BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NGỌC HIẾU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY HƯƠNG NHU TÍA (OCIMUM SANCTUM L.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN NGỌC HIẾU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY HƯƠNG NHU TÍA (OCIMUM SANCTUM L.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn : 1. TS. Nguyễn Văn Tài 2. TS. Đỗ Quyên Nơi thực hiện : 1. Khoa Hóa thực vật - Viện Dược liệu 2. Bộ môn Dược liệu - trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Khóa luận này là kết quả của quá trình học tập tại trường Đại học Dược Hà Nội và quá trình nghiên cứu của em tại Viện Dược liệu. Với tình cảm chân thành, em xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy cô tại khoa Hóa Thực vật - Viện Dược liệu và các thầy cô ở bộ môn Dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho em trong quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành khóa luận này. Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và tri ân đến Tiến sỹ Nguyễn Văn Tài và Tiến sỹ Đỗ Quyên, dù bận rất nhiều công việc nhưng đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, dìu dắt em trong quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn chỉnh khóa luận. Mặc dù bản thân đã rất cố gắng trong lần đầu tiên nghiên cứu khoa học nhưng chắc chắn khóa luận không tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý giá của các thầy cô. Hà Nội, tháng 5 năm 2013 Sinh viên Nguyễn Ngọc Hiếu MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1 Đặc điểm thực vật chi Ocimum L. 2 1.2. Thành phần hóa học của Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) 5 1.3 Tổng quan về acid ursolic 6 CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Đối tượng nghiên cứu 12 2.2 Phương pháp nghiên cứu 13 CHƯƠNG 3 : THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 15 3.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng hóa học 15 3.2 Định tính acid ursolic trong cành lá Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) bằng SKLM 22 3.3 Phân lập acid ursolic từ cành lá Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) bằng sắc ký cột 23 3.4 Xây dựng quy trình chiết tách acid ursolic từ Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) 29 BÀN LUẬN 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 PHỤ LỤC 43 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CTCT công thức cấu tạo DCM dichloromethan dd dung dịch EtOAc ethyl acetat EtOH ethanol IR Phổ hồng ngoại kl khối lượng MeOH methanol NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân MS Phổ khối R f hệ số lưu SKLM sắc ký lớp mỏng tt thể tích TT thuốc thử DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 : Hàm lượng acid ursolic trong lá của các loài thuộc chi Ocimum L. 6 Bảng 3.1 : Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong cành, lá Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) bằng phản ứng hóa học. 21 Bảng 3.2 : Phổ 1 H, 13 C-NMR của D1 và acid ursolic. 27 Bảng 3.3 : Hàm lượng acid ursolic thô (%) khi chiết bằng các dung môi khác nhau. 32 Bảng 3.4 : Hàm lượng acid ursolic thô (%) khi chiết ở các nhiệt độ khác nhau. 34 Bảng 3.5 : Hàm lượng acid ursolic thô (%) khi chiết với tỷ lệ dung môi/dược liệu khác nhau. 34 Bảng 3.6 : Hàm lượng acid ursolic thô (%) với số lần chiết khác nhau. 35 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ Hình 1.1 : CTCT của acid ursolic. 7 Hình 1.2 : CTCT của acid corosolic. 9 Hình 1.3 : Sơ đồ bán tổng hợp acid corosolic từ acid ursolic. 9 Hình 1.4 : Sơ đồ chiết xuất và tinh chế acid ursolic từ lá Hồng (Diospyros kaki). . 10 Hình 1.5 : Sơ đồ chiết xuất và tinh chế acid ursolic từ vỏ táo (Malus domestica) 11 Hình 3.1 : Sắc ký đồ của cắn MeOH toàn phần với acid ursolic đối chứng trên các hệ dung môi khai triển. 22 Hình 3.2 : Tóm tắt quy trình chiết xuất các phân đoạn từ cành, lá Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) 24 Hình 3.3 : Sắc ký đồ các cắn phân đoạn với acid ursolic đối chứng. 