BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THỦY NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH DO STREPTOMYCES 183.216 TỔNG HỢP NÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THỦY NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH DO STREPTOMYCES 183.216 TỔNG HỢP NÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: DS. Tạ Thu Lan Nơi thực hiện: Bộ môn Vi sinh và Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô giáo DS.Tạ Thu Lan – Bộ môn Vi sinh – Sinh học, người đã tận tình hướng dẫn tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các cán bộ, kỹ thuật viên giảng dạy, công tác tại Bộ môn Vi sinh – Sinh học, Bộ môn Công nghiệp Dược, trường Đại học Dược Hà Nội, Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương, Trung tâm phổ ứng dụng – Viện hóa học đã giúp đỡ tôi trong thời gian làm thực nghiệm. Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường. Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Do hạn chế về thời gian, điều kiện trang thiết bị và phương tiện nghiên cứu, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thị Thủy MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Đại cương về kháng sinh 2 1.1.1. Định nghĩa 2 1.1.2. Phân loại 2 1.1.3. Cơ chế tác dụng của kháng sinh 2 1.1.4. Ứng dụng của kháng sinh 3 1.1.5. Sơ đồ sinh tổng hợp kháng sinh 3 1.1.6. Khái niệm về tính kháng kháng sinh 3 1.2. Đại cương về xạ khuẩn 4 1.2.1. Đặc điểm chung về xạ khuẩn 4 1.2.2. Đặc điểm chi Streptomyces 4 1.2.3. Phân loại Streptomyces 6 1.3. Tuyển chọn, cải tạo và bảo vệ giống xạ khuẩn 7 1.3.1. Mục đích 7 1.3.2. Chọn lọc tự nhiên 7 1.3.3. Đột biến nhân tạo 7 1.3.4. Bảo quản chủng giống xạ khuẩn 8 1.4. Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 8 1.4.1. Đại cương 8 1.4.2. Các phương pháp lên men 8 1.4.3. Các phương pháp chiết tách kháng sinh 9 1.4.4. Tách và tinh chế các thành phần kháng sinh 10 1.5. Bước đầu nghiên cứu cấu trúc kháng sinh 11 1.5.1. Phổ hồng ngoại 11 1.5.2. Phổ tử ngoại-khả kiến 11 1.5.3. Phân tích khối phổ 12 1.6. Điều chế sinh tổng hợp Daunorubicin từ Streptomyces peucetius-phản hồi và dự tính kiểm soát phiên mã 12 1.7.Nghiên cứu tác dụng gây độc tế bào của Actinomycete phân lập từ chất lắng ở biển 13 Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị 14 2.1.1. Nguyên vật liệu 14 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ 14 2.1.3. Các hóa chất sử dụng 15 2.2. Nội dung nghiên cứu 18 2.3. Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1. Nuôi cấy và giữ giống xạ khuẩn 19 2.3.2. Phân loại xạ khuẩn theo ISP 19 2.3.3. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán 20 2.3.4. Sàng lọc ngẫu nhiên 21 2.3.5. Đột biến bằng ánh sáng UV 22 2.3.6. Xác định độ bền của kháng sinh trong dịch lên men 23 2.3.7. Lên men chìm tổng hợp kháng sinh 23 2.3.8. Chiết kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ 23 2.3.9. Tách các thành phần kháng sinh bằng sắc ký lớp mỏng 24 2.3.10. Thu kháng sinh thô bằng phương pháp cất quay 25 2.3.11. Tinh chế kháng sinh bằng sắc ký cột 25 2.3.12. Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được 25 Chương 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 26 3.1. Xác định tên khoa học của Streptomyces 183.216 theo ISP 26 3.2. Kết quả chọn môi trường nuôi cấy, bảo quản 27 3.3. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên 27 3.4. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 1 28 3.5. Kết quả đột biến cải tạo giống lần 2 29 3.6. Kết quả lên men sinh tổng hợp kháng sinh 30 3.6.1. Chọn môi trường lên men 30 3.6.2. Kết quả chọn chủng lên men 30 3.7. Kết quả thử độ bền kháng sinh với nhiệt độ và pH 31 3.8. Kết quả chọn dung môi và pH chiết 32 3.9. Kết quả sắc ký lớp mỏng 33 3.10. Kết quả tách và tinh chế kháng sinh 34 3.10.1. Kết quả sắc ký cột lần 1 34 3.10.2. Kết quả sắc ký cột lần 2 36 3.10.3. Kết quả sắc ký cột lần 3 38 3.11. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy và đo phổ kháng sinh tinh khiết 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 1. Kết luận 40 2. Đề xuất 41 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic (Chương trình Streptomyces quốc tế) ATCC American type culture collection (Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ) B. cereus Bacillus cereus ATCC 9946 B. pumilis Bacillus pumilus ATCC 6633 B. subtilis Bacillus subtilis ATCC 6633 E. coli Escherichia coli ATCC 25922 P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa VM 201 P. mirabilis Proteus mirabilis BV 108 S. aureus Staphylococcus aureus ATCC 1288 S. flexneri Shighella flexneri DT 112 DM Dung môi ĐB1 Đột biến lần 1 ĐB2 Đột biến lần 2 HTKS Hoạt tính kháng sinh ISP International Streptomyces Project KS Kháng sinh MC Mẫu chứng MT Môi trường MTdt Môi trường dịch thể SLNN Sàng lọc ngẫu nhiên VSV Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Phân loại kháng sinh theo cấu trúc hóa học 2 Bảng 2.1: Các vi khuẩn kiểm định 14 Bảng 2.2: Các dung môi sử dụng trong khóa luận 15 Bảng 2.3: thành phần các MT nuôi cấy xạ khuẩn 16 Bảng 2.4: thành phần các MT nuôi cấy VSV kiểm định 17 Bảng 3.1: Các đặc điểm phân loại ISP của Streptomyces 183.216 và S. orientalis 26 Bảng 3.2: Kết quả chọn môi trường nuôi cấy 27 Bảng 3.3: Kết quả thử HTKS sàng lọc ngẫu nhiên 28 Bảng 3.4: Kết quả thử HTKS sau đột biến cải tạo giống lần 1 28 Bảng 3.5: Kết quả thử HTKS sau đột biến cải tạo giống lần 2 29 Bảng 3.6: Kết quả chọn môi trường lên men 30 Bảng 3.7: Kết quả chọn chủng lên men 31 Bảng 3.8: Kết quả thử độ bền kháng sinh với nhiệt độ 31 Bảng 3.9: Kết quả thử độ bền kháng sinh với pH 32 Bảng 3.10: Kết quả chọn dung môi và pH chiết trên Bacillus subtilis 32 Bảng 3.11: Kết quả chọn dung môi và pH chiết trên Shighella flexneri 33 Bảng 3.12: Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký 34 Bảng 3.13: Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau sắc ký cột lần 1 35 Bảng 3.14: Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn sau sắc ký cột lần 1 36 Bảng 3.15. Kết quả chọn hệ dung môi chạy sắc ký cột lần 2 36 Bảng 3.16: Kết quả thử HTKS các phân đoạn sau sắc ký cột lần 2 37 Bảng 3.17: Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn sau sắc ký cột lần 2 37 Bảng 3.18: Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn sau sắc ký cột lần 3 38 Bảng 3.19: Kết quả đo phổ IR 39 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình P1: Kháng sinh được phát hiện qua các năm 1940 – 2000 Hình P2: Cơ chế tác dụng của kháng sinh Hình P3: Phân loại bộ Actinomycetales Hình P4 : Sơ đồ tổng quát quy trình sinh kháng sinh Hình P5: Hình ảnh bề mặt bào tử chụp bằng kính hiển vi điện tử (sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường ISP3) Hình P6: Hình ảnh chuỗi bào tử chụp bằng kính hiển vi điện tử (sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường ISP3) Hình P7: Thử HTKS bằng phương pháp khối thạch (VSV kiểm định B. subtilis) Hình P8: Thử HTKS bằng phương háp giếng thạch (VSV kiểm định B. subtilis) Hình P9:Thử HTKS bằng phương pháp khoanh giấy (VSV kiểm định B.subtilis) Hình P10:Hình ảnh lên men chìm tổng hợp kháng sinh chủng Streptomyces 183.216 Hình P11: Sắc ký lớp mỏng các phân đoạn sau khi chay sắc ký cột lần 1 Hình P12: Kết quả hiện hình VSV (VSV kiểpm định B. subtilis) Hình P13: Phổ UV-VIS của kháng sinh do Streptomyces 183.216 sinh tổng hợp. Hình P14: Phổ MS của kháng sinh do Streptomyces 183.216 sinh tổng hợp. Hình P15: Phổ IR của kháng sinh do Streptomyces 183.216 sinh tổng hợp. 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Năm 1928, Alexander Fleming (1881-1955) đã phát hiện ra tác dụng của kháng sinh mở ra thời đại mới: thời đại kháng sinh. Việc phát hiện và phát triển kháng sinh của thế kỷ XX đã làm giảm đáng kể tỷ lệ tử vong do nhiễm khuẩn. Song từ những năm 1980, những kháng sinh mới được phát hiện và đưa vào điều trị giảm hẳn do chi phí quá lớn. Đồng thời, vi sinh vật nhanh kháng thuốc và tốc độ đó lại nhanh hơn tốc độ tìm ra thuốc mới của con người. Vì vậy, việc tìm ra các chủng có HTKS cao và phát hiện các loại kháng sinh mới là rất cần thiết. Trong các phương pháp sản xuất kháng sinh, phương pháp phân lập kháng sinh từ xạ khuẩn vẫn là con đường quan trọng để tìm được các chủng có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh và từ đó phát hiện hoạt chất mới. Trong khoảng 16.000 chất kháng sinh được biết đến hiện nay thì có khoảng 60% có nguồn gốc từ xạ khuẩn và tới khoảng 55% trong số đó là từ Streptomyces [8]. Đó là cơ sở để các nhà khoa học nước ta tập trung nghiên cứu vào nhóm xạ khuẩn này. Nằm trong xu hướng này, tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu kháng sinh do Streptomyces 183.216 tổng hợp nên” làm đề tài khóa luận tốt nghiệp với chủng Streptomyces 183.216 do Bộ môn Vi sinh – Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội cung cấp. Khóa luận mong muốn đạt được các mục tiêu sau: 1. Phân loại xạ khuẩn Streptomyces 183.216 theo ISP. 2. Nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh. 3. Xác định điều kiện chiết tách, tinh chế kháng sinh. 4. Xác định sơ bộ các tính chất của kháng sinh thu được. [...]... (mm) D MT7 (mm) Nhận xét: Streptomyces 183. 216 có khả năng sinh tổng hợp tốt trên 3 MT: MT1, MT2, MT7, trong đó trên MT2 cho HTKS mạnh nhất nên chọn MT2 làm môi trường nuôi cấy giống Từ kết quả ở bảng trên có thể thấy kháng sinh do Streptomyces 183. 216 tạo ra có phổ tác dụng rộng, trên cả Gram (-) và Gram (+) Chọn 2 vi khuẩn kiểm định đại diện có độ nhạy cảm thích hợp với kháng sinh là B subtilis và S... trình sinh trưởng của xạ khuẩn cũng như hiệu suất sinh tổng hợp kháng sinh Nếu thiếu phosphat xạ khuẩn sinh trưởng kém, hiệu suất lên men thấp Nếu thừa phosphat sẽ kéo dài pha sinh trưởng, rút ngắn pha tổng hợp kháng sinh [27]  Nguyên tố vi lượng: là yếu tố quan trọng cho sự phát triển của khuẩn Tuy nhiên nếu thừa các nguyên tố vi lượng có thể tạo phức với một số kháng sinh [4] 1.2.3 Phân loại Streptomyces. ..2 Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kháng sinh 1.1.1 Định nghĩa Kháng sinh là những chất có nguồn gốc từ vi sinh vật, được bán tổng hợp hoặc tổng hợp hóa học có hoạt tính sinh học cao có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt chọn lọc một nhóm vi sinh vật xác định (vi khuẩn, nấm, protozoa,…) hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp [1], [2] 1.1.2 Phân loại Có nhiều cách để phân loại kháng