BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI  PHAN THỊ THU HUYỀN NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT PHÂN LẬP ALCALOID TỪ CÂY Ô ĐẦU (Aconitum sp.) TRỒNG Ở TỈNH HÀ GIANG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2014 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHAN THỊ THU HUYỀN NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT PHÂN LẬP ALCALOID TỪ CÂY Ô ĐẦU (Aconitum sp.) TRỒNG Ở TỈNH HÀ GIANG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: 1. TS. Nguyễn Hoàng Tuấn 2. ThS. Vũ Đức Lợi Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Dược liệu 2. Khoa Y dược ĐHQGHN HÀ NỘI – 2014 LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Hoàng Tuấn – giảng viên bộ môn Dược Liệu, và ThS. Vũ Đức Lợi - giảng viên khoa Y dược ĐH Quốc Gia Hà Nội, đã hướng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới bộ môn Dược Liệu ĐH Dược Hà Nội, Khoa Y Dược ĐH Quốc Gia Hà Nội, viện Dược Liệu đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm tại bộ môn và tại khoa. Xin cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, các phòng ban đã tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận. Cảm ơn các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội đã quan tâm dìu dắt và truyền thụ kiến thức cho tôi trong 5 năm học vừa qua. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn ủng hộ, động viên và khích lệ tôi trong quá trình học tập và làm khóa luận. Hà Nội, tháng 5 năm 2014 Sinh viên Phan Thị Thu Huyền MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Thực vật học 3 1.1.1.Vị trí phân loại chi Aconitum L. [1], [6], [29]. 3 1.1.2. Đặc điểm thực vật của chi Aconitum L. 3 1.1.3. Số lượng và sự phân bố các loài thuộc chi Aconitum L. 4 1.2.Thành phần hóa học các cây thuộc chi AconitumL. 4 1.2.1. Phân loại alcaloid trong chi AconitumL. 5 1.2.2. Một số quy trình chiết xuất phân lập alcaloid từ chi Aconitum L. 13 1.3. Công dụng, tác dụng của cây ô đầu 15 1.3.1. Công dụng cây ô đầu 15 1.3.2. Tác dụng dược lý được nghiên cứu 16 1.4. Một số sản phẩm từ cây ô đầu 16 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1.Nguyên liệu 17 2.2 Hóa chất 17 2.3. Thiết bị 18 2.4. Phương pháp nghiên cứu 18 2.4.1. Nghiên cứu thực vật 18 2.4.2.Nghiên cứu thành phần hoá học 19 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 22 3.1. Giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu 22 3.1.1. Đặc điểm hình thái thực vật 22 3.1.2. Xác định tên khoa học 25 3.2. Định tính alcaloid trong Ô đầu trồng tại Hà giang 25 3.2.1. Định tính bằng phản ứng hóa học 25 3.2.2. Định tính bằng sắc ký lớp mỏng 26 3.3. Chiết xuất phân lập alcaloid từ phụ tử 29 3.4. Xác định cấu trúc của alcaloid phân lập được 30 3.4.1. Alcaloid OD7 30 3.4.2. Alcaloid OD8 34 3.5. Bàn luận 37 3.5.1. Về tên khoa học của mẫu nghiên cứu 37 3.5.2. Về định tính alcaloid 38 3.5.3. Về chiết xuất phân lậpmột số Alcaloid từAconitum carmichaeliDebx. ở Hà giang. 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 Kết luận 40 Đề nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 1: Kết quả giám định mẫu nghiên cứu PHỤ LỤC 2: Phổ OD7 PHỤ LỤC 3: Phổ OD8 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT A.: Aconitum CHCl 3 : Cloroform DC : Dịch chiết DD : Dung dịch DM : Dung môi EtOAc : Ethyl acetat EtOH : Ethanol HPLC : High performance liquid chromatography MeOH : Methanol PĐ: Phân đoạn R f : Hệ số lưu SK: Sắc ký SKLM: Sắc ký lớp mỏng STT : Số thứ tự TLTK : Tài liệu tham khảo TT : Thuốc thử DM : dung môi 1 H-NMR : Hydro nuclear Magnetic Resonance UV: Ultra Violet Spectroscopy δ: Độ dịch chuyển hóa học (đơn vị tính ppm) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số alcaloid khung cấu trúc C 18 - diterpenoid phân lập từ chi Aconitum. Bảng 1.2 Một số alcaloid khung cấu trúc C 19 - diterpenoid phân lập từ chi Aconitum Bảng 1.3 Một số alcaloid khung cấu trúc C 20 - diterpenoid phân lập từ chi Aconitum Bảng 1.4 Một số alcaloid thuộc nhóm khác phân lập từ chi Aconitum Bảng 3.1 Kết quả định tính alcaloid trong Ô đầu Hà Giang bằng phản ứng hóa học Bảng 3.2 Số liệu phổ 1 H-NMR(500MHz) và 13 C-NMR(125MHz) của chất OD7 Bảng 3.3 Số liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của chất OD8 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1. Khung C 18 - diterpenoid alcaloid Hình 1.2. Khung C 19 - diterpenoid alcaloid Hình 1.3. Khung C 20 - diterpenoid alcaloid Hình 1.4. Khung cấu trúc của nhóm Alcaloid bisditerpenoid Hình 1.5. Quy trình chiết xuất, phân lập alcaloid theo Liang Xiong Hình 1.6. Quy trình chiết xuất phân lập alcaloid theo Ning Xu Hình 3.1. Cành Ô đầu có hoa, quả Hình 3.2. Tiêu bản cây Ô đầu Hình 3.3. Lá Ô đầu, mặt trên Hình 3.4. Lá Ô đầu, mặt dưới Hình 3.5. Hoa của Ô đầu Hình 3.6. Các bộ phận của hoa Ô đầu Hình 3.7. Nhụy hoa Hình 3.8. Nhị hoa Hình 3.9. Quả và hạt Ô đầu Hình 3.10. Củ cây Ô đầu Hình 3.11. Ảnh chụp sắc ký lớp mỏng dịch chiết toàn phần từ củ Ô đầu Hà Giang. Hình 3.12. Sơ đồ chiết xuất và phân lập alcaloid từ Phụ tử Hình 3.13. Cấu trúc của Chất OD7: Benzoylmesaconitin Hình 3.14. Cấu trúc của hợp chất OD8: Fuzilin ĐẶT VẤN ĐỀ Ô đầu, phụ tử là một trong những vị thuốc quý được sử dụng từ lâu đời. Những vị thuốc này lấy từ củ của một số loài thuộc chi Aconitum L. (chi Ô đầu). Trong y học cổ truyền nước ta và Trung Quốc thường sử dụng rễ củ của các loài đó với tên vị thuốc là Ô đầu (củ mẹ) và Phụ tử (củ con) [2], [6]. Phụ tử là một vị thuốc hồi dương cứu nghịch, khử phong hàn dùng chữa một số triệu chứng nguy cấp: trụy tim mạch, ra nhiều mồ hôi, chân tay giá lạnh, là một trong 4 vị thuốc quý: sâm, nhung, quế, phụ [2], [3], [4]. Ngày nay các loài thuộc chi Aconitum đã được các nhà khoa học trên thế giới ứng dụng trong điều trị nhiều bệnh: viêm khớp, tim mạch, đau, sung huyết [3], [9], [15], [23], [28] với các dạng bào chế hiện đại như dạng viên, ống nước, bột [9]. Hiện các nhà khoa học đang tiếp tục nghiên cứu các loài thuộc