BỘYTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI • • • • v ủ ĐÌNH CHINH TỎNG HỢP MỘT SỐ DẪN CHẤT CỦA GLUTARAMID MANG KHUNG BENZOTHIAZOL HƯỚNG ức CHẾ HISTON DEACETYLASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. Nguyễn Hải Nam 2. Ths. Đào Thị Kim Oanh Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa dược TRƯỜN'(Ì m DƯỢC HÀ NỘI T H ìS VIỆ:i%í Ngày íhána i:, năm 20Al So ĐKCB: I HÀ NỘI-2011 Lòi cảm ơn L ời đầu tiên em xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn và kính trọng sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Hải Nam, Ths. Đào Thị Kim Oanh -Bộ môn Hóa Dược - Trưòoig Đại học Dược Hà Nội. Những người đã tận tình hưóng dẫn em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn này. Thầy, GÔ đã mở ra cho em những vấn đề khoa học rất lý thú, hưóng em vào nghiên cứu các lĩnh vực hết sức thiết thực và vô cùng bổ ích, đồng thời tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập và nghiên cứu. Em cũng xin gửi lời cảm 0fn đến các thầy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của bộ môn Hóa dược, Khoa Hóa - Đại học KHTN Hà Nội, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Dược - Đại học quốc gia Chungbuk đã luôn giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp này. Nhân đây, con xin gửi lời cảm on sâu sắc đến Bố, Mẹ và những người thân trong gia đình, cảm ơn những tình cảm và những lời động viên con trong suốt quá trình hoàn thành luận văn này. Hà Nội, tháng 5/2011 VÛ Đình Chinh ĐẶT VẤN ĐÈ 1 PH ẦN 1. T Ỏ N G Q U A N 3 1.1. HISTON DEA CETYLA SE (H DA C) 3 1.1.1. Định nghĩa 4 1.1.2. Phân loại 4 1.1.2.1. Các HDAC nhóm 1 6 1.1.2.2. Các HDAC nhóm II 7 1.1.2.3. HDAC 11 8 1.1.3. HDAC và sự hình thành khối u 9 1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HD A C 10 1.2.1. Các hydroxamat 11 1.2.2. Các acid béo mạch ngắn 13 1.2.3. Các peptid vòng ; 13 1.2.4. Các benzamid 14 1.2.5. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC (HDACi) 14 PHẢN 2. NGUYÊN LIỆU, THIÉT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ . 16 2.1.1. Hóa chất 16 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ 16 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN cứ u 17 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 17 23.1. Tổng hợp hóa học . 17 2.3.2. Xác định cấu trúc 17 MỤC LỤC 2.3.3. Thử tác dụng ức chế HD AC và tác dụng kháng ung thư của 6 chất tổng họp được 18 PH Ả N 3: T H ự C N G H IỆ M , K É T QUẢ, BÀN L U Ậ N 22 3.1. HÓA H Ọ C 22 3.1.1. Tổng hợp hóa học 22 3.1.1.1. Tổng hợp dẫn chất của acid 5-(Benzo[d]thiazol-2-ylamino)-5- oxopentanoic (CHa) 22 3.1.1.2. Tổng hợp methyl 2-(5-(benzo[d]thiazol-2-ylamino)-5-oxopentan amido)acetat và dẫn chất (CHb) 27 3.1.1.3. Tổng hợp N‘-(benzo[d]thiazol-2-yl)-N^-(2-(hydroxyamino)-2- oxoethyl)glutaramid và dẫn chất (CHc) 32 3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết 37 3.1.3. Xác định cấu trúc 38 3.1.3.1. Kết quả phân tích phổ dãy chất CHa 38 3 .1.3.2. Kết quả phân tích phổ dãy chất CHb 39 3.1.3.3. Kết quả phân tích phổ dãy chất CHc 40 3.2. THỬ TÁC d ự ng ứ c c hế ENZYM HISTON DEACETYLASE 45 3.3. BÀN LU ẬN 45 3.3.1. Tổng họp hóa học 45 3.3.2. Tác dụng ức enzym histon deacetylase và đốc tính tế bào 46 4. KÉT LUẬN VÀ KIÉN NGHỊ 47 4.1. KẾT LUẬN 47 4.2. KIẾN NGHỊ 47 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ALL AML CDI CLL CTCL CTCT CTPT DCM DMF DMSO GADPH HSP90 KLPT MDS MEF2 NSCLC SAR TLC (Acute lymphoblastic leukemia) Bệnh tiền nguyên bạch cầu thể cấp (Acute myoloid leukemia) Leukima cấp thể tủy 1,1 -Carbonyldiimidazol (Chronic lymphocytic leukemia) Bệnh lympho mãn tính (Cutaneous T cell lymphoma) Té bào lympho T dưới da Công thức cấu tạo Công thức phân tử Dicloromethan N,N-dimethylformamid Dimethylsulfoxid Glyceraldehyd 3-phosphat dehydrogenase (Heat shock protein 90) Protein sốc nhiệt-90 Khối lượng phân tử (Myelodysplastic Syndromes) Hội chứng dị sinh tủy (Myocyte enhancer factor-2) Yeu tố tăng sinh tế bào cơ-2 (Non-small lung cell) Ung thư phổi tế bào không nhỏ Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng Sắc ký lớp mỏng DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 Cấu tạo nhiễm sắc thể. Trang 3 Hình 2 Cấu trúc của nucleosome. Trang 4 Hình 2 Biểu đồ mô tả các loại HDAC khác nhau. Trang 9 Hình 4 Chức năng của HDAC. Trang 10 Hình 5 depsipeptid (FK228). Trang 14 Hình 6 MS-275. Trang 14 Hình 7 HDACi điều hoà sự phát triển của tế bào. Trang 15 Hình 8 Tác dụng ức chế HDAC của các chất CHc. Trang 46 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảngl Phân loại các HDAC 5 Bảng 2 Các chât ức chê HDAC đang thử nghiệm lâm sàng 12 Bảng 3 Hiệu suât và chỉ sô hóa lý của acid 5-(benzo[d]thiazol-2- ylamino)-5-oxopentanoic và dẫn chất 26 Bảng 4 Hiệu suất và chỉ số hóa lý của methyl 2-(5-(benzo[d]thiazol- 2-ylamino)-5-oxopentanamido)acetat và dẫn chất 31 Bảng 5 Hiệu suất và chỉ số hóa lý của N^-(benzo[d]thiazol-2-yl)-N^- (2-(hydroxyamino)-2-oxoethyl)glutaramid và d/c 36 Bảng 6 Giá trị Rf và t^nc của CHa 37 Bảng 7 Giá trị Rf và t"nc của CHb và CHc 38 Bảng 8 Kêt quả phân tích phô hông ngoại của dãy chât CHa 39 Bảng 9 Kêt quả phân tích phô khôi lượng của dãy chât CHb 39 Bảng 10 Kêt quả phân tích phô hông ngoại của dãy chât CHc 40 Bảng 11 Kêt quả phân tích phô khôi lượng của dãy chât CHc 41 Bảng 12 Kết quả phân tích phổ ’H-NMR của dãy chất CHc 41 Bảng 13 Kết quả phân tích phổ ’^C-NMR của dãy chất CHc 44 Bảng 14 Độc tính trên tê bào ung thư đại tràng SW620 của các chât CHc 46 ĐẶT VẤN ĐÈ Tổ chức Y tế Thế giới ước tính hàng năm trên thế giới có khoảng 11 triệu trường hợp mới mắc ung thư. Các ung thư hàng đầu trên thế giới ở nam giới là ung thư phổi, dạ dày, đại - trực tràng, tiền liệt tuyến, gan; ở nữ giới là ung thư vú, đại - trực tràng, cổ tử cung, dạ dày và phổi [5'. Tổ chức Y tế Thế giới cũng ước tính mỗi năm có khoảng trên 6 triệu người chết do ung thư. Tỷ lệ chết do ung thư chiếm tới 12% trong số các nguyên nhân gây tử vong ở người [5]. Tỷ lệ mắc bệnh ung thư có xu hướng gia tăng ở phần lớn các nước trên thế giới. Năm 2008, qua thống kê cho thấy trên toàn cầu có khoảng 20 triệu người đang sống chung với bệnh ung thư. Neu không có các biện pháp can thiệp kịp thời thì con số này sẽ lên tới 30 triệu vào năm 2020[5’. ở các nước phát triển ung thư là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ hai sau bệnh tim mạch, ở các nước đang phát triển ung thư đứng hàng thứ ba sau bệnh nhiễm trùng/ ký sinh trùng và tim mạch[5]. Đe giảm thiểu tỉ lệ tử vong do ung thư thì việc nghiên cứu thuốc chống ung thư có vai trò quan trọng hàng đầu. Trong những năm gần đây, các chất ức chế enzym HDAC đang trở thành các tác nhân chống