BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN MAI HƯƠNG NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TINH BỘT LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU PROBIOTIC CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN MAI HƯƠNG NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TINH BỘT LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU PROBIOTIC CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: DS. Lê Ngọc Khánh DS. Trần Văn Thái Nơi thực hiện: BM Công nghiệp dược HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới DS. Lê Ngọc Khánh và DS. Trần Văn Thái, những người thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi từ những ngày đầu đến khi em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn TS. Đàm Thanh Xuân đã nhiệt tình giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp em thực hiện đề tài. Đồng thời, em cũng xin cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡ của các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên trong Bộ môn Công nghiệp Dược trong suốt quá trình làm đề tài nghiên cứu và thực nghiệm tại bộ môn. Nhân dịp này, em xin được gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã quan tâm, dạy dỗ trong thời gian em học tập tại trường. Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè đã động viên giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình học tập và trong cuộc sống. Em xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Mai Hương MỤC LỤC Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, đồ thị Trang ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Vi khuẩn lactic 2 1.1.1. Đặc điểm của vi khuẩn lactic 2 1.1.2. Loài Lactobacillus acidophilus 3 1.2. Tổng quan về vi nang hóa probiotic 5 1.2.1. Khái niệm, đặc điểm vi nang hóa probiotic 5 1.2.2. Ưu, nhược điểm của phương pháp vi nang hóa 6 1.2.3. Phương pháp tách pha đông tụ 7 1.2.4. Alginat 9 1.2.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về vi nang hóa 11 1.3. Các tá dược bảo vệ trong đông khô vi sinh vật 11 1.3.1. Lý thuyết đông khô 11 1.3.2. Các tá dược bảo vệ thường dùng trong đông khô vi sinh vật 12 1.3.3. Tinh bột 13 Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 15 2.1.1. Chủng vi sinh vật 15 2.1.2. Hóa chất 15 2.1.3. Môi trường 15 2.1.4. Máy móc, dụng cụ 15 2.2. Nội dung nghiên cứu 16 2.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất của nguyên liệu probiotic dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô 16 2.2.2. Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột và độ ổn định của nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trong quá trình bảo quản 17 2.3. Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1. Phương pháp nhân giống 17 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 17 2.3.3. Phương pháp vi nang hóa bằng alginat sử dụng kỹ thuật tách pha đông tụ 17 2.3.4. Phương pháp đông khô 18 2.3.5. Phương pháp xác định hàm ẩm 19 2.3.6. Phương pháp pha loãng liên tục để xác định số lượng VSV 19 Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất của nguyên liệu probiotic dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô 21 3.1.1. Đánh giá thể chất của các dạng nguyên liệu sau đông khô khi thay đổi nồng độ alginat 21 3.1.2. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất hạt vi nang sau đông khô 25 3.2. Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột và độ ổn định của nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trong quá trình bảo quản 29 3.2.1. Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột trong quá trình tạo nguyên liệu đông khô probiotic 29 3.2.2. Khảo sát lượng sinh khối thích hợp cho quá trình tạo nguyên liệu đông khô probiotic dạng vi nang 33 3.2.3. Khảo sát độ ổn định của nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa 36 tinh bột trong quá trình bảo quản KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 1. Kết luận 40 2. Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Am : Amylose Ap : Amylopectin ATCC (American Type Culture Collection) : Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ B. infantis : Bifidobacterium infantis Bifidobacterium spp. : Các loài thuộc chi Bifidobacterium C (Cytosine) : Xitozin Cfu (Colony-Forming Units) : Số đơn vị khuẩn lạc ĐK : Đông khô E. faecium : Enterococcus faecium G (Guanine) : Guanin IDF (Internation Dairy Federation) : Liên đoàn Sữa thế giới Kl/tt : Khối lượng/thể tích LAB (Lactic acid bacteria) : Nhóm vi khuẩn Lactic L. acidophilus : Lactobacillus acidophilus L. amylophilus : Lactobacillus amylophilus L. amylovorus : Lactobacillus amylovorus L. brevis : Lactobacillus brevis L. kefir : Lactobacillus kefir MRS (de Man, Rogosa, Sharpe) : Môi trường nuôi cấy vi khuẩn MRS MT : Môi trường PE (Polyethylene) : Polyetylen TB : Tinh bột VK : Vi khuẩn VSV : Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Các hóa chất dùng trong nghiên cứu 15 2.2 Các máy móc dùng trong nghiên cứu 16 3.1 Thể chất của các mẫu nguyên liệu chứa Lactobacillus acidophilus ngay sau đông khô khi thay đổi nồng độ alginat 22 3.2 Đường kính, hàm ẩm và thể chất của các mẫu nguyên liệu chứa Lactobacillus acidophilus ngay sau đông khô khi thay đổi nồng độ tinh bột 26 3.3 Số lượng vi khuẩn sống sót trong 5 mẫu sau đông khô 31 3.4 Số lượng vi khuẩn sống sót và hàm ẩm của các mẫu sau đông khô 34 3.5 Hàm ẩm của nguyên liệu trong thời gian bảo quản 37 3.6 Lượng vi sinh vật sống của nguyên liệu trong thời gian bảo quản 38 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Tên hình Trang 1.1 Trực khuẩn Lactobacillus acidophilus 5 1.2 Cấu trúc của acid alginic 10 1.3 Cấu trúc phân tử Ca-alginat 10 3.1 Vi nang Ca-alginat (2%) sau đông khô 23 3.2 Vi nang Ca-alginat (2%)-TB (10%) sau đông khô 23 3.3 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của hàm ẩm và đường kính vào nồng độ tinh bột của các mẫu sau đông khô 27 3.4 Đồ thị biểu diễn số lượng vi khuẩn sống sót của 5 mẫu sau đông khô 31 3.5 Đồ thị biểu diễn số lượng vi khuẩn sống sót của các mẫu sau đông khô 35 3.6 Đồ thị biểu diễn lượng vi sinh vật sống và hàm ẩm của nguyên liệu trong thời gian bảo quản 39 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Vi khuẩn probiotic được biết đến là một nhóm vi sinh vật mang lại nhiều lợi ích cho con người như: ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường ruột, cải thiện khả năng dung nạp lactose, tăng cường miễn dịch… [33] Tuy nhiên, các vi sinh vật này dễ bị ảnh hưởng bởi các điều kiện môi trường như: pH, nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm… [58] Khi sử dụng theo đường uống, pH acid, enzym tiêu hóa, acid mật… là các yếu tố làm giảm số lượng sống sót, ngăn cản việc thiết lập cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột. Ngoài ra, các thông số liên quan trong quá trình sản xuất cũng ảnh hưởng đến khả năng sống sót của vi khuẩn probiotic [46]. Do đó, để đảm bảo số lượng vi sinh vật trong chế phẩm và đem lại tác dụng mong muốn, cần tạo ra những nguyên liệu có khả năng cung cấp lượng vi sinh vật phù hợp và có thể chất thích hợp. Nhiều nghiên cứu được tiến hành nhằm tìm ra những biện pháp làm tăng khả năng chống chịu của vi khuẩn trước điều kiện bất lợi trong sản xuất, bảo quản và sử dụng. Một trong những phương pháp phổ biến để bảo quản chế phẩm sinh học là đông khô. Tuy nhiên, phương pháp này chỉ giúp bảo vệ chế phẩm khỏi độ ẩm chứ không bảo vệ chúng khỏi các yếu tố khác của môi trường [40]. Vì vậy, phương pháp vi nang hóa đã được nghiên cứu, ứng dụng giúp cách ly tế bào vi khuẩn với môi trường bất lợi nhằm giảm lượng vi sinh vật mất đi. Ngoài ra, sử dụng các tá dược bảo vệ cũng là một trong những phương pháp khả thi và đang được áp dụng rộng rãi. Việc sử dụng tinh bột làm tá dược bảo vệ để tăng khả năng chống chịu của vi sinh vật và cải thiện thể chất của nguyên liệu probiotic sau đông khô ở dạng vi nang là một hướng nghiên cứu đáng chú ý. Chính vì vậy, đề tài “Nghiên cứu sử dụng tinh bột làm chất bảo vệ trong quá trình tạo nguyên liệu probiotic chứa Lactobacillus acidophilus” được thực hiện với các mục tiêu cụ thể sau: 1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất của nguyên liệu probiotic dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô. 2. Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột và độ ổn định của nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trong quá trình bảo quản. [...]... liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trong quá trình bảo quản  Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột trong quá trình tạo nguyên liệu đông khô probiotic  Khảo sát lượng sinh khối thích hợp cho quá trình tạo nguyên liệu đông khô probiotic dạng vi nang  Khảo sát độ ổn định của nguyên liệu đông khô dạng vi nang chứa tinh bột trong quá trình bảo quản 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp nhân... một trong số tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô Cơ chế bảo vệ của tinh bột là làm giảm lượng nước liên kết trong mẫu [41] Trong quá trình vi nang hóa tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đông tụ hóa muối sử dụng alginat, tinh bột được phối hợp như tá dược độn rắn, góp phần cải thiện tính chất vật lý của hạt vi nang sau đông khô và giúp tế bào ổn định hơn trong quá trình đông khô và bảo quản [21] L acidophilus. .. dung nghiên cứu 2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất của nguyên liệu probiotic dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô  Đánh giá thể chất của các dạng nguyên liệu sau đông khô khi thay đổi nồng độ alginat  Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất hạt vi nang sau đông khô 17 2.2.2 Đánh giá khả năng bảo vệ của tinh bột và độ ổn định của nguyên liệu. .. của 20ml dịch lên men Chuẩn bị các mẫu, tạo nguyên liệu dạng hạt vi nang với thành phần gồm sinh khối phối hợp với 20ml dung dịch alginat 2% và các nồng độ khác nhau của tinh bột (phương pháp nêu trong mục 2.3.3) Mẫu 1: Tinh bột 0% (không thêm tinh bột) Mẫu 2: Tinh bột 2% Mẫu 5: Tinh bột 8% Mẫu 3: Tinh bột 4% Mẫu 6: Tinh bột 10% 26 Mẫu 4: Tinh bột 6% Mẫu 7: Tinh bột 20% Các dung dịch và tá dược thêm... phẩm, thực phẩm… Vì vậy, ta sử dụng tinh bột sắn làm nguyên liệu trong nghiên cứu này b Tính chất Trong môi trường acid, tinh bột bị thủy phân thành sản phẩm hòa tan Ở môi trường acid mạnh, sản phẩm thủy phân cuối cùng là glucose Trong môi trường kiềm, tinh bột bị ion hóa từng phần do sự hydrat hóa tốt hơn Khi hòa tan tinh bột vào nước, do sự hấp thụ nước làm hạt tinh bột trương phồng lên, tăng thể tích... và làm quá trình vận chuyển, bảo quản trở nên dễ dàng hơn [14] [41] Quá trình đông khô vi sinh vật tuy có nhiều ưu điểm nhưng cũng là một trong những nguyên nhân làm giảm số lượng vi sinh vật sống sót trong quá trình tạo nguyên liệu và chế phẩm probiotic Đặc biệt, giai đoạn tiền đông là nguyên nhân gây áp lực cho thành tế bào vi khuẩn Đông lạnh làm cho lớp lipid màng tế bào dễ bị tổn thương Một nghiên. .. thụ tinh bột, vì vậy tinh bột có thể được lựa chọn trong vi nang hóa L acidophilus Tinh bột là nguyên liệu quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp như công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dệt, công nghiệp keo dán vì những tính chất đặc trưng của nó như tạo hình, tạo dáng, tạo khung, tạo độ dẻo, độ dai, độ đàn hồi, độ xốp và có khả năng tạo gel, tạo màng cho nhiều sản phẩm 15 Chương 2 NGUYÊN... bình trong các đĩa petri cấy nồng độ pha loãng 10n m: khối lượng mẫu đem tiến hành xác định số lượng (g) 21 Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến thể chất của nguyên liệu probiotic dạng vi nang chứa Lactobacillus acidophilus sau đông khô Nhiều nghiên cứu gần đây đã chứng minh, sử dụng tinh bột như một tá dược độn có khả năng cải thiện tính chất cơ... Các mẫu đông khô Lactobacillus acidophilus tạo nguyên liệu dạng bột, các mẫu tạo thành đều có hạn chế là thể chất xốp, kết thành mảng, rất khó làm nhỏ thành dạng bột mịn Mẫu đông khô với tá dược là dung dịch alginat 2%, nguyên liệu tạo thành lớp mỏng, bám dính vào đĩa petri Sau 30 phút, mẫu hút ẩm rất khó lấy ra khỏi đĩa gây thất thoát nguyên liệu Kết quả này phù hợp với những nghiên cứu của Nguyễn Thị... khô là bổ sung vào nguyên liệu đông khô các tá dược bảo vệ Các tá dược này được thêm vào nhằm mục đích bảo vệ tế bào trong quá trình đông khô và tăng khả năng chống chịu của vi sinh vật trong quá trình làm khô Khả năng bảo vệ phụ thuộc vào bản chất của tá dược Ngoài ra, nồng độ tá dược cũng đóng vai trò quan trọng giúp tăng khả năng sống sót của VSV [31] [39] Các tá dược thường dùng trong đông khô vi . thể chất của nguyên liệu probiotic sau đông khô ở dạng vi nang là một hướng nghiên cứu đáng chú ý. Chính vì vậy, đề tài Nghiên cứu sử dụng tinh bột làm chất bảo vệ trong quá trình tạo nguyên. HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN MAI HƯƠNG NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TINH BỘT LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU PROBIOTIC CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC. HÀ NỘI NGUYỄN MAI HƯƠNG NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG TINH BỘT LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG QUÁ TRÌNH TẠO NGUYÊN LIỆU PROBIOTIC CHỨA Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC