BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THẮM NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 182.15 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THẮM NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH TỪ STREPTOMYCES 182.15 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS. Võ Thị Thu Thủy Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh& Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc tôi xin bầy tỏ lời cảm ơn chân thành đến cô giáo ThS.Võ Thị Thu Thủy, người đã trực tiếp hướng dẫn, ân cần chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Ban giám hiệu nhà trường, các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Vi sinh - Sinh học, Bộ môn Hóa lý, Bộ môn Hóa phân tích, Bộ môn Công nghiệp Dược và các anh chị trên viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam. Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân còn có hạn, khóa luận này có thể còn có nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 4 năm 2014. Sinh viên NGUYỄN THỊ THẮM DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid deoxyribonucleic CLNN Chọn lọc ngẫu nhiên CW Thành tế bào - Cell wall DMHC Dung môi hữu cơ ĐB Đột biến Gr(-) Gram âm Gr(+) Gram dương IR Hồng ngoại - Infrared KH Khoa học KS Kháng sinh HTKS Hoạt tính kháng sinh SKLM Sắc ký lớp mỏng L-DAP L - diaminopimelat MTdt Môi trường dịch thể MTth Môi trường thích hợp TB Tế bào TĐC Trao đổi chất TLC Sắc ký lớp mỏng VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật UV Tử ngoại – Ultraviolet B. cereus Bacillus cereus ATCC9946 B. pumilus Bacillus pumillus ATCC6633 B. subtilis Bacillus subtilis ATCC6633 S. lutea Sarcina lutea ATCC9341 E.coli Escherichia coli ATCC25922 P.mirabilis Proteus mirabilis BV108 P.aeruginosa Pseudomonas aeruginosa M201V S. typhi Salmonela typhi DT220 S. flexneri Shighella flexneri DT112 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các vi khuẩn được kiểm định. Bảng 2.2: Các môi trường nuôi cấy xạ khuẩn. Bảng 2.3: Các môi trường nuôi cấy VSV kiểm định. Bảng 2.4: Các dung môi đã sử dụng. Bảng 3.1: Bảng so sánh đặc điểm phân loại ISP của Streptomyces 182.15 với Streptomyces setonii. Bảng 3.2: Kết quả HTKS lựa chọn môi trường nuôi cấy và vi khuẩn kiểm định. Bảng 3.3: Kết quả HTKS chọn lọc ngẫu nhiên. Bảng 3.4: Kết quả HTKS sau đột biến lần thứ nhất Bảng 3.5: Kết quả HTKS sau đột biến lần thứ hai. Bảng 3.6: Kết quả lên men để chọn môi trường. Bảng 3.7: Kết quả lên men của các dạng chủng, biến chủng trên MT1dt. Bảng 3.8: Ảnh hưởng của pH đến độ bền của KS sau 1 ngày và sau 5 ngày. Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của kháng sinh trong dịch lọc. Bảng 3.10: Kết quả chọn dung môi và pH chiết. Bảng 3.11: Kết quả SKLM chọn hệ dung môi Bảng 3.12: Kết quả chạy cột lần 1 của phân đoạn 2-19. Bảng 3.13: Kết quả chạy cột lần 2 của 16 phân đoạn. Bảng 3.14: Kết quả SKLM các phân đoạn 1-12 sau chạy cột lần 3. Bảng 3.15: Kết quả SKLM các phân đoạn 1-12 sau chạy cột lần 4. Bảng 3.16: Kết quả đo phổ IR PHỤ LỤC Phục lục 1: Hình ảnh chuỗi bào tử của Streptomyces 182.15 dưới kính hiển vi. Phụ lục 2: Chủng Streptomyces 182.15 được chọn lọc ngẫu nhiên và cấy zigzag trong đĩa Petri . Phụ lục 3: Kết quả thử HTKS bằng phương pháp khối thạch và phương pháp giếng thạch. Phụ lục 4: Bình chứa dịch lên men khi kết thúc quá trình lên men. Phụ lục 5: Cột sắc ký trong quá trình chạy cột lần 1 và kết quả thử HTKS sau quá trình chạy cột. Phụ lục 6: Phổ IR chất kháng sinh sinh tổng hợp được. Phụ lục 7: Phổ UV chất kháng sinh sinh tổng hợp được. Phụ lục 8: Phổ MS chất kháng sinh sinh tổng hợp được. Phụ lục 9: Kết quả thử HTKS chọn lọc ngẫu nhiên. Phụ lục 10: Kết quả thử HTKS sau đột biến lần 1. Phụ lục 11: Kết quả thử HTKS sau đột biến lần 2. 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Kháng sinh là nhóm thuốc quan trọng trên lâm sàng với vai trò là giải pháp hữu ích nhất để điều trị các bệnh lý nhiễm khuẩn. Tuy nhiên tình trạng lạm dụng kháng sinh, không theo chỉ dẫn của bác sỹ, đặc biệt là các kháng sinh mới có hiệu lực mạnh chỉ được sử dụng hạn chế sẽ gây ra hậu quả nghiêm trọng – Kháng kháng sinh. Kháng kháng sinh đang ngày càng tăng cao và trở thành một vấn đề đáng báo động không chỉ trên thế giới mà còn ở Việt Nam. Mặt khác, tại Việt Nam tỷ lệ mắc các bệnh lý nhiễm khuẩn rất cao, đứng thứ 2 (16,70%) chỉ đứng sau các bệnh lý về tim mạch (18,40%) [7]. Điều này dẫn đến nhu cầu cấp thiết cần phải đẩy mạnh nghiên cứu sản xuất và phát triển kháng sinh mới là tất yếu. Kháng sinh có thể được tổng hợp theo ba hướng: sinh tổng hợp, bán tổng hợp và tổng hợp hóa học. Tuy nhiên xu hướng trên thế giới là tìm kiếm kháng sinh mới có nguồn gốc từ vi sinh vật, như tìm kiếm kháng sinh mới dưới lòng đại dương của các nhà khoa học Scotland hay từ các loại nấm rừng của các nhà khoa học Mỹ và Hà Lan [16]. Chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces được ứng dụng để sản xuất khoảng 55% kháng sinh trên thế giới và đó là những sản phẩm có giá trị lớn trong lĩnh vực y tế [5]. Do vậy, tại Bộ môn Vi sinh - Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội chúng tôi đã chọn đề tài “Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 182.15” làm khóa luận tốt nghiệp dược sĩ, với các mục tiêu sau : - Tiến hành phân loại Streptomyces 182.15 theo khóa phân loại ISP. - Khảo sát một số điều kiện nhằm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 182.15. - Nghiên cứu một vài đặc tính của kháng sinh đã sinh tổng hợp được. 2 Chương 1: TỔNG QUAN 1.1. Đại cương về xạ khuẩn (Actinomycetes) Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm VK thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn. Xạ khuẩn là các vi khuẩn Gr(+), có tỷ lệ G+C >55% trong ADN, hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh. Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh, khoảng 60% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng sinh. Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học như gentamicin, tobramixin, vancomixin, rosamixin Trong số đó có tới 55% kháng sinh được tìm ra có nguồn gốc từ Streptomyces [5], [8]. 1.1.1. Đặc điểm hình thái xạ khuẩn Hệ sợi của xạ khuẩn chia thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh. Khuẩn ty cơ chất là khuẩn ty cơ bản còn khuẩn ty khí sinh phát triển mạnh hay yếu, thậm chí hầu như không phát triển tùy từng chi, từng loài. Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn thay đổi từ 0,3-1,0µm đến 2-3µm. Đa số khuẩn ty xạ khuẩn không có vách ngăn. Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn rất phong phú, có thể gặp các màu trắng, vàng, xám, da cam, đen, đỏ, lục, lam, nâu… Khuẩn ty cơ chất có thể tiết vào môi trường một số loại sắc tố, có sắc tố tan trong nước, có loại phụ thuộc pH, có loại chỉ tan trong dung môi hữu cơ. Trong môi trường đặc hiệu, có loại xạ khuẩn có thể tạo ra sắc tố melanoid sẫm đen. Khuẩn ty cơ chất phát triển một thời gian thì dài ra trong không khí thành các khuẩn ty khí sinh. Người ta gọi khuẩn ty khí sinh là khuẩn ty thứ cấp để phân biệt với khuẩn ty sơ cấp bắt đầu phát triển từ các bào tử nảy mầm. Khuẩn lạc xạ khuẩn là tập hợp một nhóm xạ khuẩn phát triển riêng rẽ. Khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo, có các nếp gấp tỏa ra theo hình phóng xạ [8]. 1.1.2 Đặc điểm cấu tạo tế bào xạ khuẩn 3 Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự VK Gr(+), có một số khác biệt sau: Thành TB xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày khoảng 10-20nm, có chức năng duy trì hình dáng của khuẩn ty và bảo vệ tế bào. Căn cứ vào thành phần hóa học thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm: CW1, CW2, CW3, CW4. Các xạ khuẩn chi Streptomyces được xếp vào nhóm CW1, thành tế bào có chứa L-DAP và glycin [8].  Màng tế bào chất của xạ khuẩn dày khoảng 7,5-10nm, có cấu trúc và chức năng như của vi khuẩn nói chung.  Mezosom nằm ở phía trong của tế bào chất, có hình phiến, hình bọng hay hình ống. Mezosom làm tăng diện tích tiếp xúc của màng tế bào chất và qua đó làm tăng hoạt tính enzym, tăng vận chuyển điện tử …  Các vật thể ẩn nhập trong tế bào chất của xạ khuẩn gồm có các hạt phosphat (hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm Sudan III), các hạt polysacharid (bắt màu với dung dịch Lugol) [14]. 1.1.3 Đặc điểm của xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces  Đối với các xạ khuẩn thuộc họ Streptomycetaceae sau một thời gian phát triển trên đỉnh khuẩn ty khí sinh sẽ xuất hiện các chuỗi bào tử. Các chuỗi bào tử có thể mọc đơn hay mọc vòng gồm các hình thái cơ bản như: thẳng, uốn cong, móc câu - đơn hoặc kép và xoắn lò xo. Bào tử trần của họ xạ khuẩn này có các hình dạng: hình cầu, hình bầu dục, hình trụ… Bề mặt bào tử có thể là nhẵn, sần sùi da cóc, có gai hoặc có tóc. Bào tử trần là cơ quan sinh sản chủ yếu của họ xạ khuẩn.  Đặc điểm sinh lý của Streptomyces: là sinh vật dị dưỡng có tính oxi hóa cao. Để phát triển, chúng phân giải các hydratcarbon làm nguồn cung cấp vật chất và năng lượng, đồng thời thủy phân các hợp chất như: gelatin, casein, khử nitrat thành nitrit, Streptomyces là loại xạ khuẩn hô hấp hiếu khí. Nhiệt độ tối thích của chúng là 25-30 0 C, pH tối thích là 6,8-7,5.  Khả năng tạo sắc tố: sắc tố tạo thành từ Streptomyces được chia làm 4 loại: sắc tố hòa tan, sắc tố của khuẩn ty cơ chất, sắc tố của khuẩn ty khí sinh, sắc tố melanoid [8]. [...]... 3 kháng sinh đều ức chế chống lại vi khuẩn Bacillus subtilis CMCC63501 Đáng chú ý là lobophorin H ức chế vi khuẩn Bacillus subtilis CMCC63501 tương tự như ampicillin [31] 1.7.4 Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 15. 2 9Streptomyces microflavus Khi tiến hành phân loại Streptomyces 15. 29 theo khóa luận ISP thì nhận thấy: đặc trưng phân loại của Streptomyces 15. 29 giống với Streptomyces. .. lượng của các ion, phân tử, xác định công thức cấu tạo của chất nghiên cứu hoặc dùng trong phân tích định lượng [1], [4], [5] 1.7 Các nghiên cứu về kháng sinh có nguồn gốc từ Streptomyces trong nước và trên thế giới 1.7.1 Nghiên cứu kháng sinh kháng nấm mới từ Streptomyces setonii Xạ khuẩn được phân loại theo khóa phân loại ISP cho thấy Streptomyces setonii có các đặc điểm hình thái như chuỗi bào tử... fingerprinting sử dụng mồi MST1 của Streptomyces 15. 29 cho thấy hệ gen của Streptomyces hoàn toàn trùng khớp với gen của Streptomyces microflavus Vì vậy, kết luận tên khoa học của Streptomyces 15. 29 là Streptomyces microflavus Qua sàng lọc ngẫu nhiên và đột biến UV thì hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 15. 29 được nâng cao Sau khi tiến hành đột biến UV, chủng Streptomyces 15. 