BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ VÂN ANH NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 183.212 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ VÂN ANH NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 183.212 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: ThS Lê Thị Thu Hương Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh- Sinh học HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn và lòng biết ơn sâu sắc đến ThS Lê Thị Thu Hương, người đã hướng dẫn em từ bước đầu cho đến khi hoàn thành khóa luận này. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Cao Văn Thu đã cho em những góp ý về kiến thức cùng các thầy cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên giảng dạy, công tác tại Bộ môn Vi sinh- Sinh học trường Đại học Dược Hà Nội, Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương, trung tâm phổ ứng dụng viện Hóa học- Viện Hàn lâm khoa học Quốc gia đã giúp đỡ em trong thời gian làm thực nghiệm. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian học tập tại trường. Cuối cùng là lời cảm ơn em gửi tới gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thận có hạn, khóa luận này vẫn còn nhiều thiếu sót. Vì thế, em rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 13 tháng 05 năm 2014 Sinh viên Vũ Thị Vân Anh MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về kháng sinh 2 1.1.1. Định nghĩa kháng sinh 2 1.1.2. Phân loại kháng sinh [11],[16] 2 1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh [16] 2 1.1.4. Cơ chế kháng kháng sinh [10],[16] 3 1.1.5. Vi sinh vật sinh kháng sinh [10] 3 1.1.6. Con đường và phương pháp tìm kiếm kháng sinh [10] 4 1.2. Tổng quan về xạ khuẩn. 4 1.2.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn [5], [7] 5 1.2.2. Đặc điểm tế bào xạ khuẩn [5], [7] 6 1.2.3. Cơ sở phân loại xạ khuẩn và một số khóa phân loại thường dùng [5] 6 1.3. Các phương pháp nghiên cứu về tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn. 6 1.3.1. Tuyển chọn và bảo quản giống 6 1.3.2. Lên men tổng hợp kháng sinh [6],[10], [11] 8 1.3.3. Nghiên cứu tách chiết và tinh chế kháng sinh [10], [11] 10 1.3.4. Nghiên cứu các đặc điểm của kháng sinh [1] 12 1.4. Elaiomycins K và L, kháng sing anzoxy mới được tìm thấy ở Streptomyces sp. Tü 6399 [22] 13 1.5. Tăng hoạt tính cụm gen sinh tổng hợp sản phẩm trao đổi chất thứ cấp ở Streptomyces grieus bằng các gây đột biến rsmG. [24] 14 1.6. Actinomycin X 2 , chất kháng sinh được phân lập từ quá trình lên men sinh tổng hợp Streptomyces microflavus [15] 15 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 16 2.1.1 Nguyên vật liệu 16 Bảng 2.1: Thành phần môi trường nuôi cấy xạ khuẩn 16 2.1.2. Thiết bị 19 2.2. Nội dung nghiên cứu 20 2.3. Phương pháp thực nghiệm 20 2.3.1. Phương pháp nuôi cấy, giữ giống 20 2.3.2. Nuôi cấy trên môi trường phân loại ISP để định tên xạ khuẩn. 20 2.3.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng sinh của chủng xạ khuẩn 22 2.3.4. Phương pháp lựa chọn chủng có hoạt tính cao bằng phương pháp sàng lọc ngẫu nhiên 23 2.3.5. Phương pháp đột biến bằng ánh sáng UV 24 2.3.6. Phương pháp lên men chìm. (hình P6.1, hình P6.2) 25 2.3.7. Phương pháp xác định môi trường nuôi cấy thích hợp 26 2.3.8. Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH của dịch kháng sinh 26 2.3.9. Phương pháp chiết kháng sinh bằng dung môi hữu cơ 27 2.3.10. Phương pháp tách kháng sinh bằng sắc ký 27 2.3.11. Phương pháp thu kháng sinh tinh khiết 28 2.3.12. Phương pháp xác định cấu trúc kháng sinh 29 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. 30 3.1. Kết quả chọn môi trường nuôi cấy và chọn VSV kiểm định. 30 3.2. Kết quả nghiên cứu định tên khoa học. 31 3.3. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên. 31 3.4. Kết quả đột biến. 32 3.4.1 Kết quả đột biến lần 1 32 3.4.2. Kết quả đột biến lần 2 33 3.5. Kết quả lên men chìm 33 3.5.1. Kết quả lên men chìm chọn môi trường lên men thích hợp 34 3.5.2. Kết quả lên men chìm chọn chủng có hoạt tính cao nhất 34 3.6. Kết quả thử độ bền pH và độ bền nhiệt. 35 3.6.1 Độ bền pH 35 3.6.2 Độ bền nhiệt 35 3.7. Kết quả chọn dung môi hữu cơ chiết kháng sinh. 35 3.8. Kết quả sắc ký tách kháng sinh tinh khiết. 36 3.8.1. Kết quả sắc cột lần 1 37 3.8.2. Kết quả sắc ký cột lần 2 39 3.9. Kết quả xác định các đặc điểm của kháng sinh tinh khiết. 42 3.9.1 Đặc điểm vật lý của kháng sinh. 42 3.9.2. Phổ UV (hình P7.1, P7.2) 42 3.9.3. Phổ IR ( hình P7.3) 42 3.9.4. Phổ khối (hình P7.4) 43 1. KẾT LUẬN 44 2. KIẾN NGHỊ 45 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AND Acid 2’-deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic B. cereus Bacillus cereus ATCC 9946 B. pumilus Bacillus pumilus ATCC 10421 B. subtilis Bacillus subtilis ATCC 6633 CW Cell wall (thành tế bào) DMHC Dung môi hữu cơ D  mm Đường kính trung bình của vòng vô khuẩn (mm) ĐB Đột biến E. coli Escherichia coli ATCC 25922 G (+) Gram dương G (-) Gram âm HTKS Hoạt tính kháng sinh IR Hồng ngoại ISP Chương trình Streptomyces quốc tế (International Streptomyces project) MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể MS Phổ khối P. mirabilis Proteus mirabilis BV 108 P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa VN 201 (s) Độ lệch S. coelicolor Streptomyces coelicolor S. aureus Staphylococcus aureus ATCC 1228 S. typhi Salmonella typhi DT 220 S. lutea Sarcina lutea ATCC 9341 S. flexneri Shighella flexneri DT 112 SKC Sắc ký cột SKLM Sắc ký lớp mỏng SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật UV Tử ngoại DANH MỤC CÁC BẢNG- ĐỒ THỊ - HÌNH VẼ Danh mục bảng: Bảng 2.1: Thành phần môi trường nuôi cấy xạ khuẩn Bảng 2.2: Thành phần môi trường nuôi cấy định tên ISP Bảng 2.3 : Thành phần môi trường nuôi cấy VSV kiểm định Bảng 2.4 : Các dung môi hữu cơ sử dụng trong nghiên cứu Bảng 3.1 : Kết quả thử hoạt tính kháng sinh trên các môi trường nuôi cấy Bảng 3.2 : Kết quả phân loại xạ khuẩn theo ISP Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS của các chủng sau sàng lọc ngẫu nhiên Bảng 3.4: Kết quả HTKS của các biến chủng sau đột biến lần 1 Bảng 3.5 :Kết quả HTKS của các biến chủng sau đột biến lần 2 Bảng 3.6: Kết quả thử HTKS khi lên men ở các MTdt khác