BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN HỮU THẾ NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA CÂY Ý DĨ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN HỮU THẾ NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG SINH HỌC CỦA CÂY Ý DĨ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS. Trần Văn Ơn Nơi thực hiện: Bộ môn Thực Vật – Trường ĐH Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Trần Văn Ơn – Giảng viên Bộ môn Thực Vật, Trường Đại Học Dược Hà Nội đã trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài khóa luận. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô TS. Hoàng Quỳnh Hoa, ThS. Phạm Hà Thanh Tùng, DS. Nghiêm Đức Trọng, cùng toàn thể các thầy cô giáo và các chị kỹ thuật viên Bộ môn Thực vật, đã nhiệt tình chỉ bảo và giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới sự dạy dỗ, dìu dắt của các thầy cô giáo trong nhà trường trong suốt 5 năm học vừa qua. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới bố mẹ, người thân và bạn bè đã luôn động viên tinh thần cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày 19 tháng 05 năm 2013 Sinh viên Nguyễn Hữu Thế MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3 1.1 Cây Ý dĩ 3 1.1.1 Vị trí phân loại của chi Coix L. 3 1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Coix L. 3 1.1.3 Thành phần hóa học 5 1.1.4 Tác dụng sinh học 8 1.1.5 Công dụng và sử dụng của cây Ý dĩ 10 1.2 DNA và phương pháp xác định trình tự gen 12 1.2.1 Một số tính chất và chức năng của DNA 12 1.2.2 Phương pháp xác định trình tự gen 14 1.3 Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao 17 1.3.1 Sắc ký lớp nỏng hiệu năng cao 17 1.3.2 Dấu vân tay sắc ký 17 1.3.3 Ứng dụng HPTLC 18 CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị, hoá chất 19 2.1.1 Nguyên vật liệu 19 2.1.2 Thiết bị, hóa chất 19 2.1.3 Phần mềm hỗ trợ 21 2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Nghiên cứu đa dạng về đặc điểm hình thái và nông học 21 2.2.2 Nghiên cứu đa dạng về di truyền 24 2.2.3 Nghiên cứu về hóa học bằng phương pháp HPTLC 25 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 27 3.1 Tính đa dạng về đặc điểm hình thái và nông học 27 3.1.1 Đặc điểm hình thái của các mẫu Ý dĩ ở thời điểm ngày 02/05/2013 27 3.1.2 Đặc điểm nông học của các mẫu Ý dĩ 35 3.1.3 Kết quả nghiên cứu tính đa dạng về đặc điểm hình thái và nông học 36 3.2 Sự khác biệt về thành phần hóa học trong hạt 38 3.3 Tính đa dạng về di truyền 40 BÀN LUẬN 42 KẾT LUẬN KIẾN NGHỊ 45 47 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT A Adenin C Cystosin CTAB Cetyltrimethylammonium (cetrimonium) bromide DNA Acid deoxyribonucleic dATP Deoxy Adenosine Triphosphate dCTP Deoxy Cytidine Triphosphate dGTP Deoxy Guanosine Triphosphate dTTP Deoxy Thymidine Triphosphate ddATP Dideoxy Adenosine Triphosphate ddCTP Dideoxy Cytidine Triphosphate ddGTP Dideoxy Guanosine Triphosphate ddTTP Dideoxy Thymidine Triphosphate ddNTP Dideoxy Nucleoside Triphosphate dNTP Deoxy Nucleoside Triphosphate EDTA Ethylen Diamin Tetraacetic Axit FDA Cơ quan quản lý chất lượng thuốc và thực phẩm GAP Good Agricultural Practices - Thực hành tốt trồng trọt cây thuốc HPTLC Sắc kí lớp mỏng hiệu năng cao IC50 Inhibitory Concentration 50 - Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử ITS Internal Transcribed Spacer KLT Kanglaite mARN Messenger Acid Ribonucleic – ARN thông tin MeOH Methanol Nu Nucleotide PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp Rf Retention Factor – Hệ số lưu trữ STZ Streptozocin T Thymin TLC Thin Layer Chromatography- Sắc kí lớp mỏng DANH MỤC CÁC BẢNG TT Ký hiệu Tên bảng Trang 1 Bảng 1.1 Các phản ứng hóa học đặc hiệu khi thực hiện giải trình tự gen bằng phương pháp Maxam và Gilbert 15 2 Bảng 2.1 Danh sách các mẫu nghiên cứu 19 3 Bảng 2.2 Các chỉ tiêu nông – sinh học được theo dõi 22 4 Bảng 2.3 Các bước thực hiện tách DNA từ mẫu lá Ý dĩ 24 5 Bảng 3.1 Bảng tổng kết các chỉ tiêu nông – sinh học và đặc điểm hình thái để so sánh 7mẫu Ý dĩ 36 6 Bảng 3.2 Diện tích peak của mẫu Y1 tại Rf = 0,14; mẫu Y2 tại Rf = 0,66 và mẫu Y5 tại Rf = 0,63 38 7 Bảng 3.3 Diện tích peak phổ HPTLC dịch chiết methanol các mẫu Ý dĩ tại Rf = 0,69 39 DANH MỤC CÁC HÌNH TT Ký hiệu Tên hình Trang 1 Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Coixol và α-monolinolein 5 2 Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Coixenolide 6 3 Hình 1.3 Công thức cấu tạo của các hợp chất (4) – (8) 7 4 Hình 1.4 Công thức cấu tạo của các hợp chất (9) – (13) 8 5 Hình 1.5 Thuốc tiêm Kanglaite 12 6 Hình 1.6 Cấu trúc của vùng ADN ribosom ITS 14 7 Hình 2.1 Chậu nhựa dùng để trồng các mẫu Ý dĩ 22 8 Hình 3.1 Đặc điểm hình thái mẫu Y1 (Mai Châu – Sơn La) 27 9 Hình 3.2 Đặc điểm hình thái mẫu Y2 (Đà Bắc – Hòa Bình) 28 10 Hình 3.3 Thân mang lá mẫu Y3 (Đạo Trù – Vĩnh Phúc) 29 11 Hình 3.4 Thân mang lá mẫu Y4 (Hoàng Mai – Hà Nội) 29 12 Hình 3.5 Đặc điểm hình thái mẫu Y5 (Chiang Rai – Thái Lan) 30 13 Hình 3.6 Đặc điểm hình thái của mẫu Y6 (Thuận Châu – Sơn La) 31 14 Hình 3.7 Đặc điểm hình thái mẫu Y7 (Mường Thanh – Điện Biên) 32 15 Hình 3.8 Đặc điểm hình thái mẫu Y8 (Thành phố Hải Dương) 33 16 Hình 3.9 Đặc điểm hình thái mẫu Y9 (Văn Quan – Lạng Sơn) 34 17 Hình 3.10 Thân mang lá mẫu Y10 (Ba Vì – Hà Nội) 34 18 Hình 3.11 Các giai đoạn phát triển của cây Ý dĩ 35 19 Hình 3.12 Cây phân loại 7 mẫu Ý dĩ dựa trên đặc điểm hình thái và nông học 38 20 Hình 3.13 Sắc ký đồ HPTLC của các mẫu Ý dĩ 39 21 Hình 3.14 Cây phân loại 9 mẫu Ý dĩ dựa trên trình tự nucleotid 41 [...]... khác nhau.Vì vậy, việc xác định tính đa dạng sinh học của cây Ý dĩ ở miền Bắc Việt Nam là cần thiết Năm 2012, Dược sĩ Nguyễn Kim Khanh đã nghiên cứu sự đa dạng sinh học của 6 mẫu Ý dĩ ở miền Bắc Việt Nam Kết quả thu được là 6 mẫu Ý dĩ ít có sự đa dạng về hóa học nhưng có sự khác biệt về đặc điểm hình thái, nông học và di truyền [11] Tuy nhiên nghiên cứu này mới chỉ nghiên cứu trên 2 thứ là: Coix lachryma-jobi... mayuen và nghiên cứu trên thân và hạt Về đa dạng sinh học của cây Ý dĩ, ở nước ngoài đã nghiên cứu đa dạng các mẫu Ý dĩ dựa vào dấu vân tay DNA, hay dấu vân tay TLC [26] Ở Việt Nam đã có đề tài nghiên cứu đa dạng sinh học cây Ý dĩ với các chỉ tiêu dấu vân tay DNA, dấu vân tay TLC và đặc điểm hình thái, nông học [11] 1.2 DNA và phương pháp xác định trình tự DNA [6], [8], [15] 1.2.1 Một số tính chất... stenocarpa Oliv Do đó đề tài Nghiên cứu tính đa dạng sinh học của cây Ý dĩ được tiếp tục thực hiện với 2 mục tiêu chính là: 1 Xác định tính đa dạng về đặc điểm hình thái, nông học và di truyền của một số giống Ý dĩ 2 2 Khảo sát sự khác biệt về thành phần hóa học trong hạt của một số giống Ý dĩ bằng phương pháp HPTLC 3 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Cây Ý dĩ 1.1.1 Vị trí phân loại của chi Coix L Chi Coix L... thành phần hóa học của dược liệu cần nhận dạng so với dược diệu chuẩn thông qua việc xây dựng dấu vân tay hóa học của dược liệu Qua tổng quan nghiên cứu về cây Ý dĩ đặc biệt là nghiên cứu của Nguyễn Kim Khanh thực hiện năm 2012, chúng tôi tiếp tục mở rộng nghiên cứu đề tài này để xác định chính xác sự đa dạng sinh học của cây Ý dĩ; số lượng mẫu là 10, trong đó giữ nguyên 4 mẫu đã được nghiên cứu năm 2012... nghiên cứu tính đa dạng sinh học của 6 mẫu Ý dĩ, chủ yếu là các giống hoang dại có nguồn gốc từ 6 tỉnh ở miền Bắc Việt Nam (Hà Nội, Quảng Ninh, Điện Biên, Bắc Giang, Hòa Bình, Lạng Sơn) Các mẫu Ý dĩ được gieo trồng trong cùng một điều kiện và trong cùng một mùa vụ tại Vườn thực vật Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội, và được nghiên cứu xác định tính đa dạng về đặc điểm hình thái và nông học, ... 4, phần mềm PAUP - Phần mềm xử lý HPTLC: WinCat version 1.7.4 - Phần mềm gióng hàng trình tự nucleotid Bioedit 2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Nghiên cứu đa dạng về đặc điểm hình thái và nông học 2.2.1.1 Mục đích Xác định sự đa dạng về đặc điểm hình thái và nông học của 10 mẫu Ý dĩ (Bảng 2.1) được gieo trồng tại Vườn thực vật, Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội 2.2.1.2 Cách làm... Các chỉ tiêu nông – sinh học theo dõi được từ tháng 12/2012 đến tháng 05/2013 2 Phụ lục 2 Bảng mã hóa các biến số đặc điểm hình thái và chỉ tiêu nông – sinh học 3 Phụ lục 3 Kết quả chồng peak sắc ký 10 mẫu Ý dĩ 4 Phụ lục 4 7 đoạn trình tự nucleotid dùng để so sánh từ ngân hàng gen quốc tế 5 Phụ lục 5 Trình tự nucleotid của 9 mẫu Ý dĩ 6 Phụ lục 6 Độ tương đồng di truyền của 9 mẫu Ý dĩ 7 Phụ lục 7 Kết... progesterone, dịch chiết methanol thân Ý dĩ làm giảm tiết testosterol [22] 1.1.5 Công dụng và sử dụng của cây Ý dĩ 1.1.5.1 Tính vị, quy kinh, công năng, chủ trị [14] - Theo Y học cổ truyền, Ý dĩ có vị ngọt, nhạt, tính hơi hàn; quy vào 5 kinh Tỳ, Vị, Phế, Can, Đại tràng - Công năng chủ trị: • Lợi thủy: Dùng để trị các bệnh phù thũng, tiểu tiện khó khăn, đái buốt Dùng hạt hoặc cây, lá, rễ, sắc uống • Kiện tỳ... nucleotid của 9 mẫu Ý dĩ và 7 đoạn trình tự so sánh 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ý dĩ (Coix lachryma-jobi L.), họ Lúa (Poaceae), là cây thuốc đã được sử dụng lâu đời và phổ biến trên Thế giới cũng như ở Việt Nam với nhiều công dụng Rễ Ý dĩ dùng để chữa viêm nhiễm đường niệu, sỏi thận, thủy thũng, phong thấp đau xương, trẻ em ỉa chảy, bạch đới, rối loạn kinh nguyệt, kinh bế, trừ giun đũa, đau bụng giun Hạt Ý dĩ được... khoa học của 10 mẫu Ý dĩ do PGS.TS Trần Văn Ơn (Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội) thẩm định - Dựa vào các chỉ tiêu theo dõi được, các đặc điểm khác nhau được mã hóa tạo thành ma trận dữ liệu và được phân tích bằng phép phân tích chùm (Cluster Analysis), sử dụng phần mềm PCORD 2.2.2 Nghiên cứu đa dạng về di truyền 2.2.2.1 Mục đích - Xác định sự đa dạng về di truyền dựa vào trình tự DNA của . vậy, việc xác định tính đa dạng sinh học của cây Ý dĩ ở miền Bắc Việt Nam là cần thiết. Năm 2012, Dược sĩ Nguyễn Kim Khanh đã nghiên cứu sự đa dạng sinh học của 6 mẫu Ý dĩ ở miền Bắc Việt Nam Nghiên cứu tính đa dạng sinh học của cây Ý dĩ được tiếp tục thực hiện với 2 mục tiêu chính là: 1. Xác định tính đa dạng về đặc điểm hình thái, nông học và di truyền của một số giống Ý dĩ. . dung và phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Nghiên cứu đa dạng về đặc điểm hình thái và nông học 21 2.2.2 Nghiên cứu đa dạng về di truyền 24 2.2.3 Nghiên cứu về hóa học bằng phương pháp