B Y T TRƯNG ĐI HC DƯC H NI ********** NGUYN TIN TIP NGHIÊN CU THNH PHN HA HC L ĐU Đ RNG (Trevesia palmata (Roxb. & Lindl.) Vis.) KHA LUN TT NGHIP DƯC SĨ H NI – 2014 B Y T TRƯNG ĐI HC DƯC H NI ********** NGUYN TIN TIP NGHIÊN CU THNH PHN HA HC L ĐU Đ RNG (Trevesia palmata (Roxb. & Lindl.) Vis.) KHA LUN TT NGHIP DƯC SĨ Ngưi hưng dn: TS. Đ Quyên Nơi thc hin: B môn Dưc liu Trưng Đi hc Dưc H Ni H NI – 2014 LI CM ƠN Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, tôi đã nhận được nhiều sự hướng dẫn và giúp đỡ của thầy cô, gia đình và bạn bè. Để hoàn thành khóa luận này, trước hết tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đ Quyên, người thầy giàu lòng đam mê, đã luôn tận tình hướng dẫn, động viên, truyền đạt cho tôi rất nhiều kiến thức và niềm đam mê trong công việc. Tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới ThS. Phạm Tuấn Anh, người thầy đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt cho tôi những kiến thức cũng như những kinh nghiệm nghiên cứu khoa học quý báu. Thầy là tấm gương sáng trong nghiên cứu. Phong cách làm việc của thầy đã tạo cho tôi niềm đam mê lớn. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Quỳnh Chi và Th.S. Lê Thanh Bình – hai cô giáo luôn nhiệt tình và tận tâm với nghiên cứu. Những hỗ trợ quý báu của hai cô giúp tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên đang công tác tại bộ môn Dược Liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận. Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn tất cả các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy bảo, truyền đạt kiến thức cho tôi trong những năm học vừa qua. Cuối cùng, cho phép tôi bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới gia đình, bạn bè những người đã luôn quan tâm, động viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi hoàn thành tốt khóa luận này. Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Tiến Tip MC LC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TNG QUAN 2 1.1. CHI Trevesia Vis. VÀ LOÀI Trevesia palmata (Roxb. & Lindl.) Vis. 2 1.1.1. Đặc điểm thc vật 2 1.1.2. Thnh phn ha hc của chi Trevesia Vis. v cây Đu đủ rừng 7 1.1.3. Tc dng v công dng của cây Đu đủ rừng 8 1.2. TRITERPENOID 9 1.2.1. Sơ lược về cơ chế hình thành các triterpenoid 9 1.2.2. Phân loại triterpenoid 12 1.2.3. Đặc điểm của phn đưng trong triterpenoid 14 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIU, PHƯƠNG TIN, NI DUNG V PHƯƠNG PHP NGHIÊN CU 16 2.1. NGUYÊN LIU NGHIÊN CU 16 2.2. PHƯƠNG TIN NGHIÊN CU 17 2.2.1. My mc v thiết b nghiên cu 17 2.2.2. Ha chất, dung môi 17 2.3. NI DUNG NGHIÊN CU 17 2.4. PHƯƠNG PHP NGHIÊN CU 17 2.4.1. Đnh tnh cc nhm chất hu cơ 17 2.4.2. Chiết xuất phân đoạn cc nhm chất 18 2.4.3. Phân lập v xc đnh cấu trc ha hc của các chất 18 CHƯƠNG 3. THC NGHIM V KT QU VÀ BÀN LUN 19 3.1. THC NGHIM VÀ KT QU 19 3.1.1. Đnh tnh cc nhm chất trong l Đu đủ rừng 19 3.1.2. Quy trình chiết xuất l Đu đủ rừng 20 3.1.3. Đnh tính cắn phân đoạn n-hexan/ethylacetat và ethylacetat 23 3.1.4. Phân tích chất từ cắn phân đoạn n-hexan/ethyl acetat bằng GC-MS 26 3.1.5. Phân lập và nhận dạng chất từ cắn phân đoạn ethylacetat 27 3.2. BÀN LUN 35 KT LUN VÀ KIN NGHỊ 37 1. KT LUN 37 2. ĐỀ XUẤT 37 TÀI LIU THAM KHO 38 DANH MC CC KÍ HIU, CH VIT TT CHCl 3 Cloroform 13 C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon d Doublet DC 1 Dịch chiết 1 DC 2 Dịch chiết 2 DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer E Cắn phân đoạn ethyl acetat ESI/MS Electrospray ionization/ Mass spectrum EtOH Ethanol EtOAc Ethyl acetat H Cắn phân đoạn n-hexan HE Cắn phân đoạn n-hexan/ethyl acetat [5:1] 1 H-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton m/z Tỷ lệ số khối/ Điện tích ion MSTB Mã số tiêu bản n-hex n-hexan OSC Enzym Oxidosqualene cyclases SKLM Sắc kí lớp mỏng t Triplet TT Thuốc thử DANH MC CC BNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Cấu trúc 11 khung cấu trúc chính triterpenoid và một số dẫn chất của chúng 12 Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất trong lá Đu đủ rừng 20 Bảng 3.2 Kết quả định tính các nhóm chất chính trong lá Đu đủ rừng khi chiết xuất bằng các dung môi khác nhau 21 Bảng 3.3 Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học của 2 phân đoạn HE và E 24 Bảng 3.4 So sánh số carbon bậc 1, 2, 3 và 4 của 2 chất glycosid của stigmasterol và sitosterol 33 DANH MC CC HNH STT Tên hình Trang Hình 1.1 Cấu trúc aglycon của các saponin phân lập từ hai loài Trevesia palmata (Roxb. & Lindl) Vis. và Trevesia sundaica Miq. 7 Hình 1.2 Cơ chế hình thành một số khung cấu trúc triterpen loại monocylic, bicyclic và tricyclic [26]. 10 Hình 1.3 Cơ chế hình thành một số khung cấu trúc triterpen tetracylic 11 Hình 1.4. Cơ chế hình thành một số khung cấu trúc triterpen pentacylic 11 Hình 2.1 Cây Đu đủ rừng trên thực địa và cụm hoa 16 Hình 3.1 Tóm tắt quy trình chiết xuất các nhóm chất trong lá Đu đủ rừng 23 Hình 3.2 Sắc kí đồ cắn phân đoạn n-Hexan/Ethyl acetat khi triển khai với hệ dung môi Toluen/ethyl acetat/acid formic [3 : 1 : 0,1] 25 Hình 3.3 Sắc kí đồ cắn phân đoạn ethyl acetat khi triển khai với hệ dung môi Toluen/ethyl acetat/methanol/acid formic [8 : 6 : 0,3 : 0,7] 26 Hình 3.4 Sắc kí đồ của TP-ET-02 khai triển với các hệ dung môi I, II, và III khi hiện màu bằng TT vanillin/ H 2 SO 4 29 Hình 3.5 Phổ khối MS-ESI positive của chất TP-ET-02 30 Hình 3.6 Cấu trúc của stigmasterol và sitosterol 31 Hình 3.7 Phổ 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) của chất TP-ET-02 (4,9÷5,4 ppm) 32 Hình 3.8 Phổ 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) của chất TP-ET-02 (4,2÷4,9 ppm) 32 Hình 3.9 Phổ 13 C-NMR và DEPT của chất TP-ET-02 34 Hình 3.10 Công thức cấu tạo của β-stigmasterol-3-O-β-Dglucopyranosit 34 Hình 3.11 Công thức cấu tạo của β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosit 35 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Họ Nhân sâm (Araliaceae) trong hệ thực vật Việt Nam khá phong phú và đa dạng về đặc điểm hình thái cũng như thành phần hóa học [7]. Hầu như tất cả các loài trong họ Nhân sâm đều được sử dụng làm thuốc trong Y học cổ truyền ở nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là ở các nước Đông Bắc Á. Trevesia Vis. là một chi thuộc họ Nhân sâm, gồm khoảng hơn 10 loài, là những cây thuốc quý, có giá trị, hiện đã và đang được sử dụng khá rộng rãi trong Y học dân tộc Việt Nam, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Ấn Độ và nhiều nước khác. Các nhà khoa học đã xác định ở Việt Nam chi Trevesia Vis. gồm có 6 loài phân bố rộng rãi khắp cả nước, cây thường mọc ở vùng rừng đệm, rừng xanh hay dọc bờ sông suối [4]. Trevesia palmata (Roxb. & Lindl.) Vis. , tên thường gọi là Đu đủ rừng, Thông thảo gai…là một loài thuộc chi Trevesia Vis., mọc ở trên các sườn núi c độ cao 600 – 2000 m [11], hoặc dọc theo các sông, suối, ở thung lũng các rừng phục hồi [2]. Đu đủ rừng đã được sử dụng từ lâu theo kinh nghiệm dân gian và Y học cổ truyền. Theo Đông Y, li thân c tác dụng lợi tiểu, lợi ph, lợi sữa, dng để chữa ph thũng, đái dắt, tê thấp, làm thuốc hạ nhiệt, và cũng được xem như một vị thuốc bổ; lá chữa gãy xương [2]. Tuy nhiên ở Việt Nam, loài cây này chưa được nghiên cứu. Trên thế giới cho đến nay mới chỉ có một nghiên cứu về thành phần hóa học. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cu thành phn hóa hc lá Đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb. & Lindl.) Vis.)”. Để thực hiện được đề tài này, nội dung nghiên cứu bao gồm: - Định tính các nhóm chất hữu cơ trong lá Đu đủ rừng; - Chiết xuất và chiết phân đoạn dịch chiết lá Đu đủ rừng; - Phân lập và xác định cấu trúc ha học của chất phân lập được từ lá Đu đủ rừng. 2 CHƯƠNG 1. TNG QUAN 1.1. CHI Trevesia Vis. VÀ LOÀI Trevesia palmata (Roxb. & Lindl.) Vis. 1.1.1. Đặc điểm thc vật 1.1.1.1. V tr phân loại chi Trevesia Vis. Theo hệ thống phân loại của Takhtajan được ghi trong cuốn Flowering plants [22], cây Đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb. & Lindl.) Vis.) thuộc chi Trevesia Vis., một chi nằm trong họ Nhân sâm (Araliaceae).Vị trí phân loại của chi Trevesia Vis. trong hệ thống phân loại thực vật chính thức c thể được tm tắt như sau: Ngành Ngọc lan Magnoliophyta Lớp Ngọc lan Magnoliopsida Phân lớp Sổ Dilleniidae Liên bộ Cornanae Bộ Nhân sâm (Hoa tán) Apiales Họ Nhân sâm (Ngũ gia bì) Araliaceae Chi Trevesia Vis. 1.1.1.2. Đặc điểm hình thái v phân b của chi Trevesia Vis. Họ Nhân sâm khá đa dạng về đặc điểm hình thái. Ở Việt Nam hiện nay ghi nhận được 18 chi thuộc họ này, trong đ c chi Trevesia Vis. [7]. Chi Trevesia Vis. là những cây bụi hay cây gỗ nhỏ thường xanh, hiếm khi phân nhánh; thân có gai (ở cây già, những gai này bị tiêu biến). Lá lớn, mọc so le, có thùy chân vịt hay kép chân vịt, có cuống, mép lá khía răng cưa; số thùy 5 – 13. Lá kèm dính với gốc cuống lá thành bẹ chìa có 2 thùy. Cụm hoa tán nhiều hoa, hợp lại thành chùy hoặc chùm; tổng số tán 1 – 25, mỗi tán mang 9 – 65 hoa. Lá bắc bền hoặc rụng sớm. Hoa lưỡng tính. Đài c mép dạng sng hay c răng nhỏ. Cánh hoa 6 – 16, xếp van, thường thì hợp thành thể dạng mũ rụng sớm. Nhị bằng số cánh hoa. Bầu dưới, 6 – 16 ô, vòi nhụy hợp thành cột ngắn, mỗi ô có 1 noãn treo. Quả hạch hình cầu – trứng; hạt 1 [2], [11], [16]. Trên thế giới, chi Trevesia Vis. c khoảng hơn 10 loài phân bố ở vng Đông Nam , Ấn Độ, Nepal, Bu-tan, Băng La Đét và Tây Nam Trung Quốc [11], [16]. [...]... Cúc Phương (Ninh Bình), Mộc Châu (Sơn La) [25] 1.1.2 Thành phần hóa học của chi Trevesia Vis và cây Đu đủ rừng Cho đến nay những nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài trong chi Trevesia Vis., kể cả trong nước và nước ngoài vẫn còn rất hạn chế Chúng tôi mới chỉ tìm được hai nghiên cứu nước ngoài về thành phần saponin của hai loài thuộc chi Trevesia Vis., đó là loài T palmata (Roxb & Lindl.)... dụng dược lý của Đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb & Lindl.) Vis.) Năm 1999, Nunziatina De Tommasi và cộng sự (Ý) đã chứng minh dịch chiết saponin thô từ lá Đu đủ rừng và một số saponin phân lập được đều thể hiện tác dụng chống tăng sinh tế bào trên các dòng tế bào J774, HEK-293c, WEHI-164d [12] Một nghiên cứu ở Thái Lan đã cho thấy dịch chiết ethanol phần trên mặt đất cây Đu đủ rừng có tác dụng... loài T palmata (Roxb & Lindl.) Vis Tuy nhiên một nghiên cứu khác ở Thái Lan sử dụng các phản ứng định tính các nhóm chất hóa học đặc trưng, đã cho thấy trong cây Trevesia palmata (Roxb & Lindl.) Vis (thu hái ở Thái Lan) có triterpen tự do, lacton glycosid; không có saponin, flavonoid, tanin, alcaloid [17] 1.1.3 Tác dụng và công dụng của cây Đu đủ rừng Hiện nay trên thế giới có rất ít nghiên cứu. .. nghiền thành bột thô và bảo quản trong túi