Bộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược - HÀ NỘI _ _____ ***** _____ _ HOÀNG NGUYÊN THÙY NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH CHIẾT TÁCH (±) GOSSYPOL TỪ HẠT CÂY BÔNG GOSSYPIUM HỈRSUTUM KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Dược SỸ Người hướng dẫn; 1. TSTĐào Thanh Hiền 2. TS. Nguyễn Văn Tài Nơi thực hiện: 1. Bộ môn Dược học cổ truyền 2. Khoa Hóa thực vật - Viện Dược liệu Thời gian thực hiện : 10/2010 - 05/2011 HÀ NỘI-2011 t r iíủ n í; đh d u ík: hà nôi T H Ư V IỆ Ì^ẳ Nqày .,A ínáng 0: năm 2Q.A-Ĩ So ĐKCB:. . . J LỜI CẢM ƠN Trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp, với sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, tôi đã hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp của mình. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới: TS. Đào Thanh Hiền - Giảng viên - Bộ môn Dược học cổ truyền, Trường ĐH Dược Hà Nội. TS. Nguyễn Văn Tài - Phó khoa - Khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu. TS. Nguyễn Thế Hùng - Giảng viên - Bộ môn Dược học cổ truyền, Trường ĐH Dược Hà Nội. Là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm khóa luận. Tiếp theo, tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị trong Khoa Hóa thực vật, Viện Dược liệu đã luôn quan tâm, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới các thầy cô giáo trong trường, tới gia đình và bạn bè đã luôn ở bên động viên, giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống. Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên khóa luận của tôi không thể tránh khỏi những thiếu sót. Tôi rất mong có được sự góp ý báu của các thầy cô và các bạn sinh viên. Hà Nội, tháng 5 năm 2011 Sinh viên Hoàng Nguyên Thùy MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. Sự tồn tại của gossypol trong hạt của cây bông Gossypium hirsutum 3 1.2. Tính chất vật lý, hóa học của gossypol 3 1.3. Tác dụng dược lý của gossypol 5 1.3.1. Tác dụng chống ung thư 5 1.3.2. Tác dụng tránh thai nam 8 1.3.3. Tác dụng khác 9 1.4. Một số qui trình chiết tách gossypol 10 1.4.1. Phương pháp 1 10 1.4.2. Phương pháp 2 11 1.4.3. Phương pháp 3 12 1.4.4. Phương pháp 4 13 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 16 2.1. Vật liệu nghiên cứu 16 2.1.1. Nguyên liệu và hóa chất 16 2.1.2. Máy móc và dụng cụ 16 2.2. Nội dung nghiên cứu 17 2.3. Phương pháp nghiên cứu 17 2.3.1. Phương pháp chiết xuất và tinh chế gossypol 17 2.3.1.1. Phương pháp chiết xuất 17 2.3.1.2. Phương pháp tinh chế gossypol 18 2.3.2. Phương pháp kiểm tra cấu trúc và xác định hàm lượng G-AA có trong sản phẩm tách được 18 2.3.2.1. Định tính sự có mặt của gossypol bằng phương pháp sắc ký lóp mỏng 18 2.3.2.2. Phương pháp quang phổ tử ngoại (UV- VIS) 19 2.3.2.3. Nhận dạng gossypol tách được 19 2.3.2.4. Định lượng gossypol có trong sản phẩm thu được 19 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THựC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 21 3.1. Kết quả thực nghiệm 21 3.1.1. Chuẩn bị nguyên liệu 21 3.1.2. Chiết gossypol racemic 21 3.1.3. Kết tinh gossypol acid acetic 23 3.1.4. Kiểm tra cấu trúc chất tách được 25 3.1.5. Xác định độ tinh khiết của sản phẩm thu được 26 3.1.6 . Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng trong qui trình chiết xuất 28 3.1.6.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ hỗn hợp dung môi aceton/nước.28 3.1.6.2 Khảo sát ảnh hưởng của lượng dung môi chiết 30 3.1.6.3. Khảo sát ảnh hưởng của loại acid dùng thủy phân 32 3.1.6.4. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid H3PO4 dùng thủy phân33 3.1.7. Tóm lại 35 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XƯÁT 38 CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẶN VĂN DCM: Dichlo methan DEE: Diethyl ether EtOH: Ethanol G-AA: Gossypol acid acetic IR: Phổ hồng ngoại MEK: Methyl ethyl keton SKLM: Sắc kí lóp mỏng DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Trang Bảng 3.1 : Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ acetone/ nước 29 Bảng 3.2- Khảo sát ảnh hưởng của lượng dung môi chiết 31 Bảng 3.3- Khảo sát ảnh hưởng của loại acid dùng thủy phân 32 Bảng 3.4- Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid và thời gian thủy phân 34 DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ sơ ĐÒ TRONG LUẬN VÃN Trang Hình L l: Gossypol và các dạng đông phân quang học Hình 3.1: SKLM của cao chiết so sánh với gossypol đổi chiếu (l):Gossypol đổi chiếu; (2): Cao chiết Hình 3.2: SKLM của sản phẩm chiết tách được so sánh với gossypol đổi chiếu ' 25 (1). Gossypol đổi chiểu; (3): G-AA thu được Hình 3.3: Phổ u v của sản phẩm G-AA thu được Hình 3.4: Đường chuẩn G-AA bằng phương pháp u v Hình 3.5: SKLM của sản phẩm chiết được mẻ lớn so sánh với gossypol đẻi chiếu (1). Gossypol đổi chiếu; (4). G-AA thu được Sơ đồ 3.1: Chỉêt xuất và tinh chế G-AA 26 27 37 23 - 1 - ĐẶT VẤN ĐÈ Ung thư là một trong những căn bệnh gây tử vong hàng đầu hiện nay trên thế giới. Theo thống kê của Bộ Y tế, ước tính mỗi năm ở nước ta có khoảng 150.000 bệnh nhân ung thư mới mắc và 75.000 người tử vong do ung thư. Con số này có xu hướng ngày càng gia tăng [43]. Phưong pháp chủ yếu điều trị ung thư là dùng các liệu pháp hoá trị, xạ trị. Tuy nhiên, hóa trị và xạ trị lại làm suy giảm miễn dịch và ảnh hưởng đến các tế bào bình thưòng khác làm cho sức khỏe bệnh nhân dần dần kiệt quệ. Hiện nay, hướng đi mới trong điều trị ung thư là các thuốc điều trị ung thư theo hướng đích, không chỉ cho hiệu quả hơn các thuốc hóa trị truyền thống mà còn ít gây độc với các tế bào bình thường. Trong liệu pháp mới này có thể kể đến các kháng thể đon dòng, các chất chống tạo mạch máu mới nuôi khối u, các chất chống proteasome, các chất ức chế Bcl-2 (họ protein gây cái chết theo chưong trình của tế bào) như genasense, gossypol Gossypol là một hợp chất polyphenol có nhiều trong hạt của các loài thuộc chi Gossypỉum, họ Bông {Malvaceae). Gossypol được chứng minh là có nhiều tác dụng sinh học, trong đó tác dụng gây độc tế bào của nó đã được biết đến từ lâu [13]. Tuy nhiên, gần đây, các nhà khoa học mới phát hiện gossypol có tác dụng ức chế các protein anti-apoptosis thuộc họ Bcl-2. Từ đó, gossypol được kì vọng trở thành một thuốc chống ung thư theo hướng đích mới. ở Việt Nam, bông vải là loại cây công nghiệp được trồng phổ biến để lấy xơ, diện tích ước tính đạt 8.500 ha. Đây là một nguồn nguyên liệu sẵn có và vô cùng phong phú cho việc sản xuất gossypol. Điều này mở ra hy vọng Việt Nam có thể tự sản xuất được một loại thuốc điều trị ung thư bắt kịp xu hướng điều trị mới với giá thành rẻ, phù hợp với khả năng kinh tế của người dân. - 2 - Từ năm 1997 đến nay, ở nước ta đã có 2 tác giả nghiên cứu về chiết xuất và tinh chế gossypol. Tuy nhiên phương pháp mà 2 tác giả này đưa ra còn có nhiều nhược điểm, hiệu suất chưa cao và qui trình chưa phù hợp để áp dụng vào sản xuất qui mô lớn. Xuất phát từ thực tế nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “NGHIÊN CÚXJ QUI