29.21.23 là biến chủng... gen hoạt hóa Streptomyces nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp KS Sự biểu hiện của cụm gen chuyển hóa thứ cấp trong Streptomyces được điều khiển bởi gen hoạt hóa Các bản sao làm tăng năng suất sinh tổng hợp KS hoặc kích hoạt các cụm gen câm Đặc tính này đã được sử dụng trong các nhân bản của abaA, afsQ1/Q2, afsR từ Streptomyces coelicolor và afsR2 từ Streptomyces lividans để làm tăng sinh tổng hợp KS Các... VÀ BÀN LUẬN I KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 3.1 Xác định tên khoa học của Streptomyces 182. 15  Kết quả phân loại Streptomyces 182. 15 theo ISP được trình bày ở bảng 3.1 Bảng 3.1: Bảng so sánh đặc điểm phân loại ISP của Streptomyces 182. 15 với Streptomyces setonii Streptomyces 182. 15 Streptomyces setonii Màu khuẩn ty khí sinh WY WY Màu khuẩn ty cơ chất 0 0 Sắc tố melanoid 0 0 Sắc tố hòa tan 1 0 Chuỗi... trên môi trường thạch nghiêng thích hợp, cất ống thạch nghiêng trong tủ lạnh 20C và định kỳ 2-3 tháng cấy lại 1 lần [17], [24] 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.4.1.Khái niệm lên men Lên men là quá trình trao đổi chất sinh học được tiến hành do hoạt động của vi sinh vật nhờ sự xúc tác của các enzyme với mục đích cung cấp năng lượng và các 6 hợp chất trung gian cho chúng Kháng sinh là sản phẩm trao... cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc phân tử hay sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tùy thuộc vào tính chất của chất làm pha tĩnh và dung môi làm pha động  Các phương pháp sắc ký thường dùng trong nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh bao gồm: sắc ký lớp mỏng, sắc ký rửa giải trên cột [11] 1.6 Nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 1.6.1 Phổ hồng ngoại (IR)  Nguyên tắc: Trong phân tử khi có nhóm... phương pháp giếng thạch  Chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: Các dạng chủng, biến chủng cần thử được nhân giống cấp 1 trên MT1dt, lên men trên môi trường tối thích đã chọn cho sinh tổng hợp kháng sinh Thử hoạt tính dịch lên men bằng phương pháp giếng thạch 2.3.8 Phương pháp xác định độ bền nhiệt, bền pH của kháng sinh trong dịch lên men  Xác định độ bền nhiệt: Lấy 3 ống... [15]  Bằng sinh học phân tử: tách chiết ADN, phản ứng PCR, giải trình tự 16S rADN và phân tích cây chủng loại phát sinh [14] 1.2 Phương pháp phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh Để phân lập VSV sinh KS người ta phải lấy mẫu từ các nguồn cơ chất khác nhau: đất ở ruộng, đất quanh rễ cây, đất nền ở chuồng gia súc, gia cầm, bùn, nước ở sông, hồ… Từ các mẫu trên đem phân lập thuần khiết những VSV sinh kháng. .. Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn biến chủng (dạng chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất - Tìm pH và dung môi hữu cơ chiết xuất dịch lọc của dịch lên men tốt nhất - Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất - Tách, tinh chế kháng sinh từ dịch chiết dung môi hữu cơ  Sơ bộ xác định một số tính chất của kháng sinh thu được - . kiện nhằm tăng hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh từ Streptomyces 182. 15. - Nghiên cứu một vài đặc tính của kháng sinh đã sinh tổng hợp được. 2 Chương 1: TỔNG QUAN 1.1. Đại cương. thiết cần phải đẩy mạnh nghiên cứu sản xuất và phát triển kháng sinh mới là tất yếu. Kháng sinh có thể được tổng hợp theo ba hướng: sinh tổng hợp, bán tổng hợp và tổng hợp hóa học. Tuy nhiên. chạy cột. Phụ lục 6: Phổ IR chất kháng sinh sinh tổng hợp được. Phụ lục 7: Phổ UV chất kháng sinh sinh tổng hợp được. Phụ lục 8: Phổ MS chất kháng sinh sinh tổng hợp được. Phụ lục 9: Kết quả