25 Hình 3.4 : Sắc ký đồ acid ursolic thô và sau khi kết tinh với chất đối chứng 31 Hình 3.5 : Sắc ký đồ acid ursolic thô của các mẻ chiết bằng các dung môi khác nhau 33 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hương nhu tía từ lâu đã được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền làm thuốc điều trị cảm nắng, cảm hàn, sốt nóng sợ rét, nhức đầu, đau bụng Dược điển Việt Nam IV có chuyên luận về Hương nhu, xem hai loài Hương nhu trắng (Ocimum gratissimum L.) và Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) được sử dụng như nhau trong điều trị. Thực tế, cây Hương nhu trắng là nguồn nguyên liệu chiết xuất tinh dầu Hương nhu và điều chế eugenol, còn cây Hương nhu tía chủ yếu dùng trong Y học cổ truyền. Trên thế giới, Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.) được dùng như một nguồn nguyên liệu giàu acid ursolic, do có chứa hàm lượng acid ursolic cao [19, 22]. Acid ursolic là một saponin thuộc nhóm ursan đã được chứng minh có nhiều tác dụng sinh học đáng chú ý như chống viêm, bảo vệ gan, hạ lipid máu, chống khối u [10, 15]. Đặc biệt acid ursolic còn là một chất trung gian quan trọng để bán tổng hợp nhiều chất có hoạt tính sinh học cao như acid corosolic (một chất ức chế glycogen phosphorylase được nghiên cứu nhiều trong điều trị đái tháo đường) [20, 24]. Xuất phát từ thực tế cây Hương nhu tía ở Việt Nam chưa được nghiên cứu nhiều về thành phần acid ursolic, chúng tôi đã thực hiện đề tài : "Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.)" với các nội dung chính như sau : - Định tính các nhóm chất hữu cơ trong cành, lá Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.). - Chiết xuất, phân lập acid ursolic từ cành lá Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.). - Xây dựng quy trình chiết xuất acid ursolic từ Hương nhu tía (Ocimum sanctum L.). - Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng acid ursolic chiết từ dược liệu. 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm thực vật chi Ocimum L. 1.1.1. Vị trí phân loại chi Ocimum L. Theo hệ thống phân loại của Takhtajan 1987, chi Ocimum L. thuộc : • Giới thực vật (Plantae) • Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) • Lớp Ngọc lan (Magnoliidae) • Phân lớp Bạc hà (Lamidae) • Bộ Bạc hà (Lamiales) • Họ Bạc hà (Lamiaceae) • Chi Ocimum L. [4] 1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Ocimum L. Chi Ocimum L. thuộc họ Bạc hà (Lamiaceae), tên gọi có thể bắt nguồn từ ozo, ozein nghĩa là toát mùi thơm, liên quan đến mùi thơm phảng phất của các cây thuộc chi này; hoặc do chữ okimon, okys nghĩa là nhanh, cấp tốc vì các cây này mọc rất nhanh. Tên khác của chi : Hương nhu, Húng, É. Cỏ hay cây bụi nhỏ, sống hằng năm hay sống nhiều năm. Thân thường vuông, nhẵn hay có lông. Lá mọc đối, mép nguyên hay xẻ răng cưa, có lông hay nhẵn, thường có các điểm tuyến tròn trên phiến. Cụm hoa dạng chùy hay hình tháp, gồm các xim bó tạo thành các vòng giả, mỗi vòng thường có 6 hoa. Lá bắc tồn tại hay sớm rụng. Đài hình chuông, thường có lông và điểm tuyến ở phía ngoài, 2 môi; môi trên có một thùy lớn ít nhiều men xuống ống; môi dưới 4 thùy, với 2 thùy bên nhọn ngắn, 2 thùy dưới nhọn, dài. Tràng có ống thò khỏi đài, nhẵn hay có lông, 2 môi : môi trên 4 thùy ngắn; môi dưới một thùy dài và lớn hơn môi trên, hơi cong và lõm hình thuyền. Nhị 4, hướng xuống môi dưới, chỉ nhị ít nhiều thò khỏi ống tràng, bao phấn hình trứng hay hình thận, 1 ô. Bầu nhẵn, vòi nhụy xẻ 2 thùy ở đỉnh. Đĩa mật [...]... Hương nhu tía, theo Dược điện Việt Nam IV, dược liệu phải chứa ít nhất 0,5% tinh dầu (tính theo dược liệu khô tuyệt đối) [3] Về thành phần hóa học, tinh dầu hương nhu tía Việt Nam chứa các thành phần chính l eugenol (trên 70 %), methyleugenol (trên 12 %) và β-caryophylen [7] Thành phần hóa học khác trong cây : - Hương nhu tía chứa các hợp chất thuộc nhóm flavonoid như apigenin, luteolin, apigenin-7-glucuronid,... nhóm chất hữu cơ có trong cây Hương nhu tía (Ocimum sanctum L. ) Định tính các nhóm chất chính trong dược liệu theo phương pháp hóa học ghi trong sách Thực tập Dược liệu và Bài giảng Dược liệu tập 1 của trường Đại học Dược Hà Nội [1, 2] 2.2.2 Định tính acid ursolic trong cành l Hương nhu tía (Ocimum sanctum L. ) bằng SKLM - Bản mỏng Silicagel GF254 pha thuận (Merck) được hoạt hóa trong vòng 1 giờ ở nhiệt... apigenin-7-glucuronid, luteolin-7-glucuronid, orientin và nhóm polyphenol như : acid galic, acid galic methylester, acid galic ethylester, acid protocatechic, acid rosmarinic [7] - Acid ursolic l một thành phần quan trọng và có hàm l ợng cao trong Hương nhu tía + Năm 2008, Silva MG và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu hàm l ợng acid ursolic trong l của 8 loài thuộc chi Ocimum L. , đó l : O americanum, O basilicum,... trí số 2-alpha) 9 Hình 1.2 : CTCT của acid corosolic X.Wen et al (200 7) đã tổng hợp acid corosolic từ acid ursolic theo sơ đồ [24] Hình 1.3 : Sơ đồ bán tổng hợp acid corosolic từ acid ursolic 1.3.4 Một số phương pháp phân l p acid ursolic 1.3.4.1 Phân l p acid ursolic từ l Hồng (Diospyros kaki L. f .) Nguyễn Thị Ngọc Lan (201 2) đã chiết tách acid ursolic từ l Hồng (Diospyros kaki L. f .) l m chất đối... phytosterol, 22 tinh dầu và bằng phương pháp này không thấy sự có mặt của alcaloid, tanin, anthranoid, acid amin, đường khử, chất béo và carotenoid Như vậy, theo kết quả định tính ở trên, trong thành phần hóa học của Hương nhu tía có nhóm saponin triterpenoid Tiếp theo chúng tôi sẽ tiến hành định tính acid ursolic trong Hương nhu tía bằng SKLM 3.2 Định tính acid ursolic trong cành l Hương nhu tía (Ocimum sanctum. .. hơi l nh, không thấy trồng Hương nhu tía mọc từ hạt vào khoảng cuối mùa xuân, sinh trưởng nhanh trong mùa hè, đến cuối mùa thu hay đầu mùa đông thì tàn l i Cây ra hoa quả nhiều Quả chín tự mở, hạt rơi xuống đất và nảy mầm sau 5 - 6 tháng Cây trồng dễ dàng bằng hạt [7] 5 1.2 Thành phần hóa học của Hương nhu tía (Ocimum sanctum L. ) Tinh dầu : đây l thành phần đáng chú ý và có giá trị cao trong cây Hương. .. ursolic đối chứng khi dùng thuốc thử H2SO4 10% trong EtOH, do đó có thể sơ bộ xác định trong mẫu Hương nhu tía nghiên cứu có acid ursolic 3.3 Phân l p acid ursolic từ cành l Hương nhu tía (Ocimum sanctum L. ) bằng sắc ký cột Chiết hồi l u 1 kg dược liệu đã xay nhỏ (độ ẩm 15,63 %) với dung môi MeOH ở nhiệt độ 600C trên bếp cách thủy, chiết 3 l n, mỗi l n với 5 L dung môi trong 2 giờ Gộp các dịch chiết, l c... l ợng phân tử của D1 l 456,31 ứng với công thức phân tử C30H48O3 của acid ursolic (phụ l c 3) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR : dữ liệu phổ NMR của chất được thể hiện ở bảng 3.3 (phụ l c 4, 5) Bảng 3.2 : Phổ 1H, 13C-NMR của D1 và acid ursolic Phổ NMR của D1 carbon Phổ NMR của acid ursolic (CDCl3/MeOD) Vị trí (DMSO-d 6)[ 19] δc (ppm) δH (ppm) δc (ppm) δH (ppm) 1 36,87 1,54 (2H,m) 38,22 1,56 (2H,m) 2 26,79... tính alcaloid L y 5 g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50 mL, thêm dung dịch H2SO4 2% cho ngập dược liệu, đun sôi vài phút Để nguội, l c dịch chiết vào bình gạn, kiềm hóa dịch l c bằng dung dịch amoniac 6N đến pH kiềm Chiết alcaloid bằng cloroform (CHCl 3) 3 l n, mỗi l n 5 mL Dịch chiết cloroform được gộp l i và l c với H2SO4 2% Gạn l y l p nước acid, cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống khoảng 1 mL rồi... tới thành phố Hồ Chí Minh • Ocimum sanctum L (tên khác O tenuiflorum L. ) - Hương nhu tía, É tía, É đỏ, É rừng Ở nước ta, có gặp từ Hòa Bình, Bắc Giang, Hà Nội, Ninh Bình vào Khánh Hòa, Ninh Thuận, thành phố Hồ Chí Minh cho đến An Giang Cũng được trồng ở nhiều nơi [5] 1.1.4 Đặc điểm thực vật loài Hương nhu tía (Ocimum sanctum L. ) 1.1.4.1 Tên gọi • Tên khoa học : Ocimum sanctum L (tên khác : O tenuiflorum) . " ;Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Hương nhu tía (Ocimum sanctum L. )& quot; với các nội dung chính như sau : - Định tính các nhóm chất hữu cơ trong cành, l Hương nhu tía (Ocimum sanctum. chuyên luận về Hương nhu, xem hai loài Hương nhu trắng (Ocimum gratissimum L. ) và Hương nhu tía (Ocimum sanctum L. ) được sử dụng như nhau trong điều trị. Thực tế, cây Hương nhu trắng l nguồn. phần hóa học của Hương nhu tía (Ocimum sanctum L. ) 5 1.3 Tổng quan về acid ursolic 6 CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1 Đối tượng nghiên cứu 12 2.2 Phương pháp nghiên cứu