BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ THỊ VÂN ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC IN VITRO CỦA 5 DẪN XUẤT ARTEMISININ TRÊN CHỦNG PLASMODIUM FALCIPARUM KHÁNG CHLOROQUIN VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA DẪN XUẤT CÓ HIỆU LỰC CAO NHẤT TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGÔ THỊ VÂN ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC IN VITRO CỦA 5 DẪN XUẤT ARTEMISININ TRÊN CHỦNG PLASMODIUM FALCIPARUM KHÁNG CHLOROQUIN VÀ THỬ ĐỘC TÍNH CẤP CỦA DẪN XUẤT CÓ HIỆU LỰC CAO NHẤT TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn : 1. Ths. Lê Thị Thu Hương 2. TS. Bùi Quang Phúc Nơi thực hiện : Khoa Nghiên cứu điều trị sốt rét Viện Sốt rét – Ký sinh trùng -Côn trùng Trung ương HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Để thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới cô giáo ThS. Lê Thị Thu Hương (Bộ môn Vi sinh – Sinh học, trường Đại học Dược Hà Nội) – người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình và cho tôi những lời khuyên quý báu trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy TS. Bùi Quang Phúc (Khoa Nghiên cứu điều trị sốt rét, Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương) cùng tập thể cán bộ trong Khoa đặc biệt chị TS. Nguyễn Thị Minh Thu đã hướng dẫn tận tình, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá trình thực nghiệm và nghiên cứu hoàn thành khóa luận này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, các phòng ban và các bộ môn Trường Đại Học Dược Hà Nội đã dạy dỗ, tạo điều kiện trong 5 năm học và hoàn thành tốt khóa học. Cuối cùng, tôi xin gửi đến những người thân trong gia đình, bạn bè đặc biệt nhóm NNCC, những người đã luôn ở bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi lời cảm ơn sâu sắc trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Ngô Thị Vân MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ, SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT PLASMODIUM 3 1.1.1. Đặc điểm hình thái 3 1.1.2. Chu kỳ phát triển 4 1.1.2.1. Chu kỳ phát triển vô tính trong người 4 1.1.2.2. Chu kỳ phát triển hữu tính trong cơ thể muỗi 5 1.2. TÌNH HÌNH SỐT RÉT TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 5 1.2.1. Vài nét khái quát về bệnh sốt rét 5 1.2.2. Tình hình bệnh sốt rét trên thế giới và Việt Nam 6 1.2.2.1. Tình hình bệnh sốt rét trên thế giới 6 1.2.2.2. Tình hình bệnh sốt rét ở Việt Nam 6 1.2.3. Tình hình kháng thuốc của Plasmodium 7 1.2.3.1. Tình hình kháng thuốc của Plasmodium trên thế giới 7 1.2.3.2. Tình hình kháng thuốc của Plasmodium ở Việt Nam 8 1.3. ĐẶC ĐIỂM ARTEMISININ VÀ DẪN XUẤT 9 1.3.1. Nguồn gốc, tính chất của artemisinin và dẫn xuất 9 1.3.1.1. Nguồn gốc, cấu trúc, tính chất của artemisinin 9 1.3.1.2. Đặc điểm một số dẫn xuất của artemisinin 9 1.3.2. Cơ chế tác dụng và nhược điểm chống sốt rét của ART và dẫn xuất 10 1.3.2.1. Cơ chế tác dụng của artemisinin và dẫn xuất 10 1.3.2.2. Nhược điểm của artemisinin và dẫn xuất 11 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 5 DẪN XUẤT ARTEMISININ 32, 33, 39c, 39d, 39e 12 1.4.1. Tình hình nghiên cứu, ưu điểm của các dẫn xuất 10 – deoxoartemisinin 12 1.4.2. Cấu trúc, tính chất của 5 dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e 12 1.4.2.1. Nghiên cứu tổng hợp 10-[(2’-hydroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin (32) và 10-[(2’α-hydroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin (33) 13 1.4.2.2. Nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất amid 10-(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-3-yl) methyl) acetamide (39c), 10-(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-2-yl) methyl) acetamide (39d), 10- (deoxoartemisinin)-N-phenethylacetamide (39e) 13 1.4.2.3. Tính chất của 5 dẫn xuất 14 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 16 2.1.1. Chủng ký sinh trùng sốt rét 16 2.1.2. Động vật thí nghiệm 16 2.1.3. Thuốc và hóa chất nghiên cứu 16 2.1.4. Dụng cụ và thiết bị dùng trong nghiên cứu 17 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.3.1. Thử nghiệm in vitro của 5 dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e trên chủng P.falciparum kháng CHQ nuôi cấy 17 2.3.1.1. Nuôi cấy KSTSR P. falciparum liên tục trong phòng thí nghiệm 17 2.3.1.2. Thử nghiệm in vitro theo phương pháp thử thuốc 48 giờ 19 2.3.2. Thử nghiệm độc tính cấp của dẫn xuất có hoạt lực in vitro mạnh nhất 20 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 23 3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23 3.1.1. Thử nghiệm hiệu lực in vitro của 5 dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e 23 3.1.2. Thử nghiệm độc tính cấp của hợp chất 32 32 3.2. BÀN LUẬN 33 3.2.1. Kết quả thử hoạt lực in vitro của 5 dẫn xuất 32, 33, 39c, 39d, 39e 33 3.2.2. Kết quả nghiên cứu độc tính cấp dẫn xuất 32 – chất có hiệu lực in vitro mạnh nhất 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 KẾT LUẬN 37 KIẾN NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Tiếng việt 32 10β-[2’β-hydroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin 33 10β-[2’α-hydroxy-3’-imidazol) propyl] deoxoartemisinin 39c 10-(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-3-yl) methyl) acetamide 39d 10β-(deoxoartemisinin)-N-((pyridin-2-yl) methyl) acetamide 39e 10β-(deoxoartemisinin)-N-phenethylacetamide AE Arteether AM Artemether ART Artemisinin AS Artesunat BN Bệnh nhân BNSR Bệnh nhân sốt rét CHQ Chloroquin C M Nồng độ của các mẫu thử tính theo thể tích DHA Dihydroartemisinin DMSO Dimethyl sulfoxide ĐVTN Động vật thực nghiệm HC Hồng cầu KST Ký sinh trùng KSTSR Ký sinh trùng sốt rét MĐKST Mật độ ký sinh trùng P. falciparum Plasmodium falciparum P. vivax Plasmodium vivax RI, II, III Mức độ kháng thuốc của ký sinh trùng sốt rét SKD Sinh khả dụng SR Sốt rét TCYTTG Tổ chức y tế thế giới TLPT Trọng lượng phân tử Tiếng anh GHS Globally Harmonised Classification System for Chemical Substances and Mixtures Hệ thống phân loại độc tính cấp theo giá trị giới hạn LD 50 IC 50 Inhibitory Concentration 50% Nồng độ ức chế 50% ký sinh trùng phát triển LD50 Lethal Dose 50 Liều chết 50% động vật thí nghiệm MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ tối thiểu ức chế ký sinh trùng phát triển WHO World Health Organization Tổ chức y tế thế giới DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ Biểu đồ Tên biểu đồ Trang 3.1 Tỉ lệ ức chế chủng P. falciparum K1 của chất 32 25 3.2 Giá trị IC 50 của ART và 5 dẫn xuất trên chủng P. falciparum K1 30 3.3 Giá trị MIC của ART và 5 dẫn xuất trên chủng P. falciparum K1 31 Hình Tên hình Trang 1.1 Công thức cấu tạo của ART 9 1.2 Sự biến đổi của dẫn xuất ART trong huyết tương 11 1.3 Qui trình tổng hợp các chất 32 và 33 13 1.4 Qui trình tổng hợp các dẫn xuất amid của ART (39a-e) 14 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Đặc trưng lý – hóa cơ bản của 5 dẫn xuất 15 3.1 Mật độ KST chủng P. falciparum kháng CHQ trong 10 ngày trước khi thử thuốc 23 3.2 Sự đáp ứng của chủng P. falciparum K1 trên in vitro với chất 32 24 3.3 Sự đáp ứng của chủng P. falciparum K1 trên in vitro với chất 33 26 3.4 Sự đáp ứng của chủng P. falciparum K1 trên in vitro với chất 39c 27 3.5 Sự đáp ứng của chủng P. falciparum K1 trên in vitro với chất 39d 28 3.6 Sự đáp ứng của chủng P. falciparum K1 trên in vitro với chất 39e 29 3.7 Nồng độ ức chế 50% KST phát triển của 5 dẫn xuất ở chủng K1 29 3.8 Nồng độ ức chế tối thiểu của 5 dẫn xuất trên chủng P.falciparum K1 31 3.9 Kết quả sau 7 ngày theo dõi chuột uống chất 32 ở nồng độ khác nhau 32 3.10 Kết quả quan sát cân nặng và đại thể các cơ quan khi mổ toàn bộ cả 13 lô chuột sau 7 ngày theo dõi 33 ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Sốt rét (SR) là một bệnh lây theo đường máu, do ký sinh trùng (KST) Plasmodium được truyền từ người bệnh sang người l ành bởi muỗi thuộc giống Anopheles . [...]... từ DHA ở trên qua 2 bước để tạo thành các dẫn xuất amid theo hình 1.4 [37] Hình 1.4 Qui trình tổng hợp các dẫn xuất amid của ART (39a-e) [37] Sau khi tổng hợp 5 dẫn xuất đều được đánh giá kết quả thông qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H – NMR để xác định lại cấu trúc hợp chất [37] Vậy, tất cả dẫn xuất 32, 33, 39 (c, d, e) của ART là những hợp chất lần đầu tiên được nghiên cứu và điều chế ở Việt Nam đã... quinin đầu tiên ở Brazil và hiện đã kháng ở nhiều vùng Đông Nam Á, Nam Mỹ, Châu Phi (Tanzania) [16], [40] Năm 1949, P falciparum và P malariae kháng proguanin được phát hiện ở Brazil và sau đó lan ra Kennya, Tanzania, Chi Lê, Malaysia, Indonesia và Việt Nam (Peter, 1970) [16] Năm 1957, trường hợp đầu tiên P falciparum kháng chloroquin (CHQ) phát hiện ở biên giới Colombia và Venezuela, tiếp sau đó là Thái. .. não) và các tổ chức khác [10], [39] 1.2.2 Tình hình bệnh sốt rét trên thế giới và Việt Nam 1.2.2.1 Tình hình bệnh sốt rét trên thế giới Bệnh sốt rét có mặt, lưu hành rộng khắp ở vùng nhiệt đới, vùng cận nhiệt đới và các vùng khí hậu ôn hòa [10] Bệnh SR lan truyền ở vùng cận sa mạc Sahara, Châu Phi có mặt ở hầu hết mọi nơi, đến các khu vực riêng biệt không đồng đều như Đông Nam Á, Ấn Độ, Trung và Nam. .. chiến tranh và nhiều nguyên nhân khác nên bệnh sốt rét đã quay trở lại và ngày càng nghiêm trọng Năm 1991 Việt Nam chuyển sang chiến lược PCSR do WHO đề xướng đã có kết quả nổi trội theo đánh giá giai đoạn 2001 – 2005 bệnh nhân sốt rét (BNSR) giảm 69%, chết do sốt rét giảm 87% [2] Theo báo cáo của WHO năm 2012 tỷ lệ mắc sốt rét ở Việt Nam đã giảm trên 75%, điều này chứng tỏ bệnh SR đã được y tế và cộng... sốt rét lưu hành nặng và số ca mắc sốt rét ước tính chiếm 78% toàn cầu Việt Nam là khu vực sốt rét lưu hành nặng, đặc biệt là khu vực trung Nam bộ và đông Nam bộ Trong những năm gần đây sốt rét đang tăng lên, chỉ trong năm 2011 đã có 15,6 triệu người nhiễm ký sinh trùng sốt rét và 10% trong đó bị tử vong [41] Tình trạng xuất hiện và lan rộng ký sinh trùng sốt rét kháng thuốc đang đe dọa một số chương... trong nước của ART, được sử dụng rộng rãi ở các nước Đông Nam Á và Châu Phi để diệt ký sinh trùng sốt rét P falciparum [14] Ngoài ra, còn nhiều phương pháp tổng hợp các dẫn xuất của ART từ DHA đang được nghiên cứu hiện nay có khả năng mang lại nhiều hiệu quả cao [21] 1.3.2 Cơ chế tác dụng và nhược điểm chống sốt rét của ART và dẫn xuất 1.3.2.1 Cơ chế tác dụng của Artemisinin và dẫn xuất Qua nhiều nghiên... người và bắt đầu chu kỳ sinh sản vô tính trong người [4], [8], [15] 1.2 TÌNH HÌNH SỐT RÉT TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.2.1 Vài nét khái quát về bệnh sốt rét Bệnh sốt rét là bệnh lây nhiễm do ký sinh trùng đơn bào thuộc giống Plasmodium gây ra [10] Lâm sàng bệnh SR thường được phân ra làm hai loại là SR thể thông thường và SR ác tính Đồng thời còn có một số thể SR đặc biệt khác: SR ở trẻ em, SR ở phụ... Nhận xét: Qua bảng 3.3 nhận thấy chất 33 ở nồng độ thấp (3 và 10 nmol/L) tỉ lệ ức chế chủng K1 chỉ đạt dưới 50% (25,2% và 38%) và tăng dần lên ở nồng độ cao hơn Tuy nhiên, khi so sánh với ART thì tỉ lệ ức chế chủng K1 của chất 33 ở các nồng độ hầu hết đều thấp hơn tỉ lệ ức chế KST của ART, còn ở 2 nồng độ cao nhất (300 và 1000 nmol/L) thì tỉ lệ ức chế KST lại cao hơn Bảng 3.4 Sự đáp ứng của chủng P... Sự đáp ứng của chủng P falciparum K1 trên in vitro với chất 39e Nhận xét: Qua bảng 3.6 ta thấy ở nồng độ càng cao, tỉ lệ ức chế chủng K1 của chất 39e càng cao Tương tự chất 32, ở 2 nồng độ đầu tỉ lệ ức chế chủng K1 đều dưới 50% và tăng dần ở các nồng độ cao hơn So sánh với ART thì tỉ lệ ức chế chủng K1 của chất 39e ở hầu hết các nồng độ đều không có sự khác biệt nhiều, chỉ riêng ở nồng độ 3 và 30 nmol/L... là 282 và cấu tạo như ở hình 1.1 [3], [21], [31] Hình 1.1 Công thức cấu tạo của ART [21], [31] ART là sesquiterpen lacton có cầu nối peroxid nội phân tử và hoạt tính chống SR chủ yếu dựa vào cầu nối này [21], [31], [38] Trong công thức trên vòng A là dạng cycloxan, vòng B là vòng lacton, còn vòng C và D đều là dị vòng bão hòa trong đó vòng D là một trioxan, dạng liên quan đến hoạt tính chống SR của ART . Tình hình bệnh sốt rét ở Việt Nam 6 1.2.3. Tình hình kháng thuốc của Plasmodium 7 1.2.3.1. Tình hình kháng thuốc của Plasmodium trên thế giới 7 1.2.3.2. Tình hình kháng thuốc của Plasmodium ở Việt. muỗi 5 1.2. TÌNH HÌNH SỐT RÉT TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 5 1.2.1. Vài nét khái quát về bệnh sốt rét 5 1.2.2. Tình hình bệnh sốt rét trên thế giới và Việt Nam 6 1.2.2.1. Tình hình bệnh sốt rét. điều trị cao và không bị P. falciparum kháng. 1.2.3.2. Tình hình kháng thuốc của Plasmodium ở Việt Nam Tình trạng P. falciparum kháng CHQ lần đầu tiên tại Việt Nam được ghi nhận ở Nha Trang năm