Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa 96 giếng và áp dụng với một số cây thuốc có tiềm năng khai thác của đồng bào pako vân kiều

53 315 0
  • Loading ...
1/53 trang

Thông tin tài liệu

Ngày đăng: 29/07/2015, 08:40

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HUỆ TRIỂN KHAI PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO TRÊN ĐĨA 96 GIẾNG VÀ ÁP DỤNG VỚI MỘT SỐ CÂY THUỐC CÓ TIỀM NĂNG KHAI THÁC CỦA ĐỒNG BÀO PAKO – VÂN KIỀU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Người hướng dẫn: T.S. Nguyễn Thùy Duơng Nơi thực hiện: Bộ môn Dược lực HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ quý báu của các tập thể, các thầy cô giáo, bạn bè và những người thân của tôi. Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Thùy Dương, người thầy đã hướng dẫn tận tình và quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Tôi xin trân trọng cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám hiệu và các bộ môn trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: Các thầy cô và anh chị kĩ thuật viên bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận. PGS.TS. Nguyễn Thị Hoài, Khoa Dược, trường Đại học Y Dược Huế. TS. Phương Thiện Thương, Khoa Phân tích – tiêu chuẩn, Viện Dược liệu. Lời cuối cùng, tôi xin cảm ơn tới gia đình, bạn bè, người thân - những người đã ủng hộ, chia sẻ, động viên tôi những lúc khó khăn và giúp tôi hoàn thành khóa luận này. Hà Nội, tháng 5, năm 2013 Sinh viên Nguyễn Thị Huệ MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về bệnh gút 3 1.1.1. Định nghĩa 3 1.1.2. Mối liên quan giữa bệnh gút và sự tăng acid uric máu, vai trò của enzym xanthin oxidase 3 1.1.3. Thuốc ức chế xanthin oxidase 5 1.2. Tổng quan về xanthin oxidase 6 1.2.1. Nguồn gốc, phân bố 6 1.2.2. Cấu trúc, cơ chế hoạt động 7 1.2.3. Động học enzym 9 1.2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt độ enzym 9 1.3. Phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthine oxidase in vitro 11 1.3.1. Phƣơng pháp đo quang 12 1.3.2. Phƣơng pháp đo áp 13 1.3.3. Phƣơng pháp đo sử dụng HPLC với detector huỳnh quang 14 1.4. Các dƣợc liệu có tiềm năng ức chế xanthin oxidase 14 1.5. Thông tin về một số dƣợc liệu của đồng bào Pako- Vân Kiều 15 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 17 2.1.1. Dƣợc liệu nghiên cứu 17 2.1.2. Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu 18 2.2. Phƣơng tiện nghiên cứu 18 2.2.1. Thuốc và hóa chất 18 2.2.2. Thiết bị và dụng cụ 19 2.3. Nội dung nghiên cứu 19 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 20 2.4.1. Triển khai phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa Costar 96 giếng 20 2.4.2. Áp dụng đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa Costar 96 giếng của các cây thuốc của đồng bào Pako – Vân Kiều 24 2.4.3. Phƣơng pháp thống kê 25 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 3.1. Kết quả 26 3.1.1. Triển khai phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa Costar 96 giếng 26 3.1.2. Áp dụng đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa Costar 96 giếng của các cây thuốc của đồng bào Pako – Vân Kiều 31 3.2. Bàn luận 37 3.2.1. Về triển khai phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa Costar 96 giếng 37 3.2.2. Về áp dụng đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của các cây thuốc có tiềm năng khai thác của đồng bào Pako – Vân Kiều 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO vii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ABTS : 2,2’-azino-di(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate) AHP : 2-amino-4-hydroxypteridin DMSO : dimethyl sulfoxid HPLC : sắc kí lỏng hiệu năng cao (high-performance liquid chromatography) IC 50 : nồng độ ức chế 50% (the half maximal inhibitory concentration) IXP : isoxanthopterin NSAIDs : thuốc chống viêm không steroid (non steroidial anti inflammatory drugs) DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1. Thông tin về một số cây thuốc của đồng bào Pako – Vân Kiều 16 Bảng 2.1. Danh sách các cây thuốc nghiên cứu 17 Bảng 3.1. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase của allopurinol ở các nồng độ khác nhau 28 Bảng 3.2. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase của Quercetin ở các nồng độ khác nhau 30 Bảng 3.3. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase của 11 mẫu dược liệu ở nồng độ 100µg/mL 32 Bảng 3.4. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase của 11 mẫu dược liệu ở nồng độ 50µg/mL 33 Bảng 3.5. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase của 11 mẫu dược liệu ở nồng độ 10µg/mL 34 Bảng 3.6. Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase của cây mán đĩa theo từng nồng độ khác nhau 35 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Sơ đồ chuyển hóa base purin 4 Hình 1.2. Cấu trúc xanthin oxidase 7 Hình 1.3. Cơ chế hoạt động của xanthin oxidase 8 Hình 1.4. Đồ thị hàm số ngược 1/v đối với [S] trong sự có mặt và vắng mặt chất ức chế 11 Hình 2.1. Quy trình thí nghiệm khảo sát động học enzym 21 Hình 2.2. Quy trình thí nghiệm xây dựng đồ thị phương trình Linewweaver – Burk 22 Hình 2.3. Quy trình thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase của một mẫu thử 23 Hình 2.4. Quy trình thí nghiệm xác định cơ chế ức chế xanthin oxidase 24 Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc theo thời gian của lượng acid uric tạo thành (biểu diễn thông qua OD) với các dung dịch enzym ở nồng độ khác nhau 26 Hình 3.2. Đồ thị Lineweaver – Burk của xanthin oxidase 27 Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế xanthin oxidase của allopurinol theo nồng độ 29 Hinh 3.4. Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế xanthin oxidase của quercetin theo nồng độ 30 Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế xanthin oxidase của cao toàn phần Mán đĩa theo nồng độ 36 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn cơ chế ức chế xanthin oxidase của cao phần mán đĩa 37 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Gút là một bệnh chuyển hóa, có liên quan trực tiếp đến chế độ ăn uống giàu acid nucleic nhƣ thịt (đặc biệt là nội tạng), các loại đậu, một số loại hải sản và nấm men. Bệnh xảy ra ở mọi dân tộc, mọi điều kiện địa dƣ và khí hậu, có chiều hƣớng phát triển ở thành thị và các tầng lớp có mức sống cao [1]. Trên thế giới hiện nay, tỉ lệ mắc gút ở ngƣời trƣởng thành là 1%, đây cũng là bệnh viêm khớp phổ biến nhất ở nam giới [14]. Ở Việt Nam gần đây, đời sống ngƣời dân ngày càng cao lại đƣợc quan tâm chẩn đoán nên tỉ lệ phát hiện mắc gút ngày càng lớn [12]. Trƣớc tình hình bệnh gút ngày càng phổ biến, các nghiên cứu phát triển thuốc điều trị gút ngày càng đƣợc quan tâm. Bên cạnh việc phát triển các thuốc tổng hợp hóa học, thực vật và dƣợc liệu cũng là một nguồn nguyên liệu to lớn để tìm ra các hƣớng đi cho quá trình điều trị bệnh gút. Nhiều nghiên cứu sàng lọc và tìm kiếm dƣợc liệu có tiềm năng điều trị gút đƣợc tiến hành với cả thử nghiệm in vivo lẫn in vitro. Trong đó, thử nghiệm in vitro thể hiện lợi thế với ƣu điểm nhanh và đỡ tốn kém hơn. Đặc biệt, đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro là hƣớng nghiên cứu đƣợc nhiều tác giả lựa chọn nhằm tìm kiếm các dƣợc liệu có tiềm năng điều trị gút [30]. Có khá nhiều phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase, trong đó, phƣơng pháp đo quang dựa trên định lƣợng acid uric là phƣơng pháp phổ biến, có thể thực hiện dễ dàng ở các điều kiện trong nƣớc. Bên cạnh đó, Việt Nam cũng là một đất nƣớc có nhiều tài nguyên cây cỏ, cộng với nền y học cổ truyền phát triển với nguồn tri thức sử dụng thuốc dân gian của 54 dân tộc khác nhau. Mỗi dân tộc đều có những kinh nghiệm sử dụng dƣợc liệu khác nhau, đó là nguồn dữ liệu to lớn để nghiên cứu và phát triển các thuốc điều trị bệnh nói chung và bệnh gút nói riêng. Trƣớc những yêu cầu và điều kiện nhƣ vậy, đề tài nghiên cứu “ Triển khai phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa 96 giếng và áp dụng với một số cây thuốc có tiềm năng khai thác của đồng bào Pako – Vân Kiều” đƣợc thực hiện với hai mục tiêu sau: 2 1. Triển khai đƣợc phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa Costar 96 giếng. 