ung thư đầy triển vọng. Acid suberoylanilid hydroxamid(Vorinostat, Zolinza®) là chất ức chế enzym HDAC đầu tiên đã được FDA cấp phép trong điều trị u lympho tế bào T dưới da. Vorinostat là một chất ức chế HD AC có chứa nhóm chức acid hydroxamic trong phân tử. Đây là một trong số các chất được nghiên cứu phát triển từ TSA- là một chất ức chế HDAC tự nhiên cũng có chứa nhóm chức acid hydroxamic trong phân tử. Điều này cho thấy các chất ức chế HDAC có chứa nhóm chức acid hydroxamic rất có triển vọng trong điều trị ung thư. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tà i: “ Tổng hợp một số dẫn chất của glutaramid mang khung benzothiazol \ hướng ức chế histon deacetylase” Với 2 mục tiêu chính : Tổng hợp N ’-(benzo[d]thiazol-2-yl)-N^-(2-(hydroxyamino)-2-oxoethyl) glutaramid và 5 dẫn chất. Thử tác dụng ức chế enzym HDAC và độc tính tế bào ỉn vitro của các chất tổng họp được. PHÀN 1: TỎNG QUAN 1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC). Trong sinh học, các nhiễm sắc thể được cấu tạo nên từ các đơn vị cơ bản, các đơn vị đó được gọi là nucleosome (hình 1). Mỗi nuleosome được cấu tạo từ 146 cặp nucleotid quấn quanh lõi histon (hinh 2). CHROMATIN i ế \ \ nuc eosomes Hình 1; cấu tạo nhiễm sắc thể Histon là các protein kiềm mạnh có vai trò tạo thành bộ khung để phân tử ADN quấn xung quanh. Lõi của một nucleosome là một octomer hình đĩa gồm 4 cặp histone H3 và H4, H2A và H2B. Do các histon là các protein kiềm mạnh nên đầu amin của histon mang nhiều điện tích dương , điện tích dưofng ừêĩi histon tirơng tác với phần điện tích âm của nhóm phosphat frên phân tử ADN để tạo nên cấu trúc của một nucleosome, và sự mạnh yếu của liên kết này quy định quá trình biểu hiện gen. Khi histon tích điện dương lớn, tương tác này mạnh làm đóng xoắn nhiễm sắc thể gây ức chế quá trình dịch mã và tổng hợp protein, làm ức chế sự biểu hiện của gen. Ngược lại khi tương tác điện tích này yếu nhiễm sắc thể tháo xoắn, quá trình tổng hợp protein diễn ra. [...]... Sigma-Aldrich Bao gm: - Hydroxylamin hydroclorid - Anhydrid glutaric - Methylglycin hydroclorid -CDL - Cỏc 2-aminobenzothiazol gm: 2 -aminobenzothiazol 2 -amino-6 -ethoxybenzothiazol 2 -amino-6 -methylbenzothiazol 2 -amino-6-methylsulfonylbenzothiazol 2 -amino-6-nitrobenzothiazol 2 -amino-6-methoxybenzothiazol - Cỏc húa chõt v dung mụi khỏc cõn cho tụng hp: NaOH, DCM, DMF, MeOH, HCl, aceton, TEA 2.1.2 Thit...c tớnh ca gen c biu hin thụng qua cỏc tớnh trng in tớch fren histon mnh hay yu thụng quỏ trỡnh acetyl húa u amin phn uụi ca histon Acetyl húa trung hũa in tớch dng ca histon lm yu tung tỏc ca nú vi ADN trong khi ú deacetyl húa cú tỏc dng ngc li Trong t bo, enzym histon acetylase (HAT) v histon deacetylase (HDAC) l 2 enzym iu hũa quỏ trinh acetyl húa ny t ú quyt nh s biu hin ca... 1.1.3 HDAC v s hỡnh thnh khi u HAT xỳc tỏc cho phn ng acetyl húa nhúm S-NH2 trong phõn t lysin phn uụi ca histon lm hot húa quỏ trỡnh phiờn mó, trong khi ú, chc nng ca HDAC l xỳc tỏc cho phn ng deacetyl húa lysin to ra nhúm phn uụi ca histon (hỡnh 3) Nhúm ny mang in tớch dng s liờn kt vi nhúm mang in õm trờn nhim sc th gõy úng xon nhim sc th, lm gim s tip xỳc ca cỏc yu t phiờn mó vi nhim sc th gõy... H.2A -i4 i I ớ ằ' -ớ' ' M ô Wi ớ ? T f r,.A-ớuB :> -.