TRÌNH CHIÉT TÁCH (±) GOSSYPOL TỪ HẠT CÂY BÔNG GOSSYPIUMHIRSUTUM' Mục tiêu của đề tài: - Nghiên cứu phương pháp chiết xuất và tinh chế (±) gossypol từ hạt cây bông Gossypỉum hirsutum. - Khảo sát một số điều kiện trong qui trình chiết xuất, từ đó tìm ra qui trình có hiệu suất cao, góp phần áp dụng vào qui mô sản xuất lớn. - 3 - CHƯOÍNG 1. TỎNG QUAN 1.1. Sự tồn tại của gossypol trong hạt của cây bông Gossypium hirsutum Gossypol là một hơp chất polyphenol màu vàng, được chiết xuất từ cây bông {Gossypỉum sp.) và 1 loài cây nhiệt đới Thepesia populnea, đều thuộc họ bông Malvaceae [21, 24'. Gossypol tồn tại trong nhiều bộ phận của cây như vỏ rễ, lá, hoa, vỏ hạt Hạt bông chứa 16-24% protein và 13-24% dầu trong tổng khối lượng nhân hạt. Ngoài ra còn có các flavonoid và các chất mầu mà chủ yếu là gossypol. Trong hạt bông, gossypol tồn tại chủ yếu trong các tuyến chất màu bên trong nhân, chiếm 90% lượng sắc tố trong các tuyến, và thưÒTig chiếm khoảng 0,4- 1,7% khối lượng của nhân hạt [18]. ở Việt Nam có 5 loài thuộc chi Bông (Gossypium) là G. hirsutum, G. barbadense, G. arboreum, G. herbaceum và G. acuminatum [1]. Trong đó, G. hỉrsutum là một loài phổ biến. Cùng với các hợp chất sesquiterpen trong tuyến sắc tổ, chức năng tự nhiên của gossypol là một chất trừ sâu (kháng khuẩn) thiên nhiên giúp cây trồng kháng lại các mầm bệnh và côn trùng. 1.2. Tính chất vật lý, hóa học của gossypol Gossypol được phân lập lần đầu tiên năm 1886 dưới dạng hỗn hợp với các sắc tố, acid béo và phospholipid trong suốt quá trình tinh chế dầu hạt bông. Đến năm 1938, cấu trúc của gossypol mới được suy luận dựa vào các tính chất vật lý và hóa học của nó. Tên gọi “gossypol” được dùng để ám chỉ xuất xứ từ cây bông và là một hợp chất phenol thiên nhiên, cấu trúc hóa học đã được chứng minh bởi Eward, người đã tổng hợp ra phân tử và chứng minh được nó có cấu trúc là l,r,6,6',7,7'-hexahydroxy-5,5'-diisopropyl-3,3'- dimethyl-2 ,2 '-binaphthalen-8 ,8 '-dicarboxaldehyd [10]. cấu tạo của gossypol [...]... nghiền cứu - Nghiên cứu qui trình chiết tách gossypol từ hạt cây bông Gossypỉum hirsutum - Kiểm tra cấu trúc chất tách được - Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến qui trình chiết tách 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp chiết xuất và tỉnh ch gossypol 2.3.1.1 Phương pháp chiết xuất Từ ưu nhược điểm của các phương pháp đã trình bày ở trên, chúng tôi chọn phương pháp chiết gossypol từ hạt bông. .. thấp (0,32%) Do đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu dựa trên phương pháp 2 của Michael Dowd và cộng sự, vói mục đích đưa ra được qui trình chiết tách gossypol có hiệu suất cao hơn và có thể áp dụng vào qui mô lớn hơn - 16 - CHƯƠNG 2: ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu và hóa chất Nguyên liệu: Hạt của cây bông Gossypỉum hirsutum giống D I6-2 và VN 36-P đã được... ảnh hưởng trong qui trình chiết xuất Nghiên cứu của của Michael Dowd và cộng sự cho thấy các yếu tố trong quá trình chiết tách như nồng độ acid dùng thủy phân nguyên liệu, lượng dung môi đều ảnh hưởng đến hàm lượng G-AA trong sản phẩm và hiệu suất của quá trình Vì vậy, chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát một số yểu tố ảnh hưởng đến qui trình đã được chọn, từ đó từng bước hoàn thiện để qui trình đạt hiệu... liệu đã nghiên cứu chiết tách gossypol dựa trên phương pháp 4 của tác giả Lê Thị Xoan Gossypol tách được đã được khẳng định cấu trúc bằng các phương pháp: đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối, phổ tử ngoại, phổ hồng ngoại Quá trình nghiên cứu cho thấy phương pháp của tác giả Lê Thị Xoan tuy đơn giản nhưng mất nhiều thời gian, và chỉ phù hơp với qui mô phòng thí nghiệm, không thể áp dụng vào các qui. .. điểm; phương pháp chiết và kết tinh đơn giản Sản phẩm kết tinh là G-AA là dẫn chất được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu về tác dụng dược lý của gossypol Hơn nữa G-AA còn được chứng minh là bền hon gossypol - Nhược điểm của phương pháp là tác giả không đưa ra hiệu suất của qui trình Hơn nữa qui trình đi từ vỏ rễ của cây bông, đây là nguyên liệu không sẵn có do phải phá bỏ cả cây mới lấy được 1.4.2... liệu: Gôm hạt bông (cottonseed gum), hoặc soapstock: đây đều là những sản phẩm phụ trong quá trình sản xuất dầu hạt bông, chứa gossypol dưới dạng liên kết với một số chất khác như phospholipid, protein trong nhân hạt bông Phương pháp: Phương pháp của Dowd và cộng sự [27] Thủy phân gossypol dưới dạng liên kết bằng acid thích hơp, sau đó dùng một dung môi hữu cơ tách lấy gossypol tự do, ly tâm để tách riêng... G-AA, là chất được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu về tác dụng dược lý của gossypol Quá trình chiết gossypol toàn phần cũng như kết tinh tạo G-AA yêu cầu ít thời gian (khoảng 30 giờ đến 48 giờ), tránh được sự tác động của nhiệt độ cao và ánh sáng nên giảm thiểu được sự oxy hóa gossypol 1.4.3 Phương pháp 3: Nguyên liệu: Nhân hạt của cây bông Gossypium hirsutum, giống 43-04 - 13 - Phương pháp: Sử... đổi nhóm hydroxyl phenolic của gossypol thì hoạt tính chống oxy hóa của các dẫn xuất bị giảm, chứng tỏ rằng các nhóm hydroxyl đóng vai trò quyết định trong tác dụng chống oxy hóa của gossypol [40] 1.4 Một số qui trình chiết tách gossypol L4.1 Phương pháp 1: Nguyên liệu: vỏ rễ của cây bông Gossypỉum barbadense Phương pháp: Chiết gossypol toàn phần bằng dung môi aceton, dịch chiết đem kết tinh trong hệ... dưới áp suất giảm thu được cao chiết Nghiên cứu này cũng tiến hành khảo sát một số yếu tố có thể ảnh hưởng trong quá trình chiết gossypol toàn phần ra khỏi nguyên liệu như: loại acid dùng để thủy phân, nồng độ acid, tỉ lệ aceton : nước trong hỗn hợp dung môi, lượng dung môi dùng để chiết 2.3.1.2 Phương pháp tinh chế gossypol Kết tinh gossypol từ cao chiết thành dạng gossypol- acid acetic (G-AA) bằng dung... Phương pháp như sau: Hạt bông G hirsutum (giống D I26) sau khi đã cán loại xơ bông được phơi khô, xay nhỏ và phân tách nhân ra khỏi lớp vỏ bên ngoài Bột nhân thu được sau đó đem xác định độ ẩm Bảo quản bột nhân hạt bông trong tủ lạnh ở nhiệt độ 8 °C- lOV cho đến khi sử dụng 'rRUỒNiỈĐ'-! 'n7 ) ỉ I 'V H o ,1 - 18 - Bột nhân hạt bông được ngâm với dung dịch acid thích hợp để thủy phân gossypol ra khỏi dạng . đề tài: - Nghiên cứu phương pháp chiết xuất và tinh chế (±) gossypol từ hạt cây bông Gossypỉum hirsutum. - Khảo sát một số điều kiện trong qui trình chiết xuất, từ đó tìm ra qui trình có hiệu. qui trình chưa phù hợp để áp dụng vào sản xuất qui mô lớn. Xuất phát từ thực tế nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “NGHIÊN CÚXJ QUI TRÌNH CHIÉT TÁCH (±) GOSSYPOL TỪ HẠT CÂY BÔNG GOSSYPIUMHIRSUTUM' Mục. YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược - HÀ NỘI _ _____ ***** _____ _ HOÀNG NGUYÊN THÙY NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH CHIẾT TÁCH (±) GOSSYPOL TỪ HẠT CÂY BÔNG GOSSYPIUM HỈRSUTUM KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Dược SỸ Người hướng dẫn; 1.