2. Đánh giá khả năng ức chế và xác định đƣợc IC 50 của cây thuốc có tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro mạnh nhất trong các cây thuốc có tiềm năng khai thác của đồng bào Pako –Vân Kiều. 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về bệnh gút 1.1.1. Định nghĩa Gút là một bệnh rối loạn chuyển hóa liên quan đến tình trạng tăng acid máu [1],[7],[20]. Bệnh biểu hiện bởi các cơn viêm khớp cấp tái diễn lặp đi lặp lại liên quan đến tinh thể urat kết tinh, bệnh thận do gút, sỏi thận, sự lắng đọng của natri urat (tophi) ở sụn, gân, màng hoạt dịch và những mô khác của cơ thể [20]. 1.1.2. Mối liên quan giữa bệnh gút và tăng acid uric máu, vai trò của xanthin oxidase ● Mối liên quan giữa bệnh gút và tăng acid uric máu Acid uric là sản phẩm thoái giáng cuối cùng của nucleoprotein có chứa nhân purin [1],[3],[20]. Khi nồng độ acid uric vƣợt quá giới hạn tối đa hòa tan urat trong dung dịch có cùng nồng độ natri nhƣ huyết tƣơng – tức là tình trạng tăng acid máu, liên quan trực tiếp đến bệnh gút. Trong mọi trƣờng hợp, tăng acid uric máu dẫn đến tích lũy tinh thể urat tại các mô, tạo nên các hạt microtophi. Sự lắng đọng urat tại các mô khác nhau gây ra các biểu hiện khác nhau. Hạt tophi tại sụn khớp bị vỡ sẽ khởi phát cơn gút cấp; sự lắng đọng vi tinh thể cạnh khớp, trong màng hoạt dịch,trong mô sụn và mô xƣơng sẽ dẫn đến bệnh xƣơng khớp mạn tính do gút; sự có mặt vi tinh thể urat tại mô mềm, bao gân tạo hạt tophi; viêm thận kẽ (bệnh thận do gút) là do tinh thể urat lắng đọng tại tổ chức kẽ của thận. Acid uric niệu tăng và sự toan hóa nƣớc tiểu dẫn đến sỏi tiết niệu trong bệnh gút [7],[20]. Tăng acid uric máu đƣợc xác định là yếu tố nguy cơ của gút [20]. Nồng độ acid uric máu càng cao thì nguy cơ mắc gút càng lớn [37]. Bất kì yếu tố nào làm tăng quá trình tổng hợp hoặc giảm sự thải trừ acid uric đều có thể làm tăng nồng độ acid uric máu [20]. ● Vai trò của xanthin oxidase trong sinh chuyển hóa acid uric Xanthin oxidase là một enzym có vai trò quan trọng trong việc hình thành acid uric. Enzym này có vai trò xúc tác cho phản ứng chuyển hypoxanthin và [...]... allopurinol và quercetin ● Thực hiện mục tiêu 2: Xác định đƣợc IC50 của cây thuốc có tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro lớn nhất trong các cây thuốc có tiềm năng khai thác của đồng bào Pako – Vân Kiều - Chiết xuất cao toàn phần của các cây thuốc - Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase của các cao toàn phần ở 3 nồng độ 10 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL - Xác định IC50 của cây thuốc tiềm năng nhất - Xác... Xác định sơ bộ cơ chế ức chế enzym của cây thuốc tiềm năng nhất 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu Phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase trên đĩa 96 giếng đƣợc triển khai theo phƣơng pháp mô tả bởi Nguyễn Thị Thanh Mai [30] và đƣợc thay đổi cho phù hợp với điều kiện thí nghiệm Nguyên tắc của phƣơng pháp dựa trên sự tạo thành acid uric từ xanthin nhờ sự xúc tác của xanthin oxidase Lƣợng acid... ch xanthin oxidase in vitro trên đĩa Costar 96 giếng của các cây thuốc của đồng bào Pako – Vân Kiều ● Đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase của 11 mẫu dược liệu ở ba nồng độ khác nhau Bố trí thí nghiệm nhƣ mô tả ở hình 2.3 với chất thử là dịch chiết các cây thuốc ở 3 nồng độ 10 µg/mL, 50µg/mL, 100 µg/mL - Đánh giá kết quả: Tính I (% ức chế) theo công thức (1) ● Xác định IC50 của cây thuốc tiềm năng. .. oxidase in vitro và in vivo Để thẩm định phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế hoạt động xanthin oxidase in vitro của dƣợc liệu trên đĩa 96 giếng, chúng tôi tiến