-ôft; rs- :ớ ; Hỡnh 2: cu trỳc ca nucleosome 1.1.1 nh ngha Histon deacetylase (HDAC) l mt nhúm cỏc enzym xỳc tỏch cho quỏ inh loi b nhúm acetyl t c-N-acetyl lysin amino acid ca phn histon HDAC cú tỏc dng i lp vi histon acetyltransferase 1 1.2 phõn loi: Da trờn s tng ng v cu trỳc HDAC c chia lm 4 nhúm nh Bng 1[4,10,12,13,16,21,24]: Bng... tỏc dng c ch HDAC v tỏc dng khỏng ung th ca 6 cht tng hp c * Th tỏc dng c ch enzym histon deacetylase Tỏc dng c ch hot tớnh HDAC ca cỏc dn cht tng hp c ỏnh giỏ giỏn tip thụng qua xỏc nh mc acetyl húa histon H3,H4 trong rVSMCs Phõn tớch da trờn Western blot cú th khng nh c tỏc dng ca cỏc mu th lm tng hoc gim s acetyl húa histon H3 khi so sỏnh vi mu trng Chi tit cỏch tin hnh c da trờn phng phỏp ó c cụng... trn vi aceton vi t l 9: 1 sau ú gi -20c qua ờm Sau khi ly tõm tip, phn cn rn c ra bng ethanol 70% v lm khụ Phõn on histon tan trong acid c hũa tan trong nc Hm lng protein c xỏc nh bng phcmg phỏp BCA (Pierce), v histon c in di qua gel SDS-PAGE 15% v chuyn vo lp mng PVDF Cỏc mng c cựng histon khỏng acetyl húa H3 (Upstate Biotechnology), tip theo l Idiỏng th liờn hp peroxidase ca nga Cỏc di cú phn ng... to cỏc dung dch lm vic nng trong khong t 0,1 n IOOliM Nng DMSO cui cựng khụng vt quỏ 0,1% v mu i chng DMSO c thờm vo mt nhúm l th cú nng DMSO ỳng bng nng DMSO cỏc l cú mu th Phn lp histon v Western Blot: Cỏc histon c phõn lp bng phng phỏp chit acid T bo (khong 5x10^) trong mi l ca a th c thờm vo mt th tớch nht nh mu th ó pha loóng t dung dch gc bng mụi trng DMEM khụng cú huyt thanh nh chun b... dóy cỏc cht CHa trờn Cht tham gia õy l 2 -aminobenzothiazol - Kt qu: sn phm thu c l bt mu trng Hiu sut phn ng: 82,1 % Cm quan tan: Khụng tan trong nc núng, lnh D tan trong DCM, aceton b Tng hp acid 5-(6-methylbenzo[d]thazol-2-ylamino)-5-oxopentanoic (CH2a) - Tin hnh: Nh tin hnh chung tng hp dóy cỏc cht CHa trờn Cht tham gia õy l 2 -amino-6-methylbenzothiazol - Ket qu: thu c sn phm kt tinh mu trng... trờn Cht tham gia õy l 2 -amino-6 -methoxybenzothiazol - Kt qu: thu c sn phm kt tinh mu trng Hiu sut phn ng: 78,2% Cm quan tan: Khụng tan trong nc núng lnh ớt tan trong aceton, tan tt trong DCM d Tng hp acỡd 5-(6-eihoxybenzo[d]thiazol-2-ylamỡno)-5-oxopentanoic (CH4a) - Tin hnh: Nh tin hnh chung tng hp dóy cỏc cht CHa trờn Cht tham gia õy l 2 -amino-6 -ethoxybenzothiazol - Kt qu: sn phm thu c l bt... trờn Cht tham gia õy l 2 -amino-6-(methylsulfonyl )benzothiazol - Kt qu: thu c sn phm kt tinh mu trng Hiu sut phn ng: 65,3 % Cm quan tan: Khụng tan trong nc núng lnh D tan trong DCM, aceton f Tng hp acid 5-(6-ntrobenzo[dJthiazo-2-ylamino)-5-oxopenớanoic (CH6a) 24 - Tin hnh; Nh tin hnh chung tng hp dóy cỏc cht CHa trờn Cht tham gia õy l 2-amino-6-nitrobenzothiazol Nhng khụng x lý hn hp sau phn ng bng . • • • • v ủ ĐÌNH CHINH TỎNG HỢP MỘT SỐ DẪN CHẤT CỦA GLUTARAMID MANG KHUNG BENZOTHIAZOL HƯỚNG ức CHẾ HISTON DEACETYLASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. Nguyễn Hải Nam 2 các chất ức chế HDAC có chứa nhóm chức acid hydroxamic rất có triển vọng trong điều trị ung thư. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tà i: “ Tổng hợp một số dẫn chất của glutaramid mang khung benzothiazol. một chất ức chế HD AC có chứa nhóm chức acid hydroxamic trong phân tử. Đây là một trong số các chất được nghiên cứu phát triển từ TSA- là một chất ức chế HDAC tự nhiên cũng có chứa nhóm chức