BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI  HOÀNG THỊ QUỲNH NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN SILDENAFIL TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI  HOÀNG THỊ QUỲNH NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN SILDENAFIL TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn : TS . Phạm Thị Thanh Hà ThS . Ngô Quang Trung Nơi thực hiện: Phòng phân tích, kiểm nghiệm & TĐSH- Viện công nghệ dược phẩm Quốc Gia. HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến: TS. Phạm Thị Thanh Hà ThS. Ngô Quang Trung Là người thầy, người cô đã luôn tận tình hướng dẫn tôi, và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh, và các anh chị tại Phòng Phân tích, kiểm nghiệm và tương đương sinh học - Viện công nghệ Dược phẩm Quốc Gia, đã tạo điều kiện giúp đỡ để tôi hoàn thành được khóa luận. Nhân dịp này, tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô tại các bộ môn của Trường Đại Học Dược Hà Nội, đã truyền dạy kiến thức và niềm tự hào là sinh viên trường Dược cho tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, bạn bè, những người đã luôn bên cạnh và ủng hộ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận này. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Hoàng Thị Quỳnh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VÀ KÍ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về sildenafil 3 1.1.1. Công thức 3 1.1.2. Tính chất 3 1.1.3. Tác dụng của Sildenafil 4 1.1.3.1. Cơ chế tác dụng của Sildenafil 4 1.1.3.2. Dược động học 4 1.1.3.3. Chỉ định 5 1.1.3.4. Liều dùng 5 1.1.3.5. Tác dụng không mong muốn của Sildenafil 5 1.1.3.6. Tương tác thuốc 6 1.1.4. Một số nghiên cứu phát hiện Sildenafil trong chế phẩm đông dược 7 1.2. Phương pháp sắc ký lớp mỏng 7 1.2.1. Nguyên tắc 7 1.2.2. Pha tĩnh 8 1.2.3. Pha động 9 1.2.4. Kỹ thuật 10 1.2.4.1. Đưa chất phân tích lên bản mỏng 10 1.2.4.2. Khai triển sắc ký 11 1.2.4.3. Phát hiện vết trên sắc ký đồ 12 1.2.5. Ứng dụng của SKLM 13 1.2.5.1. Định tính 13 1.2.5.2. Thử tinh khiết 14 1.2.5.3. Định lượng 14 1.2.6. Ưu nhược điểm 14 1.2.6.1. Ưu điểm 14 1.2.6.2. Nhược điểm 15 1.3. Phương pháp xử lý mẫu 15 1.3.1. Chiết hệ dị thể rắn-lỏng 15 1.3.2. Chiết Soxhlet 16 1.3.3. Chiết pha rắn (SPE) 16 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. Phương tiện nghiên cứu 17 2.1.1. Máy móc, thiết bị 17 2.1.2. Hóa chất thuốc thử 17 2.2. Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu 18 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu 18 2.2.2. Nội dung nghiên cứu 19 2.2.3. Phương pháp nghiên cứu 19 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích 20 3.1.1. Khảo sát điều kiện sắc ký 20 3.1.2. Khảo sát điều kiện phát hiện 21 3.1.3. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 23 3.2.Đánh giá phương pháp 25 3.2.1. Độ chọn lọc 25 3.2.2. Độ lặp lại 26 3.2.3. Giới hạn phát hiện (LOD) 29 3.3. Áp dụng phương pháp kiểm tra một số mẫu 32 3.3.1. Quy trình xử lý mẫu thử và điều kiện khai triển sắc ký 32 3.3.2. Xích Thố Vương 1 33 3.3.3. Xích Thố Vương 2 33 3.3.4. Xích Thố Vương 3 34 3.3.5. YANGCHUNSAMNOK. 34 3.3.6. ELK Velvet Antler Bois d’ESLANS Velours. 35 3.3.7. YANGCHUNSAMROK. 35 3.4. Bàn luận 36 KẾT LUẬN 37 ĐỀ XUẤT 38 TLTK DANH MỤC CÁC CHỮ VÀ KÝ HIỆU VIẾT TẮT PDE-5 Phosphodiesterase-5 MeOH Methanol NO Nitơ (II) oxid cGMP cyclic Guanosine Monophosphate PAH Pulmonary Arterial Hypertension (tăng áp động mạch phổi) CYP Cytochrome P450 ED Erectile Dysfunction (rối loạn cương dương) SKLM Sắc Ký Lớp Mỏng IR Infrared (Hồng ngoại) HPLC High-performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) TLC Thin- Layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng) MS Mass spectra( khối phổ) HPTLC High-performance Thin- Layer chromatography( Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao) TLTK Tài liệu tham khảo SKĐ Sắc ký đồ UV Ultraviolet (Tử ngoại) SPE Solid Phase extraction (Chiết pha rắn) SC Sildenafil citrate SD Sildenafil S/N Signal/Noise LOD Limit of Detection (Giới hạn phát hiện) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số phương pháp phát hiện sildenafil. 