BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI HÀ THỊ THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ALGINAT LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG QUÁ TRÌNH ĐÔNG KHÔ Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI HÀ THỊ THANH HUYỀN NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG ALGINAT LÀM CHẤT BẢO VỆ TRONG QUÁ TRÌNH ĐÔNG KHÔ Lactobacillus acidophilus KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: TS. Đàm Thanh Xuân Nơi thực hiện: BM Công nghiệp Dược HÀ NỘI- 2014 LỜI CẢM ƠN Khóa luận này được thực hiện và hoàn thành tại tổ Vi sinh – bộ môn Công nghiệp Dược. Trong thời gian thực hiện khóa luận, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của thầy cô, bạn bè và gia đình. Trước tiên, với sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Đàm Thanh Xuân, người đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới DS Lê Ngọc Khánh, người đã giúp đỡ và cho tôi nhiều ý kiến quý báu để tôi có thể hoàn thành khóa luận này. Xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Công nghiệp Dược đã tạo điều kiện và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và làm thực nghiệm tại bộ môn. Nhân dịp này, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể các thầy cô trong trường đã dạy dỗ và dìu dắt tôi trong suốt 5 năm học ở trường. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những người đã luôn luôn động viên, chia sẻ, ủng hộ và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên Hà Thị Thanh Huyền MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 2 1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ PROBIOTIC 2 1.1.1. Khái niệm Probiotic 2 1.1.2. Các vi sinh vật thường dùng trong các chế phẩm probiotic 2 1.1.3. Vai trò 3 1.1.4. Cơ chế tác dụng 5 1.2. PHƢƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ 5 1.2.1. Khái niệm 5 1.2.2. Các giai đoạn của quá trình đông khô 5 1.2.3. Ưu nhược điểm của phương pháp đông khô 6 1.2.4. Ứng dụng của phương pháp đông khô 6 1.2.5. Một số tá dược bảo vệ thường dùng trong đông khô vi sinh vật 7 1.3. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TẠO NGUYÊN LIỆU PROBIOTIC 10 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 15 2.1.1. Nguyên vật liệu 15 2.1.2. Môi trường sử dụng trong nghiên cứu 15 2.1.3. Thiết bị 16 2.2. Nội dung nghiên cứu 16 2.2.1. Khảo sát một số chỉ tiêu của nguyên liệu tạo thành khi sử dụng alginat và phương pháp vi nang hóa tạo nguyên liệu đông khô 16 2.2.2. Đánh giá chất lượng nguyên liệu tạo thành trong quá trình bảo quản 17 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.3.1. Phương pháp nhân giống 17 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 17 2.3.3. Phương pháp tạo nguyên liệu đông khô chứa L. acidophilus 17 2.3.4. Phương pháp xác định hàm ẩm 18 2.3.5. Phương pháp xác định số lượng vi sinh vật theo nguyên tắc pha loãng liên tục 19 Chƣơng 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1. Khảo sát một số chỉ tiêu của nguyên liệu tạo thành khi sử dụng alginat và phƣơng pháp vi nang hóa tạo nguyên liệu đông khô 21 3.1.1. Đánh giá cảm quan, thể chất của các nguyên liệu chứa Lactobacillus acidophilus tạo thành sau khi đông khô 21 3.1.2. Khảo sát tác dụng bảo vệ của alginat trong quá trình đông khô Lactobacillus acidophilus khi tạo các dạng nguyên liệu khác nhau 24 3.1.3. Khảo sát ảnh hưởng của lượng sinh khối ban đầu đến số lượng vi sinh vật sống sót của nguyên liệu đông khô 28 3.2. Đánh giá chất lƣợng nguyên liệu tạo thành trong quá trình bảo quản 33 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ATCC : American Type Culture Collection (Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Hoa Kì) CFU, cfu : Colony – Forming Units (Số đơn vị khuẩn lạc) ĐK : Đông khô EDTA : Dinatriethylen diamintetraacetat FAO : Food and Agriculture Organization (Tổ chức Nông lương thế giới) IDF : International Dairy Federation (Liên đoàn bơ sữa thế giới) MRS : de Man, Rogosa, Sharpe MT : Môi trường N/D : Nước trong dầu NL : Nguyên liệu PPI : Proton-pump inhibitor (Thuốc ức chế bơm proton) VSV : Vi sinh vật WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới) DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1 Bảng 2.1. Các hóa chất dùng trong nghiên cứu 15 2 Bảng 2.2. Các thiết bị dùng trong nghiên cứu 16 3 Bảng 3.1. Các mẫu nguyên liệu khảo sát thể chất 21 4 Bảng 3.2. Thể chất của một số mẫu nguyên liệu đông khô chứa Lactobacillus acidophilus 22 5 Bảng 3.3. Các mẫu nguyên liệu khảo sát số lượng vi sinh vật 25 6 Bảng 3.4. Số lượng vi sinh vật sống sót của các mẫu nguyên liệu sau đông khô 26 7 Bảng 3.5. Số lượng vi sinh vật sống sót và hàm ẩm của các mẫu hạt đông khô chứa L. acidophilus 29 8 Bảng 3.6. Hàm ẩm của các mẫu nguyên liệu trong thời gian bảo quản 34 9 Bảng 3.7. Số lượng VSV của các mẫu nguyên liệu trong thời gian bảo quản 35 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang 1 Hình 1. Công thức cấu tạo của acid α – L - guluronic và β – D – mannuronic 9 2 Hình 2. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của khối lượng sinh khối ướt thu được vào tổng thể tích dịch nuôi cấy 30 3 Hình 3. Đồ thị biểu diễn số lượng vi sinh vật trong 1g hạt chưa đông khô khi thay đổi thể tích dịch nuôi cấy ban đầu 31 4 Hình 4. Đồ thị biểu diễn biến thiên số lượng vi sinh vật và hàm ẩm của các mẫu nguyên liệu sau đông khô theo thể tích dịch nuôi cấy 32 5 Hình 5. Đồ thị biểu diễn hàm ẩm của các mẫu nguyên liệu đông khô trong thời gian bảo quản 34 6 Hình 6. Đồ thị biểu diễn số lượng L. acidophilus trong các mẫu nguyên liệu trong thời gian bảo quản 36 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong thời gian gần đây, các sản phẩm y tế chăm sóc sức khỏe có nguồn gốc từ probiotic đã có sự gia tăng mạnh mẽ về số lượng. Probiotic ngày càng được bào chế dưới nhiều dạng chế phẩm khác nhau sử dụng theo đường uống như bột, cốm, viên nang hay sử dụng trong các sản phẩm cho đường dùng khác như viên đặt, kem bôi da. Tuy nhiên, nhiều báo cáo chỉ ra rằng số lượng các vi khuẩn probiotic trong các chế phẩm này rất nghèo nàn [37], [39]. Nguyên nhân là do các vi sinh vật này rất nhạy cảm với sự thay đổi của điều kiện môi trường bảo quản như nhiệt độ, độ ẩm, nồng độ oxy hòa tan và hàng rào sinh học của hệ tiêu hóa. Do đó, trong quá trình bảo quản và sau khi vi khuẩn được đưa vào hệ tiêu hóa, số lượng vi khuẩn bị giảm đáng kể làm hạn chế tác dụng của chế phẩm [30], [33]. Để giải quyết vấn đề này, cần phải tìm ra những phương pháp gia tăng tỉ lệ sống sót và khả năng chống chịu của vi khuẩn probiotic trước các điều kiện bất lợi trong sản xuất, bảo quản và sử dụng. Một trong các hướng nghiên cứu đáng chú ý trong thời gian gần đây là sử dụng alginat như một tác nhân bảo vệ nhằm gia tăng tỉ lệ sống sót của các vi khuẩn probiotic trong quá trình đông khô. Xuất phát từ các lí do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu sử dụng alginat làm chất bảo vệ trong quá trình đông khô Lactobacillus acidophilus” nhằm 2 mục tiêu sau: 1. Khảo sát một số chỉ tiêu của nguyên liệu tạo thành khi sử dụng alginat và phương pháp vi nang hóa tạo nguyên liệu đông khô. 2. Đánh giá chất lượng của nguyên liệu tạo thành trong quá trình bảo quản. 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 1.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ PROBIOTIC 1.1.1. Khái niệm Probiotic Probiotic là thuật ngữ bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là “dành cho sự sống”, dùng để chỉ những vi khuẩn mang lại những tác động có lợi cho con người và cho vật chủ [45]. Từ hàng nghìn năm trước đây, con người đã biết sử dụng các chế phẩm sữa lên men với mục đích tăng cường sức khỏe. Tuy nhiên, phải đến đầu thế kỉ XIX, nhà khoa học người Nga Elie Metchnikoff mới thực sự nghiên cứu vấn đề này trên cơ sở khoa học. Thuật ngữ “Probiotic” được giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1953 bởi Kollath. Theo ông, Probiotic là “các yếu tố có nguồn gốc từ vi khuẩn, kích thích sự phát triển của các vi khuẩn khác” [19]. Năm 1989, Fuller đã đưa ra một định nghĩa khác về Probiotic: “Probiotic là thực phẩm bổ sung các VSV sống đem lại các tác động có lợi cho vật chủ bằng cách cải thiện cân bằng hệ vi sinh đường ruột” [36]. Năm 2002, WHO và FAO đã đưa ra định nghĩa ngắn gọn và hoàn chỉnh nhất về Probiotic ở thời điểm hiện tại như sau: “Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [44], [45]. Theo FAO, để có được hiệu quả thực sự thì VSV trong các chế phẩm probiotic cần phải đến được vị trí tác dụng trong đường tiêu hóa. Do trong quá trình sử dụng vi khuẩn probiotic phải đối mặt với các điều kiện bất lợi của đường tiêu hóa nên để đem lại tác dụng, các chế phẩm probiotic phải chứa ít nhất 10 6 – 10 7 cfu/ml tế bào VSV sống cho đến ngày hết hạn sử dụng để đảm bảo tác dụng điều trị (FAO/WHO) [23], [40]. 1.1.2. Các vi sinh vật thƣờng dùng trong các chế phẩm probiotic Bốn nhóm vi sinh vật thường được sử dụng trong các chế phẩm probiotic là: Lactobacillus, Bifidobacterium, Saccharomyces, Enterococcus. Trong đó, Lactobacillus và Bifidobacterium là hai loại vi khuẩn được sử dụng nhiều nhất [40]. Lactobacillus acidophilus thuộc họ Lactobacillaceae, chi Lactobacillus, thuộc nhóm vi khuẩn lactic. Lactobacillus acidophilus là trực khuẩn Gram (+), kích thước [...]... với không khí và mất khả năng sinh sản [33] Để ngăn chặn hoặc giảm thiểu các tác dụng bất lợi này, nhiều chất đã được sử dụng như tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô [13] Các chất bảo vệ hay tá dược đông khô (Cryoprotectant – CPA) là các chất được thêm vào trong thành phần nguyên liệu đem đông khô nhằm bảo vệ tế bào trong quá trình đông khô và đảm bảo sức chịu đựng của VSV trong quá trình làm khô. .. liệu đông khô, không chỉ cần lựa chọn các loại tá dược cho thể chất của nguyên liệu ổn định mà còn cần có khả năng bảo vệ tốt vi sinh vật trong quá trình đông khô Một tá dược bảo vệ trong đông khô phải có khả năng cải thiện tỉ lệ vi sinh vật sống sót trong quá trình đông khô ít nhất là so với các mẫu đông khô không sử dụng tá dược bảo vệ Thí nghiệm tiếp theo nhằm đánh giá tính khả thi khi sử dụng alginat. .. đậy kín bằng giấy nhôm rồi đem tiền đông trong tủ lạnh sâu ở -80oC trong 24h cho đông rắn hoàn toàn  Phương pháp đông khô - Tiền đông: Các mẫu được làm đông lạnh trong tủ lạnh sâu ở -80oC trong 24h cho đông rắn hoàn toàn - Làm khô: Các mẫu được làm khô trong không gian lạnh của máy đông khô ở nhiệt độ khoảng -50oC; áp suất 0,055mbar trong 24h Kết thúc quá trình đông khô, lấy mẫu ra khỏi thiết bị, xác... đánh giá tính khả thi khi sử dụng alginat làm tá dược bảo vệ và xác định tác dụng bảo vệ của alginat khi tạo các dạng nguyên liệu khác nhau  Mục tiêu Đánh giá tác dụng bảo vệ L acidophilus trong quá trình đông khô của alginat 2% khi tạo nguyên liệu dạng bột và dạng hạt So sánh tác dụng bảo vệ của nguyên liệu dạng hạt khi sử dụng tá dược bảo vệ là alginat 2% và alginat 2% phối hợp với sữa gầy 10% 25... khuẩn trong vi nang tương tự như khi sử dụng CaCO3 [18]  Việt Nam Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, sử dụng alginat làm tá dược vi nang hóa cũng đang được quan tâm và nghiên cứu Nhiều nghiên cứu chứng minh vi nang hóa bằng alginat có tác dụng bảo vệ vi khuẩn probiotic trong môi trường dạ dày – ruột tốt hơn so với dạng tự do [1], [7] Theo nghiên cứu của tác giả Quách Thu 14 Trang (2010), sử dụng alginat. .. dƣợc bảo vệ Kết quả thu được ở bảng 3.4 cho thấy mẫu đông khô khi sử dụng tá dược bảo vệ là sữa gầy có số lượng vi sinh vật là lớn nhất (6,82.108cfu/ml) Đông khô với tá dược bảo vệ là alginat 2% cho số lượng vi sinh vật trong mẫu nguyên liệu thấp hơn nhiều so với sử dụng tá dược bảo vệ là sữa gầy nhưng vẫn cao hơn nhiều lần so với khi chỉ đông khô sinh khối với nước cất Mẫu nguyên liệu dạng bột sử dụng. .. vật của hạt Ca -alginat trong quá trình đông khô là do tính chất vật lý của các hạt Các hạt Ca -alginat tạo ra một lớp màng bảo vệ xung quanh các tế bào vi sinh vật, ngăn cản sự tiếp xúc trực tiếp của tế bào với quá trình đông khô Chính sự tiếp xúc này làm giảm số lượng tế bào vi sinh vật sống sót sau đông khô do mức độ tổn thương màng tế bào và xác suất tế bào bị chết trong quá trình đông khô tỉ lệ thuận... phần có chứa không quá 0,5% chất béo Thành phần dinh dưỡng chính trong sữa gầy: 32% - 35,7% protein; 48,4% - 54,1% lactose Sữa gầy có trong các chế phẩm đông khô probiotic vì nó có tác dụng bảo vệ tốt probiotic trong quá trình đông khô Theo nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước từ trước tới nay thì sữa gầy sử dụng ở nồng độ khoảng 10% cho tỉ lệ sống sót cao nhất Tác dụng bảo vệ này có thể do nó chứa tỉ... một nghiên cứu khác thì protein trong sữa gầy có thể tạo thành lớp áo bảo vệ trên thành tế bào, đồng thời sữa gầy còn cung cấp những chất đệm tan trong nước (muối phosphat, muối citrat) giúp ổn định pH trong quá trình đông khô [33] Nguyên liệu đông khô với sữa gầy vừa tạo cấu trúc xốp giúp quá trình bù nước dễ dàng, nhưng đồng thời cũng làm cho nguyên liệu đông khô hút ẩm khá nhanh nếu không được bảo. .. tiếp xúc [20] Khi phối hợp alginat 2% với sữa gầy 10% để tạo hạt vẫn có tác dụng bảo vệ vi sinh vật trong quá trình đông khô Mẫu nguyên liệu đông khô từ alginat 2% và sữa gầy 10% có số lượng vi sinh vật là 2,38.108cfu/ml - cao gấp 210,63 lần so với mẫu đông khô với nước cất và cao hơn so với khi chỉ sử dụng alginat 2% để tạo hạt Việc bổ sung sữa gầy không chỉ làm giảm quá trình co rút hình dạng hạt . các vi khuẩn probiotic trong quá trình đông khô. Xuất phát từ các lí do trên, chúng tôi thực hiện đề tài Nghiên cứu sử dụng alginat làm chất bảo vệ trong quá trình đông khô Lactobacillus acidophilus”. dược đông khô (Cryoprotectant – CPA) là các chất được thêm vào trong thành phần nguyên liệu đem đông khô nhằm bảo vệ tế bào trong quá trình đông khô và đảm bảo sức chịu đựng của VSV trong quá trình. với không khí và mất khả năng sinh sản [33]. Để ngăn chặn hoặc giảm thiểu các tác dụng bất lợi này, nhiều chất đã được sử dụng như tá dược bảo vệ trong quá trình đông khô [13]. Các chất bảo vệ