BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN ĐỨC THANH XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CORTICOSTEROID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN ĐỨC THANH XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CORTICOSTEROID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS. Bùi Đình Sơn Nơi thực hiện: Viện KNVSATTP Quốc gia HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Với tấm lòng biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Đình Sơn đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ, công nhân viên Viện kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm quốc gia đã tạo moị điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành đề tài. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các giảng viên, nhân viên Bộ môn Hóa phân tích - độc chất, Trường đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên tôi trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận Hà nội, ngày 7 tháng 5 năm 2014 Nguyễn Đức Thanh MỤC LỤC Trang DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Giới thiệu một số steroid trong nghiên cứu 2 1.2. Vai trò của nhóm corticosteroid 4 1.3. Tình hình sử dụng corticosteroid 5 1.4. Các phương pháp xác định corticosteroid 6 1.4.1. Phương pháp ELISA 6 1.4.2. Phương pháp điện di mao quản 6 1.4.3. Phương pháp sắc ký khí 6 1.4.4. Phương pháp sắc ký lỏng 7 1.5. Cơ sở lý thuyết phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 9 1.5.1. Nguyên tắc chung của sắc ký lỏng 9 1.5.2. Phân tích định tính và định lượng bằng HPLC 11 1.5.3. Phương pháp chiết pha rắn 11 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 14 2.1.1. Thiết bị 14 2.1.2. Dụng cụ 14 2.1.3. Hóa chất 14 2.2. Nội dung nghiên cứu 15 2.3. Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1. Phương pháp lấy mẫu 15 2.3.2. Phương pháp phân tích 15 2.4. Thẩm định phương pháp phân tích 16 2.4.1. Tính đặc hiệu và chọn lọc 16 2.4.2. Khoảng tuyến tính và đường chuẩn 17 2.4.3. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 18 2.4.4. Độ lặp lại (độ chính xác) 19 2.4.5. Độ đúng 20 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1. Lựa chọn phương pháp phân tích 22 3.2. Tối ưu điều kiện xác định cortiosteroid trên thiết bị HPLC 22 3.2.1. Lựa chọn cột tách 22 3.2.2. Khảo sát pha động 24 3.2.3. Khảo sát gradient pha động 26 3.2.4. Các thông số tối ưu cho quá trình tách sắc ký 28 3.3. Khảo sát quá trình xử lý mẫu 29 3.3.1. Lựa chọn dung môi chiết 29 3.3.2. Khảo sát quy trình chiết pha rắn SPE 29 3.4. Đánh giá phương pháp phân tích 32 3.4.1. Đánh giá tính chọn lọc của bước sóng phân tích 32 3.4.2. Đánh giá độ lặp của hệ thống 32 3.4.3. Lập đường chuẩn 33 3.4.4. Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp 34 3.4.5. Độ lặp lại và độ thu hồi 36 3.5. Kết quả phân tích một số mẫu thực 40 3.6. Bàn luận 43 3.6.1. Đối tượng nghiên cứu 43 3.6.2. Xây dựng quy trình phân tích 43 3.6.2. Khảo sát quy trình xử lý mẫu 43 3.6.4. Thẩm định phương pháp 44 3.6.5. Kết quả phân tích mẫu thực 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh hoặc tên khoa học Tiếng Việt ACN Acetonitrile AOAC Association of Official Analytical Chemists Hiệp hội các nhà hóa học phân tích HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện LOQ Limit of quantification Giới hạn định lượng MeOH Methanol MS Mass spectrometry Khối phổ ppb Parts per billion Phần tỷ ppm Parts per million Phần triệu RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối SPE Solid phase extraction Chiết pha rắn UV Ultra violet Tử ngoại Vis Visible Khả kiến v/v Tỷ lệ theo thể tích DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Giới thiệu một số corticosteroid 2 Bảng 2.1. Các chất chuẩn corticosteroid 14 Bảng 2.2. Yêu cầu độ lặp lại tại các nồng độ khác nhau theo AOAC 20 Bảng 2.3. Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau theo AOAC 21 Bảng 2.4. Quy định về độ thu hồi của hội đồng châu Âu 21 Bảng 3.1. Bảng khảo sát thành phần pha động 24 Bảng 3.2. Hiệu suất qua cột chiết pha rắn C 18 với dung môi rửa giải MeOH 31 Bảng 3.3. Độ lặp lại dung dịch chuẩn hỗn hợp 6 corticosteroid 33 Bảng 3.4. Các phương trình hồi quy tuyến tính của 6 corticosteroid 34 Bảng 3.5. Giới hạn phát hiện và định lượng của 6 corticosteroid 35 Bảng 3.6. Nồng độ chất phân tích cho vào nền mẫu ở các mức khác nhau 36 Bảng 3.7. Độ lặp lại và độ thu hồi tại nồng độ thêm chuẩn thấp 37 Bảng 3.8. Độ lặp lại và độ thu hồi tại nồng độ thêm chuẩn trung bình 38 Bảng 3.9. Độ lặp lại và độ thu hồi tại nồng độ thêm chuẩn cao 39 Bảng 3.10. Kết quả phân tích mẫu thực 42 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Cấu trúc khung cơ bản của steroid 2 Hình 1.2. Sắc ký đồ trong phân tích sắc ký 11 Hình 1.3. Các bước tiến hành của quá trình chiết pha rắn 12 Hình 2.1. Lược đồ quy trình phân tích mẫu dự kiến 16 Hình 2.2. Đường chuẩn trên nền mẫu thực 18 Hình 2.3. Xác định LOD bằng cách tính S/N 19 Hình 3.1. Sắc đồ phân tích trên cột X-Brigde C 18 23 Hình 3.2. Sắc đồ phân tích trên cột HiQ SIL C 18 23 Hình 3.3. Sắc đồ phân tích với pha động H 2 O – THF 24 Hình 3.4. Sắc đồ phân tích với pha động H 2 O – MeOH 25 Hình 3.5. Sắc đồ phân tích với pha động H 2 O – ACN 25 Hình 3.6. Sắc đồ phân tích với pha động KH 2 PO 4 – ACN 25 Hình 3.7. Sắc đồ phân tích theo chương trình 1 26 Hình 3.8. Sắc đồ phân tích theo chương trình 2 27 Hình 3.9. Sắc đồ phân tích theo chương trình 3 27 Hình 3.10. Sắc đồ phân tích theo chương trình 4 28 Hình 3.11. Sắc đồ phân tích ở điều kiện tối ưu 29 Hình 3.12. Sắc đồ phân tích dung môi và dung dịch chuẩn 6 corticosteroid 32 Hình 3.13. Sắc đồ tại giới hạn phát hiện của 6 chất phân tích 35 Hình 3.14. Quy trình phân tích mẫu thực 41 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Theo định nghĩa của Bộ Y tế, thực phẩm chức năng là thực phẩm dùng để hỗ trợ chức năng của các bộ phận trong cơ thể người, có tác dụng dinh dưỡng, tạo cho cơ thể tình trạng thoải mái, tăng sức đề kháng và giảm bớt nguy cơ bệnh tật. Một số nhà sản xuất và kinh doanh đã lợi dụng lòng tin của người tiêu dùng nên đã thổi phồng quá mức tác dụng của thực phẩm chức năng khiến không ít người coi thực phẩm chức năng như là “thần dược” chữa bách bệnh. Corticosteroid là nhóm chất có gốc steroid được tuyến thượng thận của cơ thể sản xuất ra với tác dụng chống viêm mạnh, chống dị ứng và ức chế miễn dịch. Corticosteroid có thể sử dụng để xử lý các biến chứng của bệnh ung thư và điều trị ung thư, sử dụng trong các trường hợp viêm khớp nghiêm trọng. Song, việc sử dụng và điều trị bằng corticosteroid cần có chỉ định của bác sĩ, sử dụng sai mục đích và liều lượng gây ra những tác dụng phụ có thể dẫn tới hậu quả nghiêm trọng. Trong những năm vừa qua, tại Việt Nam cũng như trên thế giới liên tiếp phát hiện các vi phạm trong vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm: Sữa có chứa melamine để tăng độ đạm, sản phẩm hỗ trợ điều trị xương khớp từ thảo dược nhưng lại chứa dexamethasone, piroxicam, furosemide… Do đó để giúp bảo vệ quyền lợi người tiêu dùng cũng như hỗ trợ các cơ quan chức năng kiểm soát tốt vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm nhất là đối với thực phẩm chức năng, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Xác định một số corticosteroid trong thực phẩm chức năng bằng phương pháp HPLC” với các mục tiêu sau: + Xây dựng quy trình phát hiện và định lượng một số corticosteroid trong thực phẩm chức năng. + Ứng dụng quy trình đã xây dựng để phân tích một số sản phẩm thực phẩm chức năng đang lưu hành trên thị trường. [...]... cứu + Đối tượng nghiên cứu: Thực phẩm chức năng + Nội dung nghiên cứu của đề tài này là: - Xây dựng quy trình phân tích một số chất thuộc nhóm corticosteroid bằng kỹ thuật sắc ký lỏng với detector UV - Lấy mẫu và áp dụng phương pháp để đánh giá một số mẫu thực tế 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp lấy mẫu + Đối tượng mẫu: Thực phẩm chức năng có tác dụng hỗ trợ trong việc giảm cân, làm đẹp,... tích định tính và định lượng bằng HPLC [3], [4] Phân tích định tính: Đại lượng đặc trưng cho sự tách sắc ký là thời gian lưu của các chất Dựa vào thời gian lưu của chất phân tích trong chuẩn và trong dung dịch phân tích để định tính từng chất trong hỗn hợp Hình 1.2 Sắc ký đồ trong phân tích sắc ký Để định lượng chất phân tích, dùng phương pháp đường chuẩn, thêm chuẩn hoặc so sánh 12 1.5.3 Phương pháp. ..2 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu một số corticosteroid trong nghiên cứu Corticosteroid là nhóm chất trong công thức có khung steroid và có chung cấu tạo là ol - 21 - dion - 3,20 pregna - 4 - en và rất ít ngoại lệ Hình 1.1 Cấu trúc khung cơ bản của steroid Dưới đây là một số corticosteroid được nghiên cứu trong đề tài này: Bảng 1.1 Giới thiệu một số corticosteroid Khối TT Tên Công thức lượng... thống HPLC để định tính và định lượng chất phân tích có trong mẫu 2.4 Thẩm định phương pháp phân tích [6] 2.4.1 Tính đặc hiệu và chọn lọc + Tính đặc hiệu: là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác Tính đặc hiệu thường liên quan đến việc chỉ xác định một chất phân tích + Tính chọn lọc: là khái niệm rộng hơn tính đặc hiệu, liên quan đến phân tích nhiều chất trong cùng một quy... Cách xác định LOD: Phân tích mẫu ở nồng độ thấp còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích Số lần phân tích lặp lại 4 lần Xác định tỷ lệ tín hiệu chia cho nhiễu (S/N), trong đó S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích, N là nhiễu đường nền LOD được chấp nhận tại nồng độ mà S/N = 3 19 Hình 2.3 Xác định LOD bằng cách tính S/N + Giới hạn định lượng (LOQ): là nồng độ tối thiểu của một chất có trong. .. mẫu thử mà tại đó ta có thể định lượng được bằng phương pháp phân tích và cho kết quả có độ chính xác mong muốn Cách xác định LOQ: Có thể xác định dựa vào tỷ lệ tín hiệu chất phân tích và nhiễu đường nền LOQ có thể được xác định là nồng độ của chất phân tích mà tại đó tỉ lệ S/N = 10 Do đó, có thế tính LOQ từ LOD theo công thức: LOQ = 10 LOD 3 2.4.4 Độ lặp lại (độ chính xác) + Độ lặp lại (độ chụm) thể... Độ đúng của phương pháp: chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng (μ) + Có nhiều cách tính độ đúng như: dùng so sánh với phương pháp chuẩn, tính độ thu hồi, sử dụng vật liệu chuẩn trong nghiên cứu này chúng tôi xác định độ đúng thông qua việc xác định độ thu hồi + Tính độ thu hồi: Độ thu hồi được xác định dựa trên kĩ thuật... bởi một chùm tia tử ngoại Sự hấp thụ tia bức xạ bởi các chất tan tuân theo định luật LambertBeer Tham khảo một số tài liệu [2], [5], [8], [12] chúng tôi tiến hành xác định các corticosteroid trên hệ thống sắc ký lỏng HPLC- UV với các điều kiện sơ bộ như sau: + Cột pha đảo C18 + Detector: UV 254nm + Tốc độ dòng: 1mL/phút + Nhiệt độ cột: 35oC + Thể tích bơm mẫu: 20μL 3.2 Tối ưu điều kiện xác định corticosteroid. .. do đó muốn sử dụng phân tích bằng phương pháp sắc ký khí, yêu cầu phải được dẫn xuất trước với các thuốc thử để tạo hợp chất dễ bay hơi rồi mới tiến hành phân tích Do đó, hóa chất cũng như thao tác thực hiện phức tạp, quá trình dẫn xuất có thể không hoàn toàn gây ra sai số phân tích 1.4.4 Phương pháp sắc ký lỏng Sắc ký lỏng là phương pháp tách được sử dụng phổ biến nhất trong lĩnh vực phân tích hiện... biến nhất trong lĩnh vực phân tích hiện nay vì phạm vi ứng dụng rất rộng rãi 1.4.4.1 Phương pháp sắc kí lỏng khối phổ LC-MS [7], [13], [15] Robin Difrancesco và các cộng sự [13] đã sử dụng phương pháp sắc kí lỏng khối phổ để xác định một số steroid trong huyết thanh người Mẫu được thêm chuẩn, ly tâm loại bỏ cặn, dịch trong được chiết qua cột chiết pha rắn Oasis HLB (1ml, 30mg) Dịch rửa giải được làm . chức năng kiểm soát tốt vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm nhất là đối với thực phẩm chức năng, chúng tôi tiến hành nghiên cứu Xác định một số corticosteroid trong thực phẩm chức năng bằng phương. NGUYỄN ĐỨC THANH XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CORTICOSTEROID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS. Bùi Đình Sơn Nơi thực hiện: Viện KNVSATTP. Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN ĐỨC THANH XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CORTICOSTEROID TRONG THỰC PHẨM CHỨC NĂNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014