nhau Bảng 3.7: Kết quả thử HTKS của các chủng và biến chủng sau khi lên men chìm Bảng 3.8: Kết quả thử độ bền với pH của dịch chiết kháng sinh Bảng 3.9: Kết quả thử độ bền với nhiệt của dịch chiết kháng sinh Bảng 3.10: Kết quả thử HTKS khi chiết bằng các dung môi hữu cơ khác nhau Bảng 3.11: Kết quả sắc ký lớp mỏng khảo sát hệ dung môi Bảng 3.12: HTKS của các phân đoạn thu được sau SKC lần 1 Bảng 3.13: Kết quả SKLM của các phân đoạn thu được sau SKC lần 1 Bảng 3.14: Kết quả khảo sát hệ dung môi chạy sắc ký cột lần 2 Bảng3.15: HTKS của các các phân đoạn thu được sau SKC lần 2 Bảng 3.16 : Kết quả SKLM của các phân đoạn sau thu được sau SKC lần 2 Danh mục hình –đồ thị Đồ thị 1: HTKS của các phân đoạn thu được sau sắc ký cột lần 1 Đồ thị 2: HTKS của các phân đoạn thu được sau sắc ký cột lần 2 Hình 1.1 : Tủ ấm Binder Hình 1.2: Máy lắc Taitec Bio – Shaker BR 300Lf Hình 1.3: Máy cất quay Buchi Waterbath B480 Hình 2: Nuôi cấy xạ khuẩn trên MT thạch Hình 3.1: Đánh giá HTKS của xạ khuẩn bằng phương pháp khối thạch Hình 3.2: Đánh giá HTKS bằng phương pháp khoanh giấy lọc Hình 4.1: Hình ảnh bề mặt và kích thước bào tử Streptomyces. 183.212 Hình 4.2 : Hình dạng chuỗi bào tử xạ khuẩn Streptomyces 183.212 Hình 5.1: Bình lên men chìm trên các MTdt sau 7 ngày. Hình 5.2: Dịch lọc lên men sau 7 ngày Hình 6.1: Phổ UV của kháng sinh Hình 6.2: Đỉnh hấp thụ UV và độ hấp thụ của kháng sinh Hình 6.3: Phổ IR Hình 6.4: Phổ MS [...]... cao để nghiên cứu tiếp Lên men để thu nhận lượng kháng sinh cao hơn, cô đặc và tinh chế kháng sinh Xác định loài sinh kháng sinh và xác định các đặc điểm của kháng sinh xem đây có phải là kháng sinh mới  Thử nghiệm độc tính và phổ kháng khuẩn của kháng sinh  Nếu chất kháng sinh có thể là kháng sinh mới thì lên men ở mức độ cao hơn, thu nhận kháng sinh thô, tách chiết và tinh chế chất kháng sinh ... các kháng sinh mới cũng như các chủng có khả năng sản xuất kháng sinh mạnh Con đường quan trọng để tìm kiếm các kháng sinh mới vẫn là phương pháp sinh học: nghiên cứu các chủng VSV có khả năng tổng hợp kháng sinh Chúng tôi lựa chọn thực hiện đề tài Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces 183.212” tại bộ môn Vi sinh- Sinh học với các mục tiêu:  Sơ bộ định tên khoa học của xạ khuẩn  Nghiên. .. cảm với kháng sinh ngày càng giảm, số lượng VSV kháng kháng sinh ngày càng tăng Để giảm thiểu hiện tượng này, ngoài việc sử dụng kháng sinh đúng cách, cần quan tâm nhiều hơn đến việc tìm kiếm các kháng sinh mới từ các VSV sinh kháng sinh [10] 1.1.5 Vi sinh vật sinh kháng sinh [10] Trong các VSV có khả năng sinh kháng sinh, xạ khuẩn được quan tâm nhiều nhất vì khả năng sinh ra nhiều loại kháng sinh quan... Nghiên cứu cải tạo giống, làm tăng khả năng sản xuất kháng sinh của xạ khuẩn  Xác định điều kiện lên men, chiết xuất, tinh chế kháng sinh  Xác định sơ bộ một số đặc tính của kháng sinh do xạ khuẩn sinh ra 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa kháng sinh Có nhiều định nghĩa khác nhau về kháng sinh, trong đó định nghĩa được coi là khá hoàn chỉnh cho rằng : “ Kháng sinh là... trong Streptomyces griseus 