sinh: theo nguồn... đóng hộp, cho thêm kháng sinh vào để làm giảm thời gian khử trùng bằng nhiệt, nhiệt độ khử trùng (Nisin, Subtilin) [4] 1.1.5 Sơ đồ sinh tổng hợp kháng sinh Sơ đồ được trình bày ở hình P4, phần Phụ lục [4], [12], [16] 1.1.6 Khái niệm về tính kháng kháng sinh Kháng thuốc là hiện tượng vi sinh vật mất đi tính nhạy cảm ban đầu của nó trong một thời gian hay vĩnh viễn với tác dụng của kháng sinh hay hóa trị... thạch nghiêng trong tủ lạnh, kỹ thuật dùng parafin, làm đông khô, ổn định trong đất Tùy theo trang thiết bị và VSV cần lưu giữ để chọn phương pháp phù hợp Đối với giữ giống trong phòng thí nghiệm, đơn giản nhất có thể sử dụng phương pháp giữ giống trên môi trường thạch nghiêng trong nhiệt độ thấp (2-4˚C) [4], [17] 1.4 Lên men sinh tổng hợp kháng sinh 1.4.1 Đại cương Lên men sinh tổng hợp kháng sinh. .. (15,29%) [29] Kết luận: Nghiên cứu chứng minh rõ rằng chất lắng từ biển có Actinomycete với chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học có thể cung cấp chất liệu sinh học chất lượng cao cho chương trình sinh hóa chống ung thư 14 Chương 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 2.1.1 Nguyên vật liệu - Chủng xạ khuẩn: chủng Streptomyces 183. 216 do Bộ môn Vi sinh - Sinh học cung cấp... NHẬN XÉT 3.1 Xác định tên khoa học của Streptomyces 183. 216 theo ISP Thực hiện các bước thực nghiệm để phân loại Streptomyces 183. 216 theo ISP, đối chiếu với các đặc điểm của một số Streptomyces, nhận thấy Streptomyces 183. 216 có nhiều đặc điểm tương đồng với S orientalis Kết quả được trình bày trong bảng 6, hình ảnh chuỗi bào tử và bề mặt bào tử Streptomyces 183. 216 (sau 10 ngày nuôi cấy trên MT ISP3)... với tác dụng của kháng sinh hay hóa trị liệu Có 2 kiểu kháng thuốc: kháng thuốc tự nhiên và kháng thuốc mới nhận Kháng thuốc tự nhiên là đặc trưng của từng loài sinh vật nhất định đối với một số kháng sinh nhất định nào đó Kháng thuốc mới nhận có thể do thay đổi tính thấm thành tế bào, do các enzym vô hiệu hóa kháng sinh, thay đổi phân tử đích hoặc do hoạt hóa các con đường trao đổi chất thay thế khác... cao khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của chủng xạ khuẩn 2.2.3 Lên men chìm - Chọn 1MT lên men chìm tốt nhất - Thực hiện lên men từ các dạng chủng và biến chủng thu được, lựa chọn dạng chủng (biến chủng) có khả năng lên men tạo kháng sinh mạnh nhất 2.2.4 Chiết tách, tinh chế kháng sinh -Tìm dung môi hữu cơ và pH chiết tối thích - Tìm hệ dung môi khai triển có khả năng tách hỗn hợp kháng sinh tốt nhất... không thu bột kháng sinh Bột tinh thể kháng sinh được kết tinh lại bằng hỗn hợp dung môi, lọc, sấy khô ở 50˚C để thu tinh thể kháng sinh tinh khiết 2.3.11 Sơ bộ xác định cấu trúc kháng sinh tinh khiết thu được Kháng sinh tinh khiết được đo các thông số: nhiệt độ nóng chảy, phổ hồng ngoại, tử ngoại, phổ khối để bước đầu xác định thành phần, phân tử lượng và dự đoán nhóm cấu trúc kháng sinh thu được 26 . của kháng sinh do Streptomyces 183. 216 sinh tổng hợp. Hình P14: Phổ MS của kháng sinh do Streptomyces 183. 216 sinh tổng hợp. Hình P15: Phổ IR của kháng sinh do Streptomyces 183. 216 sinh tổng hợp. . trung nghiên cứu vào nhóm xạ khuẩn này. Nằm trong xu hướng này, tôi lựa chọn đề tài: Nghiên cứu kháng sinh do Streptomyces 183. 216 tổng hợp nên làm đề tài khóa luận tốt nghiệp với chủng Streptomyces. NGHIÊN CỨU KHÁNG SINH DO STREPTOMYCES 183. 216 TỔNG HỢP NÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THỦY NGHIÊN