 30 kV tạo ra quá trình tách và các chất phân tích được phát hiện khi di chuyển về một đầu mao quản. .. tương đối lớn, dùng nhiều dung môi hữu cơ ô nhiễm với môi trường, giá thành cho mỗi lần phân tích cao Bên cạnh đó khi phân tích các đồng phân đối quang bắt buộc phải sử dụng các cột hoạt quangcó giá thành cao, hiệu lực tách mỗi loại pha tĩnh chỉ hiệu quả cho một số đối tượng nhất định dẫn đến chi phí toàn bộ quá trình phân tích đồng phân đối quang cao Chính vì vậy, ngoài HPLC, để phân tích đồng phân đối. .. phân tích Đặc biệt trong phân tích các đồng phân đối quang thì chất chọn lọc đối quang được cho vào trong dung dịch điện ly nền, nên không cần phải đầu tư cột mao quản đắt tiền, tiết kiệm được chi phí [8] Tại Việt Nam kỹ thuật điện di mao quản là một phương pháp đã được biết đến từ lâu, nhưng những ứng dụng trong phân tích dược nói chung và phân tích đồng phân đối quang của thuốc nói riêng cho đến nay... do làm giảm cường độ điện trường 1.2.4 Phân loại các kiểu điện di mao quản Điện di mao quản khá đa dạng, có thể thực hiện theo nhiều kiểu khác nhau Mỗi kiểu có cơ chế tách riêng và có những ứng dụng đặc trưng.Theo cơ chế tách thì được chia làm các kiểu điện di mao quản sau: 1.2.2.1 Điện di mao quản vùng CZE (Capillary zone electrophoresis) [4], [8] Cơ chế tách: CZElà kiểu điện di đơn giản nhất, với... mao quản tích điện âm 9 Hình 1.3 Bề mặt mao quản silica tích điện âm (SiO-) Quá trình giải phóng H+ phụ thuộc vào hằng số cân bằng pK Dòng điện thẩm EOF thực sự có ý nghĩa khi pH dung dịch trên 4 Các vật liệu không ion hóa như Teflon cũng xuất hiện dòng điện thẩm do bề mặt thành mao quản hấp phụ các anion Do bề mặt thành trong mao quản bị ion hóa nên tích điện âm, nên đối ion do lực hút tĩnh điện. .. λmax của hai đồng phân đối quang của promethazin trên máy điện mao quản CE với nồng độ 40µg/ml, trong dung dịch điện ly nền, trong vùng bước sóng từ 190-600nm Kết quả thu được cho thấy hai đồng phân đối quang của promethazin có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 249,0 nm Vì vậy chúng tôi lựa chọn bước sóng 249nm dùng để xây dụng quy trình thẩm định hai đồng phân đối quang của promethazin Hình 3.1 Phổ hấp... hóa các điều kiện phân tích khác được trình bày ở các phần tiếp theo) Từ kết quả sơ bộ kể trên, chúng tôi đã lựa chọn dung dịch acid phosphoric làm dung dịch điện ly nền để thực hiện tối ưu hóa các điều kiện điện di khác, nhằm hướng tới thiết lập một quy trình phân tích hai đồng phân đối quang của promethazin Hình 3.2 Kết quả phân tích trên chuẩn promethazin racemic với dung dịch điện ly nền natri . tài Xây dựng quy trình phân tích đồng phân đối quang promethazin bằng điện di mao quản vớimục tiêu chính: Xây dựng quy trình phân tích đồng phân đối quang promethazin bằng điện di mao quản. . số quy trình phân tích đồng phân đối quang promethazin ……………….5 1.2. Tổng quan về điện di mao quản 7 1.2.1. Nguyên tắc hoạt động của điện di mao quản (CE) 7 1.2.2. Phân loại các kiểu điện di. các đồng phân đối quang của promethazin bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng chất chọn lọc đối quang2 -O-(2-hydroxybutyl)-beta-cyclodextrin [18]. Phương pháp phân tích: Điện di mao quản