hành đánh giá tác dụng của chất này Tiến hành thí nghiệm với chất thử là các dung dịch allopurinol ở nồng độ khác nhau Kết quả đƣợc biễu diễn ở bảng 3.1 và hình 3.3 Bảng 3.1 Kết quả đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase của allopurinol ở các... Lineweaver – Burk của xanthin oxidase Tiến hành thí nghiệm với các dung dịch cơ chất có nồng độ khác nhau Kết quả đƣợc biểu diễn ở đồ thị hình 3.2 Hình 3.2 Đồ thị Lineweaver – Burk của xanthin oxidase trên đĩa Costar 96 giếng 28 ● Thẩm định phương pháp thông qua đánh giá tác dụng của allopurinol và quercitin - Allopurinol là một chất thử đã đƣợc chứng minh có tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in. .. nặng có thể ức chế xanthin oxidase (Ví dụ: Hg2+, Ag+ ) Tác dụng của ion kim loại rất phức tạp vì nó còn ảnh hƣởng tới cả trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác của enzym [3] 10 ● Các chất ức chế Xanthin oxidase bị ức chế bởi ure, rất nhiều purin, pyrimidin và các hợp chất dị vòng khác nhƣ purin-6-aldehyd, 2-amino-4-hydroxypteridin-6-aldehyd Xanthin oxidase còn bị ức chế bởi một số thuốc và một số dịch... hiện tiềm năng ức chế xanthin oxidase Ở các nƣớc trên thế giới, đã có khá nhiều nghiên cứu sàng lọc các dƣợc liệu có tác dụng ức chế xanthin oxidase Trong một nghiên cứu sàng lọc các cây thuốc ở 14 Ấn Độ, có 14 dịch chiết thể hiện tác dụng ức chế xanthin oxidase ở nồng độ 100 µg/mL trong 18 dịch chiết; trong đó có 10 dịch chiết ức chế hơn 50% với IC50 bé hơn 100 µg/mL; những cây thuốc có tiềm năng. .. uric tạo ra tỉ lệ với hoạt độ enzym, đƣợc định lƣợng bởi việc đo quang ở 290nm Mẫu có chất thử đƣợc so sánh với mẫu không có chất thử để đánh giá tác dụng ức chế enzym của chất thử 2.4.1 Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa Costar 96 giếng ● Chuẩn bị các hóa chất cần thiết - Đệm phosphat 70mM, pH=7,5 - Enzym: xanthin oxidase với các dung dịch có hoạt độ khác... tra kinh nghiệm sử dụng cây thuốc của cộng đồng, chứ chƣa có những đánh giá kiểm chứng khoa học về tác dụng của các loài này [9],[10] Trong đề tài này, 10 cây thuốc của đồng bào Pako - Vân Kiều đƣợc lựa chọn từ các cây thuốc đƣợc sử dụng nhiều nhất trong dân gian ở vùng đồng bào sinh sống nhƣng chƣa có các nghiên cứu cụ thể kiểm chứng thành phần hóa học và hoạt tính Các cây thuốc này chủ yếu có tác dụng. .. µg/mL, có 126 (43,8%) dịch chiết thể hiện tác dụng ức chế với 2 (1,6%) dịch chiết ức chế hơn 50% Tổng cộng có 49 dịch chiết có IC50 dƣới 100 µg/mL [30] 1.5 Thông tin về một số dƣợc liệu của đồng bào Pako- Vân Kiều Việt Nam là quốc gia có 54 dân tộc sinh sống với nhiều ngôn ngữ khác nhau Mỗi dân tộc lại có một nhóm các cây thuốc chăm sóc sức khỏe và chữa bệnh đặc thù của dân tộc mình Tộc ngƣời Pako và Vân . HUỆ TRIỂN KHAI PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ XANTHIN OXIDASE IN VITRO TRÊN ĐĨA 96 GIẾNG VÀ ÁP DỤNG VỚI MỘT SỐ CÂY THUỐC CÓ TIỀM NĂNG KHAI THÁC CỦA ĐỒNG BÀO PAKO – VÂN KIỀU KHÓA. phƣơng pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa Costar 96 giếng. 2. Đánh giá khả năng ức chế và xác định đƣợc IC 50 của cây thuốc có tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro. vitro trên đĩa Costar 96 giếng 37 3.2.2. Về áp dụng đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro của các cây thuốc có tiềm năng khai thác của đồng bào Pako – Vân Kiều 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ
- Xem thêm -

Xem thêm: Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa 96 giếng và áp dụng với một số cây thuốc có tiềm năng khai thác của đồng bào pako vân kiều, Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa 96 giếng và áp dụng với một số cây thuốc có tiềm năng khai thác của đồng bào pako vân kiều, Triển khai phương pháp đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro trên đĩa 96 giếng và áp dụng với một số cây thuốc có tiềm năng khai thác của đồng bào pako vân kiều

Từ khóa liên quan

Gợi ý tài liệu liên quan cho bạn