nilon kín, để nơi thoáng mát, khô ráo Mẫu nghiên cứu có hoa được làm tiêu bản, lưu tại Phòng tiêu bản Bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội, MSTB: HNIP/18064/14 TS Nguyễn Quốc Huy - bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội, giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu là Trevesia palmata (Roxb & Lindl) Vis., thuộc họ Nhân sâm (Araliaceae) Hình 2.1 Cây Đu đủ rừng. .. Sterol +++ Có Ghi chú: (- ) Phản ứng âm tính (+ ) Phản ứng dương tính (+ +) Phản ứng dương tính rõ (+ ++) Phản ứng dương tính rất rõ Nhận xét: Trong lá cây Đu đủ rừng (Trevesia palmata Roxb ex Lind Vis) có các nhóm chất: saponin triterpenoid, acid hữu cơ, đường khử, sterol, polysaccarid và chất béo Trong đó saponin triterpenoid là nhóm chất chính 3.1.2 Quy trình chiết xuất lá Đu đủ rừng 3.1.2.1 Khảo sát... thuộc chi Trevesia Vis ở Việt Nam 1.1.1.4.1 Trevesia palmata (Roxb & Lindl.) Vis Ở Việt Nam gọi là Đu đủ rừng, Nhật phiến, Thôi hoang, Thông thảo gai, Thầu dầu núi [1] Là cây nhỡ cao 7 – 8 m hoặc hơn, thân ít phân nhánh, cành có gai, ruột xốp Lá đơn, phiến lá phân thuỳ chân vịt, xẻ sâu như lá thầu dầu, có 5-9 thuỳ nhọn có răng, gân nổi ở hai mặt, mép lá có răng cưa thô; cuống lá dài và có gai Lá non... TQMS tại Viện hóa học  Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13 C-NMR BRUKER AVANCE AM500 FT-NMR tại Viện hóa học 2.2.2 Hóa chất, dung môi Các hóa chất do phòng Giáo tài Đại học Dược Hà Nội cung cấp Các dung môi đạt chuẩn phân tích, thí nghiệm 2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Định tính các nhóm hợp chất hữu cơ trong lá Đu đủ rừng - Chiết xuất và chiết phân đoạn dịch chiết lá Đu đủ rừng - Phân lập... 3 saponin monodesmosid, nhưng tất cả đều có phần aglycon là acid oleanolic hoặc dẫn chất của acid này Hình 1.1 Cấu trúc aglycon của các saponin phân lập từ hai loài Trevesia palmata (Roxb & Lindl) Vis và Trevesia sundaica Miq Ở vị trí R2 là nhóm methyl ( CH3) hoặc nhóm thế alcol ( CH2OH); R3 là hydro ( H) hoặc nhóm thế hydroxy ( OH) 8 Trong loài T palmata (Roxb & Lindl.) Vis., mạch đường của các saponin... phân đoạn dịch chiết lá Đu đủ rừng - Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được từ dịch chiết lá Đu đủ rừng 2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.4.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ Chiết xuất và định tính các nhóm chất hữu cơ trong lá Đu đủ rừng bằng các phản ứng hóa học đặc trưng theo các tài liệu Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc [6] và Dược liệu học tập 1 [5] Định... là: Trevesia palmata (Roxb & Lindl.) Vis., Trevesia sphaerocarpa Grushv et Skvorts., Trevesia longipedicellata Grushv et Skvorts., Trevesia cavaleriei (Lév) Grushv & Skvorts., Trevesia burckii Boerl [1], [3] Năm 2007, Phan Kế Lộc và cộng sự đã phát hiện thêm một loài mới thuộc chi Trevesia Vis ở Việt Nam, đặt tên là Trevesia vietnamensis J Wen & P.K Lôc [25] Có thể phân biệt một số loài thuộc chi Trevesia . chúng tôi thực hiện đề tài Nghiên cu thành phn hóa hc lá Đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb. & Lindl.) Vis.)”. Để thực hiện được đề tài này, nội dung nghiên cứu bao gồm: - Định tính. ít nghiên cứu về tác dụng dược l của Đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb. & Lindl.) Vis.). Năm 1999, Nunziatina De Tommasi và cộng sự ( ) đã chứng minh dịch chiết saponin thô từ lá Đu đủ. T. palmata (Roxb. & Lindl.) Vis. Tuy nhiên một nghiên cứu khác ở Thái Lan sử dụng các phản ứng định tính các nhóm chất hóa học đặc trưng, đã cho thấy trong cây Trevesia palmata (Roxb. &