7 Bảng 1.2 Một số chất thường làm pha tĩnh cho sắc ký lớp mỏng 9 Bảng 1.3 Một số thuốc thử tạo màu trong sắc ký lớp mỏng 12 Bảng 2.1 Một số sản phẩm đông dược ứng dụng kiểm tra. 18 Bảng 3.1 Kết quả tính độ lặp lại. 29 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1 Sắc ký đồ khảo sát hệ dung môi khai triển 20 Hình 3.2 Sắc ký đồ khảo sát điều kiện phát hiện vết 22 Hình 3.3 Sắc ký đồ khảo sát dung môi chiết 24 Hình 3.4 Sắc ký đồ đánh giá độ chọn lọc 26 Hình 3.5 Sắc ký đồ đánh giá độ lặp lại 27 Hình 3.6 Sắc ký đồ analog xác định độ lặp lại 28 Hình 3.7 Sắc ký đồ xác định giới hạn phát hiện 30 Hình 3.8 Sắc ký đồ analog của mẫu xác định giới hạn phát hiện 31 Hình 3.9 Sắc ký đồ mẫu Xích Thố Vương 1 33 Hình 3.10 Sắc ký đồ mẫu Xích Thố Vương 2 33 Hình 3.11 Sắc ký đồ mẫu Xích Thố Vương 3 34 Hình 3.12 Sắc ký đồ mẫu YANGCHUNSAMNOK 34 Hình 3.13 Sắc ký đồ mẫu ELK Velvet Antler Bois d’ESLANS Velours 35 Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu YANGCHUNSAMROK 35 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, khi kinh tế ngày càng phát triển, con người có điều kiện quan tâm đến sức khỏe nhiều hơn. Cùng xu hướng ưa chuộng sử dụng các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên với niềm tin chúng an toàn, hiệu quả hơn. Nắm bắt xu thế đó, các cơ sở sản xuất chế phẩm đông dược đã đưa ra thị trường rất nhiều mặt hàng nhằm đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng. Tuy nhiên, nhà sản xuất vì nhiều mục đích như lợi nhuận, giảm nhanh các triệu chứng hay tạo cảm giác đánh lừa người tiêu dùng (tăng cân nhanh do tác dụng giữ nước) , mà đã cố tình trộn trái phép thuốc tân dược vào các chế phẩm đông dược. Điều này không được thông báo khiến người tiêu dùng vì không biết đã sử dụng thuốc với một liều lớn trong thời gian kéo dài, đây có thể là nguyên nhân gây ra các tác dụng không mong muốn về sau cho người dùng thậm chí là nguy hiểm đến tính mạng. Các nhóm thuốc thường được sử dụng là: glucocorticoid, nhóm giảm đau chống viêm không steroid, nhóm ức chế PDE-5…đây là những thuốc cho tác dụng nhanh và mạnh vì vậy mà chúng bị lạm dụng nhiều. Chính vì vậy mà hiện nay nước ta đã có quy định cụ thể nghiêm cấm trộn trái phép thuốc tân dược vào các chế phẩm đông dược, tuy nhiên việc kiểm soát còn gặp nhiều khó khăn. Sildenafil là một chất thuộc nhóm ức chế PDE-5. Năm 1998, sildenafil với tên biệt dược là Viagra đã được FDA công nhận làm thuốc và cũng là thuốc đầu tiên điều trị rối loạn cương dương trên thế giới. Chính nhờ tác dụng của nó mà việc lạm dụng thuốc và tình hình trộn trái phép sildenafil vào các chế phẩm đông dược ngày càng gia tăng. Trong báo cáo thường niên của hội đồng dược điển Mỹ (USP) năm 2007 đã nêu rõ rằng: “trộn sildenafil và dẫn chất” trở thành vấn đề mang tính toàn cầu [17]. [...]... phần trong công tác nghiên cứu phát hiện thuốc tân dược trộn trái phép trong các chế phẩm đông dược chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu phát hiện sildenafil trong một số chế phẩm đông dược bằng sắc ký lớp mỏng Với các mục tiêu cụ thể sau: 1 Xây dựng quy trình phát hiện sildenafil có thể có trong các chế phẩm đông dược bằng sắc ký lớp mỏng 2 Áp dụng quy trình để kiểm tra một số chế phẩm đông dược. .. của sildenafil tăng lên khi dùng cùng các thuốc: thuốc chống nấm, thuốc ức chế enzyme CYP3A4, kháng sinh marcolid, thuốc ức chế enzyme protease, saproterin Tác dụng của sildenafil giảm đi khi dùng cùng các thuốc: Bosentan, thuốc cảm ứng enzyme CYP3A4, Etravirin 7 1.1.4 Một số nghiên cứu phát hiện Sildenafil trong chế phẩm đông dược Qua một số tài liệu cho thấy đã có nhiều nghiên cứu để phát hiện Sildenafil. .. Sildenafil trong chế phẩm đông dược và thực phẩm chức năng cả trên thế giới và tại Việt Nam [6], [9], [12], [15], [19], [22], [23] Bảng 1.1 trình bày một số nghiên cứu đó: Bảng 1.1: Một số nghiên cứu phát hiện sildenafil STT 1 Phương pháp IR HPLC 2 TLC 3 MS 4 HPTLC 5 Đặc điểm phương pháp TLTK So sánh phổ của chất có mặt trong dịch chiết với phổ chuẩn hoặc phổ của [12] chất chuẩn Điều kiện sắc ký: - Cột... 20%-50% Điều kiện sắc ký: - Bản mỏng silicagel GF254 (Merck) [9] - Dung môi khai triển: chloroform: methanol: diethylamine (90:10:1) v/v - Phát hiện vết: UV λ= 305 nm 1.