chi Aconitum để tìm ra các tác dụng mới cũng như các thuốc mới ứng dụng trong điều trị bệnh. Việc nghiên cứu xác định thành phần hóa học và tác dụng sinh học của các loài cây thuốc là cơ sở khoa học cho việc sử dụng chúng hợp lý, an toàn và hiệu quả. Sử dụng các phương pháp chiết xuất, phân lập để xác định thành phần hóa học của cây thuốc. Thành phần chính trong Ô đầu là alcaloid. Đây là nhóm chất lớn có tác dụng mạnh nhưng có độc tính cao [1], [28]. Nhóm alcaloid với những khung cấu trúc khác nhau, công thức cấu tạo và tính chất hóa học khá phức tạp [28]. Ở Việt Nam, cây Ô đầu được trồng chủ yếu tại tỉnh Hà Giang, Lào Cai, Lai Châu, Cao Bằng [2], [5]. Tuy nhiên đến nay chưa có nghiên cứu nào về cây Ô đầu trồng tại tỉnh Hà Giang. Với những lý do trên chúng tôi đã thực hiện đề tài: "Nghiên cứu chiết xuất phân lập alcaloid từ cây Ô đầu (Aconitum sp.) trồng ở tỉnh Hà Giang " với các mục tiêu: 1.Giám định tên khoa học của cây Ô đầu trồng ở tỉnh Hà Giang 2. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của một số alcaloid phân lập được [...]... thể chiết xuất, phân lập alcaloid t Aconitum theo nhiều phương pháp với nhiều dung môi khác nhau Dưới đây là một số quy trình chiết xuất phân lập alcaloid: +Liang Xiong và các cộng sựđã chiết xuất một số alcaloid từ loài Aconitum carmichaeli: aconicarmin (1 ), fuzilin (2 ), neolin (3 ), Nethylhokbusin B (4 ), aconicaramid (5 ), 5-hydroxymethylpyrrol-2-carbaldehyd (6 ), oleracein E (7 ) theo quy trình chiết xuất. .. Cao chiết ethanol Triển khai sắc ký cột silica gelDM ether dầu hỏa : EtOAc Phân đoạn DC Triển khai HPLC hệ dung môi acid formic/H2O (0 .2:10 0) HC1 Bb HC2 HC3 Hình 1.6 Quy trình chiết xuất phân lập alcaloid theo Ning Xu 1.3 Công dụng, tác dụng của cây ô đầu 1.3.1 Công dụng cây ô đầu Theo y học cổ truyền: cây ô đầu từ trước tới nay chủ yếu dùng phần củ mẹ ( đầu) và củ con (phụ t ) [2], [4] 1.3.1.1 Ô đầu. .. Quy trình chiết xuất, phân lập alcaloid theo Liang Xiong + Một số alcaloid trong Aconitum kusnezoffii Reichb đã được chiết xuất và phân lập từ 5 kg bột củ con Chiết xuất theo quy trình ở hình 1.6 thu được các hợp chất 1,15-dimethoxy-3-hydroxy-14-benzoyl-16-ketoneolin (4 .1 mg), benzoylaconin (5 .2 mg) và aconitin (3 .2 mg) [31] Phụ tử sấy khô (5 kg) ngâm chiết trong EtOH 96% (5 0 lít) 12h Dịch chiết ethanol... mẫu cây Ô đầu trồng và mọc hoang ở huyện Quản Bạ tỉnh Hà Giang Lấy củ mẹ, củ con của cây khi cây đã ra hoa và lụi Lấy lá cây khi cây đã ra quả Nguyên liệu được sấy khô ở 600C, bảo quản trong túi polyetylen kín, khô ráo Mẫu nghiên cứu về thành phần hóa học là củ của cây Ô đầu Mẫu cây có hoa quả để định tên khoa học thu hái vào ngày 29/9/2012 tại huyện Quản Bạ, tỉnh Hà Giang Mẫu cây tươi được tiến hành... trí phân loại chi Aconitum L [1], [6], [29] Cây Ô đầu ở Việt Nam thuộc chi Aconitum L., vị trí của chi Aconitum L trong hệ thống phân loại thực vật được tóm tắt như sau: Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae) Bộ Hoàng liên (Ranunculales) Họ Hoàng liên (Ranunculaceae) Chi Aconitum L 1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Aconitum L Các cây thuộc chi Aconitum. .. nhập nội từ 2 nguồn: Nguồn thứ nhất do ngành Y tế chính thức nhập giống từ Trung Quốc được trồng đầu tiên ở Sapa- Lào Cai từ đầu những năm 70 của thế kỷ trước, sau còn được trồng ở Bắc Hà - Lào Cai và Sìn Hồ- Lai Châu Nguồn thứ 2 do cộng đồng người Hoa ở huyện Quản Bạ, huyện Đồng Văn - Hà Giang tự nhập giống Ô đầu từ bên kia biên giới về trồng ở vườn nhà và nương rẫy Có tài liệu cho rằng cây Ô đầu Việt... Alcaloid bisditerpenoid R N O R N Hình 1.4 Khung cấu trúc của nhóm Alcaloid bisditerpenoid Một số alcaloid thuộc nhóm bisditerpenoid được phân lập như: trichocarpin A, trichocarpin B (A tanguticum) [28],piepunin (phân lập từ A piepunense), pukeensin (phân lập từ A pukeense) 1.2.1.5 Alcaloid thuộc nhóm khác Nhiều nghiên cứu còn tìm thấy các chất không có cấu trúc diterpenoid đặc trưng của các loài Ô. .. Cloroform-Aceton-Acid formic (5 :2: 1), hiện màu bằng thuốc thử Dragendorff 2.4.2.2 Chiết xuất và phân lập alcaloid Phương pháp - Chiết xuất: sử dụng dung môi cồn để chiết xuất các alcaloid, sau đó kiềm hóa bằng NH3 đặc để chuyển các alcaloid sang dạng muối, tiếp tục chiết bằng dung môi n-hexan để làm giàu các alcaloid - Phân lập các hợp chất trong Ô đầu, Phụ tử bằng sắc ký cột và SKLM điều chế - Tiến hành: + Chuẩn... trình chiết xuất ở hình 1.5 [30]: Phụ tử sấy khô (5 kg) Ngâm chiết trong EtOH 95% (1 0l x 3 lần) trong 12h Dịch chiết ethanol 95% Cất thu hồi DM dưới áp suất giảm Cao chiết ethanol (6 20g) Chiết bằng n-butanol (2 ,5l x 5 lần), cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm Cao chiết n-butanol (8 5g) Triển khai sắc ký cột silica gel kích thước hạt: 0,063-0,2mm Hệ dung môi là: CHCl3-MeOH (5 0:1-1: 1) PĐ B SK Sephadex... đài không tồn tại Trong mỗi đại chứa 10-20 hạt dẹt, dài 4-5mm, rộng 2-3mm, có cánh mỏng Hình 3.1 Cành Ô đầu có hoa, quả Hình 3.2 Tiêu bản cây Ô đầu Hình 3.3 Lá Ô đầu, mặt trên Hình 3.4 Lá Ô đầu, mặt dƣới Hình 3.5 Hoa của Ô đầu Hình 3.6 Các bộ phận hoa Ô đầu Hình 3.7 Nhụy hoa Hình 3.8 Nhị hoa Hình 3.9 Quả và hạt Ô đầu Hình 3.10 Củ cây Ô đầu 3.1.2 Xác định tên khoa học Sau khi tiến hành quan sát và phân . chúng tôi đã thực hiện đề tài: " ;Nghiên cứu chiết xuất phân lập alcaloid từ cây Ô đầu (Aconitum sp. ) trồng ở tỉnh Hà Giang " với các mục tiêu: 1.Giám định tên khoa học của cây Ô đầu trồng. ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI  PHAN THỊ THU HUYỀN NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT PHÂN LẬP ALCALOID TỪ CÂY Ô ĐẦU (Aconitum sp. ) TRỒNG Ở TỈNH HÀ GIANG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2014. BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHAN THỊ THU HUYỀN NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT PHÂN LẬP ALCALOID TỪ CÂY Ô ĐẦU (Aconitum sp. ) TRỒNG Ở TỈNH HÀ GIANG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC