BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ THỊ BÍCH PHƯỢNG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME AMPHOTERICIN B BẰNG PHƯƠNG PHÁP BỐC HƠI PHA ĐẢO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ THỊ BÍCH PHƯỢNG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME AMPHOTERICIN B BẰNG PHƯƠNG PHÁP BỐC HƠI PHA ĐẢO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Trần Thị Hải Yến 2. DS. Đào Thị Thùy Dung Nơi thực hiện: Bộ môn Bào chế Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới: TS. Trần Thị Hải Yến DS. Đào Thị Thùy Dung Là những người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Tôi cũng xin chân trọng cảm ơn PGS. TS. Phạm Thị Minh Huệ về những chỉ bảo và định hướng của cô cho đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến toàn thể các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận này. Nhân đây, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn các thầy cô trong ban giám hiệu, các phòng ban và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dạy bảo tôi trong suốt 5 năm học tập tại trường. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè những người đã giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập và làm khóa luận. Hà Nội, tháng 5 năm 2013 Sinh viên Ngô Thị Bích Phượng MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Amphotericin B 2 1.1.1. Công thức hóa học 2 1.1.2. Đặc tính lý hóa 2 1.1.3. Tác dụng dược lý 3 1.1.4. Dược động học 3 1.1.5. Chỉ định 3 1.1.6. Tác dụng không mong muốn 4 1.1.7. Liều dùng 4 1.1.8. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường 4 1.2. Liposome 5 1.2.1. Khái niệm 5 1.2.2. Thành phần 5 1.2.3. Ưu nhược điểm 8 1.2.3.1. Ưu điểm 8 1.2.3.2. Nhược điểm 8 1.2.4. Độ ổn định 9 1.3. Bào chế liposome bằng phương pháp bốc hơi pha đảo 10 1.3.1. Tạo liposome thô 10 1.3.2. Giảm kích thước tiểu phân liposome 11 1.3.3. Phương pháp tinh chế liposome 13 1.4. Một số nghiên cứu về liposome Amphotericin B 14 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu, phương tiện nghiên cứu 17 2.2. Nội dung nghiên cứu 18 2.3. Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1. Phương pháp xác định độ tan bão hòa của AMB trong môi trường đệm phosphat pH khác nhau 18 2.3.2. Phương pháp bào chế liposome AMB 18 2.3.3. Phương pháp đánh giá một số đặc tính của liposome AMB 20 2.3.3.1. Phương pháp đánh giá hình thức, hình thái, phân bố KTTP liposome 20 2.3.3.2. Phương pháp xác định nhiệt độ chuyển pha của lớp màng lipid ……… Error! Bookmark not defined. 2.3.3.3. Phương pháp đánh giá hiệu suất liposome hóa 21 2.3.3.3.1. Phương pháp định lượng AMB trong liposome 21 2.3.3.3.2. Phương pháp xác định hiệu suất liposome hóa 23 2.3.3.4. Tính ổn định của liposome AMB 23 2.4. Điều kiện thí nghiệm 23 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1. Thẩm định phương pháp định lượng AMB 24 3.1.1. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí 24 3.1.2. Độ đặc hiệu 24 3.1.3. Tính tuyến tính 25 3.1.4. Độ lặp lại 26 3.1.5. Giới hạn phát hiện 26 3.2. Độ tan bão hòa của AMB trong môi trường đệm phosphat pH khác nhau… 27 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức bào chế đến đặc tính của liposome AMB 28 3.3.1. Bố trí thí nghiệm 28 3.3.2. Đánh giá một số đặc tính của liposome AMB 28 3.3.2.1. Hình thức, hình thái, phân bố KTTP của liposome AMB 28 3.3.2.2. Hiệu suất liposome hóa 32 3.3.2.3. Tính ổn định của liposome AMB 34 3.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dược chất trong công thức đến đặc tính của liposome 37 3.5. Bàn luận 39 3.5.1. Về phương pháp định lượng AMB 39 3.5.2. Về phương pháp bào chế 39 3.5.3. Về phương pháp đánh giá hiệu suất liposome hóa 40 3.5.4. Về xây dựng công thức 41 3.5.5. Về độ ổn định của liposome AMB 42 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT TT Viết tắt Từ/ cụm từ đầy đủ 1 AMB Amphotericin B 2 Chol Cholesterol 3 DĐVN Dược điển Việt Nam 4 DMPC α-Dimyristoylphosphatidylcholin 5 DMPG l-α-Dimyristoylphosphatidylglycerol 6 DSC Phân tích nhiệt vi sai (Differential scanning calorimetry) 7 DSPC Distearoylphophatidylcholin 8 DSPG Distearoylphosphatidylglycerol 9 EDTA Ethylendiamin tetraacetic acid 10 HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (high performance liquid chromatography) 11 HSPC Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (Hydrogenated soy phosphatidylcholine) 12 IC50 Nồng độ thuốc ức chế 50% đối tượng thử (50 % inhibitory concentrations) 13 KTTP Kích thước tiểu phân 14 N/D Nước/dầu 15 NSX Nhà sản xuất 16 PDI Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index) 17 RBCPR Chỉ số giải phóng kali ra khỏi tế bào hồng cầu (red blood cell potassium release) 18 SPC Phosphatidylcholin đậu nành (Soy phosphatidylcholine) 19 TEM Kinh hiển vi điện tử truyền qua (Transmission electron microscope) 20 TKHH Tinh khiết hóa học 21 USP United state Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ) DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Số hiệu Tên bảng biểu Trang Bảng 1.1 Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường 4 Bảng 2.1 Nguyên liệu 17 Bảng 3.1 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc kí 24 Bảng 3.2 Mối tương quan giữa nồng độ AMB và diện tích peak 25 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát tính lặp lại của hệ thống sắc kí 27 Bảng 3.4 Thành phần các công thức bào chế liposome AMB 28 Bảng 3.5 KTTP và phân bố KTTP của các mẫu liposome AMB 29 Bảng 3.6 Hiệu suất liposome hóa của các mẫu liposome AMB 32 Bảng 3.7 KTTP, phân bố KTTP và hiệu suất liposome hóa của các mẫu sau 1 tuần bảo quản 34 Bảng 3.8 Thành phần công thức của mẫu liposome A553 và A554 37 Bảng 3.9 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dược chất trong công thức đến các đặc tính của liposome AMB 37 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Số hiệu Tên hình vẽ, đồ thị Trang Hình 1.1 Cấu trúc của liposome 5 Hình 1.2 Dạng tồn tại của các chất lưỡng tính khi phân tán trong môi trường nước 6 Hình 1.3 Cấu trúc của phospholipid ở dưới và trên nhiệt độ chuyển pha 7 Hình 1.4 Cơ chế hình thành liposome bằng phương pháp bốc hơi pha đảo 11 Hình 1.5 Cơ chế giảm KTTP liposome bằng phương pháp đùn ép (extrusion) 16 Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn của quy trình bào chế liposome AMB 20 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ AMB và diện tích peak 26 Hình 3.2 Hỗn dịch liposome AMB sau khi bào chế 29 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn KTTP của các mẫu liposome AMB 30 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn KTTP, phân bố KTTP của các mẫu liposome nhóm A 30 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn KTTP, phân bố KTTP của các mẫu liposome nhóm B 30 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn hiệu suất liposome hóa của các mẫu liposome 33 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi KTTP của các mẫu liposome sau 1 tuần bảo quản 35 Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hiệu suất liposome hóa của các mẫu liposome sau 1 tuần bảo quản 36 Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn KTTP và phân bố KTTP của các mẫu có tỷ lệ % mol dược chất/tổng lượng lipid khác nhau 38 Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn hiệu suất liposome hóa của các mẫu có tỷ lệ % mol dược chất/tổng lượng lipid khác nhau 38 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học và công nghệ, ngày càng có nhiều dạng thuốc mới ra đời với những tính năng vượt trội hơn so với các dạng thuốc quy ước. Trong đó, liposome được đánh giá là một hệ vận chuyển thuốc có tính tương hợp sinh học cao, có khả năng vận chuyển thuốc hướng đích tách dụng, tăng sinh khả dụng và giảm độc tính của thuốc. Đây được coi là một hướng nghiên cứu mới trong lĩnh vực công nghệ dược phẩm và đang được đầu tư nghiên cứu rất nhiều ở các nước trên thế giới và ở Việt Nam. Amphotericin B là một dược chất thân dầu, có tác dụng kháng nấm, được chỉ định trong trường hợp nhiễm nấm nặng toàn thân do hoạt tính kháng nấm mạnh và phổ tác dụng rộng. Tuy nhiên, thuốc có độc tính cao do tính chọn lọc giữa tế bào nấm và tế bào cơ thể người thấp, vì vậy việc sử dụng còn hạn chế. Đã có rất nhiều hướng nghiên cứu nhằm giảm độc tính của thuốc, trong đó sử dụng liposome làm chất mang đang là một hướng đi đầy triển vọng. Để góp phần ứng dụng liposome làm chất mang làm giảm độc tính của thuốc, đề tài “Nghiên cứu bào chế liposome amphotericin B bằng phương pháp bốc hơi pha đảo” nhằm mục tiêu: + Bào chế được liposome amphotericin B bằng phương pháp bốc hơi pha đảo. + Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức bào chế đến đặc tính của liposome amphotericin B. [...]... Các nghiên < /b> cứu < /b> cũng chỉ ra rằng quá trình đông khô không ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị của thuốc [25] 1.3 B o < /b> chế < /b> liposome < /b> b ng phương pháp b c hơi pha đảo 1.3.1 Tạo liposome < /b> thô Liposome < /b> được tạo ra b ng phương pháp b c hơi pha đảo nhờ quá trình trung gian tạo micel đảo Phospholipid, cholesterol và các chất tan trong dầu được hòa tan b ng dung môi hữu cơ thích hợp, sau đó đem cất quay để loại b ... b o hòa của AMB trong môi trường đệm phosphat pH khác nhau - Lựa chọn các thông số kĩ thuật b o < /b> chế < /b> liposome < /b> AMB b ng phương pháp b c hơi pha đảo - Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức đến các đặc tính của liposome < /b> AMB 2.3 Phương pháp nghiên < /b> cứu < /b> 2.3.1 Phương pháp xác định độ tan b o hòa của AMB trong môi trường đệm phosphat pH khác nhau - Tiến hành khảo sát độ tan b o hòa của AMB... tăng sự tách pha của dược chất ra khỏi lớp màng lipid kép [23] 14 1.4 Một số nghiên < /b> cứu < /b> về liposome < /b> Amphotericin < /b> B Pleumchitt Rojanapanthu cùng cộng sự đã nghiên < /b> cứu < /b> đặc tính lý hóa của liposome < /b> amphotericin < /b> B b o < /b> chế < /b> từ phosphatidylcholin (PC), cholesterol b ng phương pháp b c hơi pha đảo, sử dụng tỷ lệ diethylether: dung dịch NaCl 0,9 % là 3:1 v/v, siêu âm trong 5 phút ở 7 ºC, b c hơi ở 25 ºC để... suất liposome < /b> hóa giảm, do độ tan hạn chế < /b> của AMB trong diethyl ether (< 0,01 mg/ml) [15] S.P Shah và cộng sự đã nghiên < /b> cứu < /b> b o < /b> chế < /b> liposome < /b> AMB dạng b t xông hít dùng điều trị nhiễm nấm xâm lấn ở phổi b ng phương pháp b c hơi pha đảo sử dụng hỗn hợp ethyl acetat và ethanol làm pha dung môi hữu cơ, pha nước là dung dịch đệm Tris 0,01 M pH 6,5 chứa 1 mM EDTA Liposome < /b> tạo ra được đùn ép qua màng polycarbonat... trình tạo trạng thái gel và b gẫy các micel đảo để hình thành liposome < /b> sẽ không xảy ra 11 Hình 1.4 Cơ chế < /b> hình thành liposome < /b> b ng phương pháp b c hơi pha đảo Ưu điểm của phương pháp này là tạo ra các tiểu phân liposome < /b> chứa 1 thể tích khoang nước lớn và do đó tăng hiệu suất gắn thuốc đối với các dược chất tan trong nước Phương pháp này rất phù hợp để b o < /b> chế < /b> các tiểu phân liposome < /b> mang các chất có... AMB trong từng môi trường b ng phương pháp HPLC với các điều kiện đã mô tả ở mục 2.3.3.3.1, thu được diện tích peak tương ứng Si - Xác định nồng độ AMB (Ci) trong từng môi trường b ng phương pháp so sánh diện tích peak với dung dịch AMB chuẩn pha trong dung môi thử có nồng độ Co, diện tích peak S0 xác định: Ci = × Co 2.3.2 Phương pháp b o < /b> chế < /b> liposome < /b> AMB Nghiên < /b> cứu < /b> đã tiến hành lựa chọn phương pháp. .. 15 suất gắn dược chất là 22,5 ± 2,2 % (AMB 1) và 16,8 ± 2,2 % (AMB 2) Liposome < /b> AMB tạo ra b o quản ở 2-8 ºC có tuổi thọ trên 1 năm [16] Deepak Singodia cùng cộng sự nghiên < /b> cứu < /b> b o < /b> chế < /b> liposome < /b> AMB sử dụng phosphatidylglycerol, chol và DMPC (F - 1a) hoặc SPC (F - 2a) b ng phương pháp pha loãng ethanol như sau: AMB hòa tan trong dimethyl acetamid được acid hóa b ng dung dịch HCl 0,1 %, trộn lẫn với dung... để thu được liposome < /b> AMB Kết quả cho thấy các liposome < /b> b o < /b> chế < /b> b ng phương pháp này có KTTP khoảng 100 nm, thế zeta -43,3 ± 2,8 mV và hiệu suất gắn thuốc trên 95 % đối với tất cả các mẫu, khả năng giải phóng dược chất in vitro trong 24 giờ và giá trị IC50 của 2 công thức hầu như không có sự khác biệt so với chế < /b> phẩm Ambisome [20] A Manosroi cùng cộng sự đã nghiên < /b> cứu < /b> b o < /b> chế < /b> liposome < /b> AMB với nguyên... 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên < /b> cứu,< /b> nguyên vật liệu, phương tiện nghiên < /b> cứu < /b> - Đối tượng nghiên < /b> cứu:< /b> liposome < /b> AMB - Nguyên liệu: B ng 2.1 Nguyên liệu TT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn 1 Amphotericin < /b> B Trung Quốc USP 2 Cholesterol Trung Quốc NSX 3 Phosphatidylcholin đậu nành Avanti polar Lipids – NSX (soy phosphatidylcholine) Mỹ 4 Chloroform Labscan – Thái Lan NSX 5... liposome < /b> AMB Nghiên < /b> cứu < /b> đã tiến hành lựa chọn phương pháp b c hơi pha đảo để b o < /b> chế < /b> liposome < /b> AMB 19 Quy trình b o < /b> chế < /b> liposome < /b> AMB như sau: Cân và hòa tan AMB trong 50 ml methanol (0,2 mg AMB/ml methanol) Cân và hòa tan SPC, chol trong 15 ml chloroform Phối hợp 2 dung dịch trên, khuấy trộn để thu được dung dịch đồng nhất Chuyển dung dịch lipid vào b nh cầu dung tích 1000 ml của hệ thống cất quay Tiến . ứng dụng liposome làm chất mang làm giảm độc tính của thuốc, đề tài Nghiên cứu b o chế liposome amphotericin B bằng phương pháp b c hơi pha đảo nhằm mục tiêu: + B o chế được liposome amphotericin. 1.3. B o chế liposome b ng phương pháp b c hơi pha đảo 10 1.3.1. Tạo liposome thô 10 1.3.2. Giảm kích thước tiểu phân liposome 11 1.3.3. Phương pháp tinh chế liposome 13 1.4. Một số nghiên cứu. 1.3. B o chế liposome b ng phương pháp b c hơi pha đảo 1.3.1. Tạo liposome thô Liposome được tạo ra b ng phương pháp b c hơi pha đảo nhờ quá trình trung gian tạo micel đảo. Phospholipid, cholesterol