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng 1.2.1 Nguyên tắc [1] Sắc ký lớp mỏng (SKLM) (Thin - Layer Chromatography) là một kỹ thuật phân tích dùng để tách các chất trong hỗn hợp 8 Quá trình tách bằng SKLM được thực hiện trên một lớp mỏng gồm các hạt... tích được đưa lên ở 2 bờ đối diện của bản mỏng, pha động từ 2 phía chạy vào giữa bản Có bấc để dẫn pha động đi vào bản mỏng 3 Sắc ký hai chiều: trường hợp này bản mỏng hình vuông, vết chấm sắc ký ở một góc bản mỏng Đầu tiên chạy sắc ký với pha động A, làm khô bản mỏng, quay 90o chạy với pha động B Làm khô bản mỏng và phát hiện vết 1.2.4.3 Phát hiện vết trên sắc ký đồ [1], [11], [13] Dựa vào tính chất... màu rõ khi phát hiện ở λ= 366 nm 22 2 Phát hiện bằng đèn tử ngoại các bước sóng: λ= 254nm λ = 366nm Kết quả khảo sát: a b c d Hình 3.2: SKĐ khảo sát điều kiện phát hiện a: phát hiện ở λ= 254nm b: phát hiện ở λ= 366nm c: phát hiện bằng phun TT 10% H2SO4/EtOH, soi λ=366nm d: phát hiện bằng phun TT Dragendroff Nhận xét:  Khi phát hiện ở λ= 254nm cho hình ảnh sắc ký đồ là vết tối trên nền sáng do đó ta... của chất phân tích để lựa chọn cách phát hiện thích hợp các vết sắc ký Một số kỹ thuật phát hiện thường gặp:  Phun thuốc thử hiện màu: Dùng thuốc thử tạo màu với chất phân tích Đôi khi người ta làm nóng bản mỏng để làm tăng tốc độ phản ứng tạo màu và cường độ vết màu Một số thuốc thử tạo màu trong SKLM được thể hiện trong bảng sau: Bảng 1.3 Một số thuốc thử tạo màu trong SKLM Thuốc thử Màu của vết Ứng... Phát hiện các vết trên sắc ký đồ (SKĐ)  Thu nhận và xử lý số liệu thực nghiệm 1.2.4.1 Đưa chất phân tích lên bản mỏng [1], [11] Trước khi thực hiện việc đưa chất phân tích lên bản mỏng cần thực hiện việc hoạt hóa bản mỏng Dụng cụ chấm sắc ký có thể là: mao quản thủy tinh, pipet nhọn, micropipet với nhiều kích cỡ khác nhau, máy chấm sắc ký với bơm tiêm mẫu… Hiện nay có rất nhiều loại máy chấm sắc ký. .. nhau Để loại trừ khả năng đó ta tiến hành phát hiện ở λ= 366nm cho vết 23 sắc ký phát huỳnh quang đặc trưng Kết quả trên SKĐ b cho thấy ở λ= 366nm Sildenafil có phát huỳnh quang  Kết quả phát hiện bằng thuốc thử hiện màu hình ảnh của vết xuất hiện rõ trên SKĐ chúng ta có thể quan sát được Việc phát hiện bằng TT Dragendroff vết cho màu đậm hơn (nhạy hơn), dễ phát hiện hơn vì vết có thể quan sát được dưới... 05/2015 YCS2 19 2.2.2 Nội dung nghiên cứu - Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích: điều kiện sắc ký, điều kiện phát hiện, xử lý mẫu - Đánh giá phương pháp: độ chọn lọc, độ lặp lại, xác định LOD - Ứng dụng: áp dụng quy trình xây dựng được kiểm tra một số mẫu chế phẩm đông dược đang lưu hành trên thị trường 2.2.3 Phương pháp nghiên cứu  Lựa chọn quy trình xử lý mẫu bằng phương pháp chiết hệ dị thể . 1.1.4. Một số nghiên cứu phát hiện Sildenafil trong chế phẩm đông dược Qua một số tài liệu cho thấy đã có nhiều nghiên cứu để phát hiện Sildenafil trong chế phẩm đông dược và thực phẩm chức. phần trong công tác nghiên cứu phát hiện thuốc tân dược trộn trái phép trong các chế phẩm đông dược chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu phát hiện sildenafil trong một số chế phẩm đông dược. TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI  HOÀNG THỊ QUỲNH NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN SILDENAFIL TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM ĐÔNG DƯỢC BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