1.6 Actinomycin X2, chất kháng sinh được phân lập từ quá trình lên men sinh tổng hợp Streptomyces microflavus [15] Trong số các Streptomyces được phân lập từ cơ chất Việt Nam tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật học, Bộ môn Vi sinh và Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội có Streptomyces 15.29 là chủng xạ khuẩn có độ ổn định di truyền tốt, có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh. .. UV-VIS Hitachi U-1900, máy đo MS, máy đo IR Impact 410 – NicoLet- USA 2.2 Nội dung nghiên cứu 1 Nghiên cứu định tên khoa học của xạ khuẩn 2 Nghiên cứu cải tạo giống làm tăng khả năng sản xuất kháng sinh của xạ khuẩn 3 Nghiên cứu lên men, chiết xuất, tinh chế kháng sinh 4 Nghiên cứu các đặc tính của kháng sinh do xạ khuẩn sinh ra 2.3 Phương pháp thực nghiệm 2.3.1 Phương pháp nuôi cấy, giữ giống  Chủng... chặt chẽ thì chỉ những quá trình lên men sản xuất các sản phẩm sơ cấp được đề cập như lên men sản xuất acid acetic, acid citric, acid glutamic…Theo nghĩa rộng, lên men ái khí được hiểu bao gồm tất cả các quá trình lên men chuyển hóa các nguồn carbon sinh tổng hợp các sản phẩm sơ cấp và thứ cấp trong đó có lên men sản xuất các kháng sinh và cả vitamin… là những lên men có sản phẩm ứng dụng hết sức quan... cũng góp sức tổng hợp nhiều kháng sinh mới Tuy nhiên song song với đó, sự biến đổi nhanh chóng của vi sinh vật gây bệnh làm xuất hiện nhiều bệnh lý phức tạp, cũng như việc sử dụng kháng sinh tràn lan, không hợp lý đã làm cho hiện tượng kháng kháng sinh ngày càng xuất hiện nhiều và đặc biệt hiện tượng kháng chéo (kháng các kháng sinh trong cùng một họ) đặt ra nhu cầu cần phải thực hiện nghiên cứu, tìm kiếm... độ thấp (2oC): phương pháp này còn được gọi là giữ giống trên thạch nghiêng Đây là phương pháp phổ biến và khá đơn giản Tuy nhiên thời gian giữ giống không dài nên cần cấy truyền lại môi trường mới 1.3.2 Lên men tổng hợp kháng sinh [6],[10], [11] Tất cả các quá trình lên men tổng hợp kháng sinh đều là quá trình lên men ái khí Lên men ái khí được định nghĩa là các quá trình phân giải, chuyển hóa hydratcarbon... Ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn  Tác động lên quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn  Ức chế tổng hợp acid nucleic (ADN và ARN) của vi khuẩn  Thay đổi tính thấm của màng tế bào  Kháng chuyển hóa (ức chế tổng hợp acid folic) 1.1.4 Cơ chế kháng kháng sinh [10],[16] Kháng thuốc là hiện tượng VSV mất đi tính nhạy cảm ban đầu của nó trong một thời gian hay vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh . các kháng sinh mới vẫn là phương pháp sinh học: nghiên cứu các chủng VSV có khả năng tổng hợp kháng sinh. Chúng tôi lựa chọn thực hiện đề tài Nghiên cứu lên men tổng hợp kháng sinh nhờ Streptomyces. pháp nghiên cứu về tổng hợp kháng sinh ở xạ khuẩn. 6 1.3.1. Tuyển chọn và bảo quản giống 6 1.3.2. Lên men tổng hợp kháng sinh [6],[10], [11] 8 1.3.3. Nghiên cứu tách chiết và tinh chế kháng sinh. NGHIÊN CỨU LÊN MEN TỔNG HỢP KHÁNG SINH NHỜ STREPTOMYCES 183.212 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ VÂN ANH NGHIÊN CỨU LÊN