Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của ngành dược phẩm Việt Nam, việc mua bán, trao đổi dược liệu phục vụ nhu cầu điều trị, chăm sóc sức khỏe và sản xuất chế phẩm đông dược ngày càng nhiều. Tuy nhiên, hệ thống quản lý và kiểm tra chất lượng dược liệu của nước ta còn nhiều hạn chế và chưa được các cơ quan có thẩm quyền quan tâm đứng mức. Vì vậy, việc xây dựng các tiêu chuẩn kiểm nghiệm và đưa chúng vào các tài liệu là cơ sở pháp lý của việc kiểm nghiệm như Dược điển Việt Nam là rất cần thiết. Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.,), thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) từ lâu đã được sử dụng trong y học dân gian để chữa sốt rét, mẩn ngứa, lở loét, đau bụng đi ngoài, ăn không tiêu, chữa viêm loét dạ dày, tá tràng 1. Những kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và thử hoạt tính sinh học của cây Khổ sâm cho lá đã khẳng định các diterpen thuộc nhóm entkauran có tác dụng chống ung thư và chống viêm rất mạnh 21. Trong DĐVN IV đã có chuyên luận về dược liệu Khổ sâm cho lá. Tuy nhiên, trong chuyên luận chưa có tiêu chí về định tính, định lượng entkauran 3. Vì những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học vị thuốc Khổ sâm cho lá phục vụ công tác kiểm nghiệm dược liệu trên thị trường”. Với 3 mục tiêu: Định tính các thành phần hóa học có trong lá cây Khổ sâm cho lá. Chiết xuất, phân lập 01 entkauran chính trong Khổ sâm cho lá dùng làm chất đối chiếu trong định tính, định lượng. Xây dựng phương pháp định tính, định lượng entkauran phân lập được trong dược liệu Khổ sâm cho lá.
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HẰNG AN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VỊ THUỐC KHỔ SÂM CHO LÁ PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU TRÊN THỊ TRƯỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HẰNG AN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VỊ THUỐC KHỔ SÂM CHO LÁ PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU TRÊN THỊ TRƯỜNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: 1. TS. Nguyễn Hoàng Tuấn 2. TS. Phương Thiện Thương Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Dược liệu Trường Đại học Dược Hà Nội 2. Khoa Hóa phân tích-Tiêu chuẩn Viện Dược liệu HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến TS. Nguyễn Hoàng Tuấn và TS. Phương Thiện Thương, những người thầy đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo cho tôi từ những bước đầu tiên cho đến khi tôi hoàn thiện khóa luận này. Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên trong bộ môn Dược liệu đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài; các anh, chị trong khoa Hóa phân tích – Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo tôi trong thời gian làm thực nghiệm . Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường. Và cuối cùng là lời cảm ơn tôi gửi tới gia đình, người thân và bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Do thời gian làm thực nghiệm cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận này còn có nhiều thiếu sót. Tôi rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô, bạn bè để khóa luận được hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 3 tháng 6 năm 2013. Sinh viên TRẦN THỊ HẰNG AN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương I. TỔNG QUAN 2 1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố 2 1.1.1. Đặc điểm thực vật 2 1.1.2. Phân bố, sinh thái 3 1.1.3. Cách trồng 3 1.1.4. Thu hái và chế biến 3 1.2. Thành phần hóa học 3 1.2.1. Các diterpenoid 4 1.2.2. Các alkaloid 5 1.2.3. Các flavonoid 6 1.2.4. Các triterpenoid 7 1.2.5. Các steroid 7 1.3. Tác dụng dược lý 8 1.3.1. Tác dụng kháng ký sinh trùng sốt rét và kháng khuẩn 8 1.3.2. Tác dụng chống viêm 8 1.3.3. Tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư 8 1.3.4. Tác dụng ức chế SIRT1 9 1.3.5. Tác dụng trên tế bào tạo xương 9 1.4. Công dụng 10 1.4.1. Công dụng 10 1.4.2. Bài thuốc 10 1.5. Tiêu chuẩn định tính, định lượng dược liệu Khổ sâm cho lá trong Dược điển Việt Nam IV 11 1.5.1. Định tính 11 1.5.2. Chất chiết được trong dược liệu 12 Chương II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 13 2.1.1. Nguyên vật liệu 13 2.1.2. Hóa chất và dung môi 14 2.1.3. Thiết bị dùng trong nghiên cứu 14 2.2. Nội dung nghiên cứu 15 2.3. Phương pháp nghiên cứu 15 2.3.1. Định tính bằng phương pháp hóa học 15 2.3.2. Chiết xuất, phân lập 15 2.3.3. Xây dựng phương pháp định tính, định lượng 01 ent-kauran diterpenoid đã phân lập trong lá và cành cây Khổ sâm cho lá. 16 2.3.4. Một số đặc trưng thống kê để xử lý và đánh giá kết quả 18 Chương III. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 19 3.1. Định tính các nhóm chất bằng phản ứng hóa học 19 3.1.1. Định tính alkaloid 19 3.1.2. Định tính flavonoid 19 3.1.3. Định tính coumarin 20 3.1.4. Định tính tanin 20 3.1.5. Định tính saponin 21 3.1.6. Định tính glycosid tim 21 3.1.7. Định tính chất béo, sterol, caroten 22 3.1.8. Định tính acid hữu cơ, đường khử, polysaccarid, acid amin 23 3.2. Chiết xuất, phân lập 24 3.2.1. Chiết xuất 24 3.2.2. Phân lập 25 3.2.3. Xác định cấu trúc hóa học chất CT-1 27 3.3. Xây dựng phương pháp định tính, định lượng chất CT-1 từ lá và cành cây Khổ sâm cho lá 29 3.3.1. Xây dựng phương pháp định tính chất CT-1 bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng 29 3.3.2. Xây dựng phương pháp định tính chất CT-1 bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao 31 3.3.3. Xây dựng phương pháp định lượng chất CT-1 trong dược liệu Khổ sâm cho lá bằng sắc kí lỏng hiệu năng cao 32 3.4. Bàn luận 38 3.4.1. Định tính các nhóm chất chính 38 3.4.2. Định tính và định lượng hoạt chất CT-1 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Một số ent -kauran phân lập được từ C. tonkinensis 4 Bảng 2.1: Các mẫu nguyên liệu để định lượng 13 Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất trong lá Khổ sâm cho lá 23 Bảng 3.2: Số liệu phổ 1 H- và 13 C-NMR chất CT-1 28 Bảng 3.3: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống 33 Bảng 3.4: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính 34 Hình 3.5: Đường chuẩn và phương trình hồi quy chất CT-1 35 Bảng 3.6: Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 36 Bảng 3.7: Kết quả xác định nồng độ giới hạn LOD 36 Bảng 3.8: Kết quả định lượng hoạt chất trong một số mẫu lá và cành Khổ sâm cho lá 37 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1: Cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) 2 Hình 1.2: Cấu trúc phân tử khung ent-kaur-16-en-15-on 4 Hình 1.3: Một số diterpen phân lập được từ Khổ sâm cho lá 5 Hình 1.4: Các flavonoid phân lập từ cây Khổ sâm cho lá 7 Hình 1.5: Các steroid phân lập từ cây Khổ sâm cho lá 7 Hình 2.1: Nguyên liệu nghiên cứu lá, cành non, cành già cây Khổ sâm cho lá 13 Hình 3.1: Sơ đồ chiết và phân đoạn cao lá Khổ sâm cho lá 25 Hình 3.2: Sắc ký đồ HPLC của chất CT-1 27 Hình 3.3: Công thức cấu tạo chất CT-1 29 Hình 3.4: Sắc ký đồ chất CT-1, lá và cành cây Khổ sâm cho lá 30 Hình 3.5: Sắc ký đồ HPLC của chất CT-1 (Hình A), lá Khổ sâm cho lá (Hình B), cành Khổ sâm cho lá (Hình C) 32 Hình 3.6: Đường chuẩn và phương trình hồi quy chất CT-1 34 DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT EtOAC Ethyl acetat EtOH Ethanol MeOH Methanol Hex Hexan SKLM Sắc ký lớp mỏng R f Hệ số lưu UV Phổ tử ngoại (Ultra violet) IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) MS Phổ khối (Mass Spectroscopy) NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) TLC Sắc lớp mỏng (Thin Layer Chromatography) DĐVN Dược điển Việt Nam M Khối lượng phân tử ( Mass) LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection) LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation) RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative standard devition) HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography) RAW 264,7 Dòng tế bào bạch cầu mono của chuột bị bệnh bạch cầu (Mouse leukaemic monocyte macrophage cell line) 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của ngành dược phẩm Việt Nam, việc mua bán, trao đổi dược liệu phục vụ nhu cầu điều trị, chăm sóc sức khỏe và sản xuất chế phẩm đông dược ngày càng nhiều. Tuy nhiên, hệ thống quản lý và kiểm tra chất lượng dược liệu của nước ta còn nhiều hạn chế và chưa được các cơ quan có thẩm quyền quan tâm đứng mức. Vì vậy, việc xây dựng các tiêu chuẩn kiểm nghiệm và đưa chúng vào các tài liệu là cơ sở pháp lý của việc kiểm nghiệm như Dược điển Việt Nam là rất cần thiết. Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep.,), thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) từ lâu đã được sử dụng trong y học dân gian để chữa sốt rét, mẩn ngứa, lở loét, đau bụng đi ngoài, ăn không tiêu, chữa viêm loét dạ dày, tá tràng [1]. Những kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và thử hoạt tính sinh học của cây Khổ sâm cho lá đã khẳng định các diterpen thuộc nhóm ent-kauran có tác dụng chống ung thư và chống viêm rất mạnh [21]. Trong DĐVN IV đã có chuyên luận về dược liệu Khổ sâm cho lá. Tuy nhiên, trong chuyên luận chưa có tiêu chí về định tính, định lượng ent-kauran [3]. Vì những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học vị thuốc Khổ sâm cho lá phục vụ công tác kiểm nghiệm dược liệu trên thị trường”. Với 3 mục tiêu: - Định tính các thành phần hóa học có trong lá cây Khổ sâm cho lá. - Chiết xuất, phân lập 01 ent-kauran chính trong Khổ sâm cho lá dùng làm chất đối chiếu trong định tính, định lượng. - Xây dựng phương pháp định tính, định lượng ent-kauran phân lập được trong dược liệu Khổ sâm cho lá. [...]... PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu 2.1.1 Nguyên vật liệu Lá Cành non Cành già Hình 2.1: Nguyên liệu nghiên cứu lá, cành non, cành già cây Khổ sâm cho lá Nguyên liệu để chiết xuất và phân lập ent-kauran diterpenoid là lá cây Khổ sâm cho lá thu hái ở Hương Sơn, Mỹ Đức, Hà Nội, tháng 1 năm 2013 Mẫu dược liệu đã được TS Nguyễn Quốc Huy, Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội,... chảy [1], [19] a Lá Khổ sâm cho lá, lá Phèn đen, mỗi thứ một nắm sắc uống b Khổ sâm cho lá, Rau sam, Cỏ sữa, Cỏ nhọ nồi, lá Mơ lông, mỗi vị 10 g, sắc uống ngày 1 thang c Khổ sâm cho lá 16 g; Hương phụ 10 g; củ Sả 6 g; vỏ Quýt 6 g; Gừng khô 3 lát Sắc uống ngày 1 thang 11 1.4.2.4 Chữa viêm da thần kinh thể phong nhiệt mới mắc [1] a Khổ sâm cho lá 12 g; Sinh địa, Thổ phục linh, mỗi vị 16 g; Cúc hoa,... vật Cây Khổ sâm cho lá có tên khoa học là Croton tonkinensis Gagnep., thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) (Hình 1.1) [1], [4], [5], [7] Tên khác: Khổ sâm cho lá, Cù đèn, Co chạy đón (Thái) [1] Hình 1.1: Cây Khổ sâm cho lá (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) Khổ sâm cho lá là cây nhỏ, mọc thành bụi cao từ 1-2 m [1], [7] Lá mọc so le, gần như mọc đối 3-6 lá chụm lại thành kiểu vòng giả Lá hình... 1.1.4 Thu hái và chế biến Thu hoạch lá và ngọn non quanh năm, rửa sạch, cắt thành từng đoạn dài khoảng 1 cm đến 3 cm, phơi hoặc sấy nhẹ đến khô Khi dùng sao vàng [3] Thu hái khi cây đang có hoa, đem phơi hoặc sấy khô, khi dùng đem sao vàng [1], [4], [5], [7] 1.2 Thành phần hóa học Các nghiên cứu về thành phần hoá học của cây Khổ sâm cho lá cho biết thành phần hóa học chính của C tonkinensis là các diterpen... 1.4.2.6 Chữa vảy nến [1] Khổ sâm cho lá, Huyền sâm, Kim ngân, Sinh địa, mỗi loại 15 g; quả Ké 10 g Làm thành viên, ngày uống 20-25 g 1.5 Tiêu chuẩn định tính, định lượng dược liệu Khổ sâm cho lá trong Dược điển Việt Nam IV [3] DĐVN IV đã có riêng một chuyên luận về Khổ sâm cho lá trong đó trình bày các phần: mô tả thực vật, đặc điểm vi học (vi phẫu, soi bột), độ ẩm, tro toàn phần, tạp chất, tỉ lệ thân... Ngoài ra, Khổ sâm cho lá còn được dùng trong các phương thuốc chữa mẩn ngứa, phong hủi, vảy nến, viêm âm đạo trùng roi và sa sinh dục (sắc uống và rửa ngoài) Liều dùng hàng ngày là 1224 g, có khi tới 40 g, dạng thuốc sắc [1], [19] 1.4.2 Bài thuốc 1.4.2.1 Chữa viêm loét dạ dày, tá tràng [1], [7], [19] a Lá Khổ sâm cho lá 12 g; Lá khôi 50 g; Bồ công anh 20 g Sắc uống b Lá Khổ sâm cho lá, Bồ công anh,... ion hóa bụi electron (ESI-MS) AGILENT 1100 LC-MSD Tram Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H- và 13 C-NMR Bruker AM500-FT- NMR và sử dụng dung môi CDCl3 để hòa tan chất 2.2 Nội dung nghiên cứu - Định tính sơ bộ thành phần hóa học lá cây Khổ sâm cho lá bằng các phản ứng ống nghiệm - Phân lập, tinh chế (độ tinh khiết > 90%) và xác định công thức hóa học 01 ent-kauran diterpenoid (CT-1) chính từ lá cây Khổ. .. NADPH oxidase (NOX), một tác nhân quan trọng trong quá trình gây viêm Hai grayanan diterpenoid tách từ Khổ sâm cho lá cũng thể hiện tác dụng chống viêm khi ức chế sự hóa enzym Cyclooxygenase 2 (COX-2), tuy nhiên, cả hai chất đều có tác dụng ức chế COX-2 kém hơn chất 1 (Hình 1.3) [21], [34] Như vậy, 1 là chất có tác dụng chống viêm mạnh nhất trong dược liệu Khổ sâm cho lá 1.3.3 Tác dụng ức chế sự phát... Khổ sâm cho lá, Bồ công anh, Nhân trần, mỗi vị 12 g; Lá khôi, Chút chít, mỗi vị 10 g Tán bột, mỗi ngày uống 30 g với nước đun sôi để nguội c Lá Khổ sâm cho lá 12 g; Lá khôi 40 g; Bồ công anh 20 g; Uất kim, Hậu phác, mỗi vị 12 g; Ngải cứu 8 g; Cam thảo 4 g Sắc uống hoặc nấu cao pha siro uống 1.4.2.2 Chữa đau bụng không rõ nguyên nhân [1] Nhai mấy lá Khổ sâm cho lá tươi với muối, nếu có nôn hay sôi bụng... Cúc hoa, Kim ngân hoa, Ké đầu ngựa, mỗi vị 12 g; Đan bì 8 g Sắc uống ngày một thang b Khổ sâm cho lá 12 g ; Kinh giới, Sinh địa, mỗi vị 16 g; Phòng phong, Kim ngân, Cúc hoa, Tạo giác thích, mỗi vị 12 g; Thuyền thoái 6 g Sắc uống ngày một thang 1.4.2.5 Chữa bệnh phong hủi [19] a Khổ sâm cho lá 500 g; lá Xoan 300 g; rượu trắng 1 lít Ngâm rượu uống b Khổ sâm cho lá 600 g; Tạo giác bỏ vỏ 1000 g; Hà thủ . BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HẰNG AN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VỊ THUỐC KHỔ SÂM CHO LÁ PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU TRÊN THỊ TRƯỜNG KHÓA LUẬN TỐT. thành phần hóa học vị thuốc Khổ sâm cho lá phục vụ công tác kiểm nghiệm dược liệu trên thị trường . Với 3 mục tiêu: - Định tính các thành phần hóa học có trong lá cây Khổ sâm cho lá. - Chiết. NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ HẰNG AN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VỊ THUỐC KHỔ SÂM CHO LÁ PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU TRÊN