B ộ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC D ư ợ c HÀ NỘI TRẦN TIẾN DŨNG NHÂN GIỐNG CÂY HOA TIÊN ASARUM GLABRUM MERR. BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI C Y MÔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ ĐẠI HỌC KHÓA Người hướng dẫn: ThS. Tạ Như Thục Anh ThS. Vũ Vân Anh Noi thực hiện - Trung tâm Nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội. - Xã Ba Vì huyện Ba Vì tỉnh Hà Tây - Bộ môn Thực Vật trường Đại học Dược Hà Nội Thòi gian thực hiện: 5/2006 - 6/2007 HÀ NỘI THÁNG 6 NĂM 2007 je Ờ 3 ^& À M C ffH íỊuéi Ir h tít Ihtửí hiên, khứéi Luúết nàụ. lò i đã- nhăềL đượe, ẳư ạivLfL đ õ tậễt tìn h e¿UL íhàụ. eA a à luỊềv bề Çîèi æUt ụjửi Lài eảnv ờềi tm»v thjcmh, tth u l lâ i: ^CL Q lh u ÇîhjiJLe, cÂnh, (ĩ)ũ (J)â»t cÂnlt 0 ’S Çît^oit (Vaut Ớit Ệiítững. ihầụ. cồ^ ¿ tí ehi ílẫiv, ụiÚỊL đ s tò i tậết tÌẾth trí^iĩự. ữiệe. hứàếv (hành khécL luâềt noMj^ <ĩ)cL iÂi eủnạ, tưứv ih ă n h eản t ổềt lở i íờàiL bẠ lậ ệ t ikỀ eáềt lĩẠ (Bậ mồềt ÇîhUa ( V ậ t Ç îr U ô n jg . <®ạ/ h jß ^ H )ư ổ e , 'J ô à , Q l ệ i ữ ă < J ) k ồ n jg . ỆUA&i e ẩ ụ . ÇÎÊ^ung. iá jf t Q íạ h iỀ ễ t cứu Çîmnjg. ÚỈL & i ¿ biến, eojf ihuếe. 'Jôci Qlậi đ ã giúp. đs^f ÌẨỊLỠ đ iều k ỉỉề t eỉu^ ỉ ỗ i kjúà*t th à n h k húă Luậềt iứuậ. 'Tỗà QỉỈẬi^ nụàụ. 15 ihánụ. 4 nủm 2 00 7 S in h (VỉỀiL ^rầjn. Çîæin. n^ăềvg. DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Chữ viết đầy đủ AA-I Acid Aristolochic I a-NAA a-Naphtylacetic acid BAP Benzylaminopurin BTTN Bảo tồn thiên nhiên ĐHST Điều hoà sinh trưởng K Kinetin MS Môi trường Murashige & Knoog VQG Vườn quốc gia MỤC LỤC PHẦN 1: TỔNG QUAN 5 1.1. Cây Hoa tiên . 5 1.1.1. Chi Asamm L. 1753 . 5 1.1.2. Đặc điểm thực vật của Hoa tiên (Asarum glabrum Merr) 5 1.1.3. Thành phần hóa học của Hoa tiên 6 1.1.5. Công dụng 8 1.2. VQG Ba Vi và cộng đồng người Dao ở khu vực VQG Ba V ì 8 1.2.1. Vị trí địa lý, điều kiện tự nhiên 8 1.2.2. Cộng đồng người Dao ở khu vực VQG Ba V ì 9 1.3. Bảo tồn tài nguyên cây thuốc 10 1.3.1. Giá trị của tài nguyên cây thuốc . 10 1.3.2. Hiện trạng bảo tồn tài nguyên cây thuốc 11 1.3.4. Các phương pháp bảo tồn tài nguyên cây thuốc 12 1.4. Các phương pháp nhân giống cây trồng và phương pháp nhân giống nuôi cấy mô (nhân giống In vitro) 14 1.4.1. Nhân giống hữu tính 14 1.4.2 Nhân giống vô tính 15 1.4.3. Nhân giống nuôi cấy mô ị nhân giống In vitro) 17 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 24 2.1. Nguyên vật liệu 24 2.2. Phương pháp nghiên cứu 24 2.2.1 Điều tra tình hình thu hái, chế hiến, mua bán, sử dụng Hoa tiên 24 2.2.2. Nuôi cấy In vitro 24 PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỂ 3 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 28 3.1 Kết quả điều tra tình hình sử dụng, thu hái, chế biến và mua bán cây Hoa tiên trong (Ả. glabrum Merr.) cộng đồng người Dao ở Ba Vì. 28 3.2 Nghiên cứu nhân giống In vitro 32 3.2.1 Nghiên cứu chế độ khử trùng mẫu 32 3.2.2 Ảnh hưởng của BAP và Kinetin tôi tỷ lệ hình thành chồi và hệ số nhân chồi.34 3.2.3 Ảnh hưởng của các tổ hợp BAP và a-NAA tới sự tái sinh chồi và hệ số nhân chồi 37 3,2.4. Ảnh hưởng của a-NAA tới sự ra rễ 40 3.2.5 Nghỉên cứu đưa cây ra đất 42 3.3 BÀN LUẬN 45 3.3.1 Điều tra tình hình thu hái, mua bán, sử dụng Hoa tiên trong cộng đồng người Dao ở khu vự VQG Ba Vì 45 3.3.2 Nhân giống nuôi cấy mô 46 KẾT LUẬN 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 49 Bộ CÂU HỎI PHỎNG VẤN ĐlỂU TRA TÌNH HÌNH 53 PHỤ LỤC 2: CÔNG THỨC MÔI TRƯỜNG MS 55 PHIẾU GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC 57 GIÂY CHỨNG NHẬN Mà s ố TIÊU BẢN 58 Việt Nam là một nước có nguồn tài nguyên thực vật hết sức đa dạng và phong phú, được đánh giá là một trong 16 trung tâm đa dạng sinh học bậc nhất trên thế giói [4]. Nguồn tài nguyên này đã và đang góp phần tích cực trong việc phát triển kinh tế và chăm sóc sức khoẻ ban đầu cho nhân dân nofi mà điều kiện kinh tế còn gặp nhiều khó khăn. Song, do chịu áp lực của điều kiện kinh tế còn nhiều khó khăn, nhận thức của nhân dân còn chưa đầy đủ thêm vào đó là sự yếu kém trong khâu quản lý nguồn tài nguyên cây thuốc nên tód việc khai thác ồ ạt, thiếu sự kiểm soát đã làm cho nguồn tài nguyên này bị suy giảm nhanh chóng, một số loài cây thuốc quý có nguy cơ biến mất hoàn toàn. Vậy làm sao để khai thác hçfp lý và bền vững là một thách thức không nhỏ. Hoa tiên (Asamm glabrum Merr. hay A. maximum Hemsl.) là một trong các loài cây thuốc quý được sử dụng rộng rãi trong Y học dân tộc Việt Nam cũng như trong một số cộng đồng dân tộc thiểu số ở phía Bắc nước ta. Hoa tiên cũng đang bị xếp vào một trong các loài có nguy cơ tuyệt chủng (cấp độ E) trong danh mục sách Đỏ Việt Nam phần thực vật [12]. Loài này là một trong 7 loài cây thuốc bị ngưòi Dao ở Ba Vì khai thác và sử dụng nhiều nhất để làm thuốc bổ, tăng cường sinh lực cho nên giá trị kinh tế của loài này là khá cao đã làm cho số lượng loài này bị suy giảm một cách mạnh mẽ [20],[21]. Hơn nữa khả năng tái sinh tự nhiên của Hoa tiên là rất thấp. Các nghiên cứu nhân giống Hoa tiên sử dụng các phưoĩig pháp như giâm hom, tái sinh bằng thân rễ đều không thành công do hệ số nhân thấp và gặp phải vấn đề lớn về nguồn nguyên liệu phục vụ cho nghiên cứu [20]. Những điều này dẫn đến nguy cơ Hoa tiên biến mất hẳn khỏi khu vực VQG Ba Vì. Chính vì vậy, chúng tôi chọn thực hiện đề tài "'Nhân giống cây Hoa tiên (Asarum glabrum Merr.) bằng phương pháp nuôi cấy wô” vói mục tiêu đóng góp thêm 1 phương pháp nhân giống Hoa tiên để có thể tìm ra giải pháp bảo tồn và phát triển bền vững loài cây này. PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỂ Nội dung của khoá luận bao gồm 2 phần: + Điều tra tình hình khai thác, mua bán, sử dụng Hoa tiên của cộng đồng người Dao khu vực VQG Ba Vì Hà Tây. + Nghiên cứu nhân giống Hoa tiên bằng phương pháp nuôi cấy mô. 1.1. Cây Hoa tiên 1.1.1. Chi Asarum L. 1753 Trên thế giói, hiện có khoảng 90 loài thuộc chi Asarum L. tập trung chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á, một vài loài ở khu vực Bắc Mỹ, một loài đặc hữu của châu Âu, 39 loài ở Trung Quốc trong đó có 34 loài đặc hữu [26]. Việt Nam có tất cả 7 loài thuộc chi Asarum L. [11],[15],[23]. 1.1.2. Đặc điểm thực vật của Hoa tiên (Asarum glabrum Merr) Cây Hoa tiên (Ạsarum glabrum Merr.) thuộc họ Aristolochiaceae (Họ Mộc hưofng) còn gọi là Trầu tiên, Dầu tiên, Trà tiên, Pền Phvả (Ba Vì), Phiu Hỏa Mia’(Sa Pa). Cây cỏ, sống lâu năm, cao 20-30 cm. Thân rễ mảnh, chia nhiều đốt ngắn, mỗi đốt thường ngắn hơn 1 cm. Lá thưòỉng có từ 1-2 lá, hình tim dài 8-12cm, rộng 4-7 cm. Cuống lá dài 10-18 cm. Phiến lá nguyên, 2 mặt nhẩn, đầu lá nhọn, gốc lá hình khiên, mặt trên màu lục sáng, mặt dưói màu lục nhạt, 7 gân tỏa từ gốc lá, Hoa mọc đơn độc ở đầu ngọn, có cuống dài 2-3 cm. Lá bắc dài, hẹp và nhọn. Bao hoa màu xám nâu hoặc tím đậm, trên bao hoa có những vạch sọc xanh, tún xen kẽ, bao hoa hình ống, chia 3 thùy hình tim,. Nhị 12 đều nhau, bao phấn dài hơn chỉ nhị. Nhụy tập hçfp thành cột dày, ngắn hơn bao phấn [1],[12],[15],[26]. Quả được bao bọc bỏi bao hoa tồn tại. Hạt nhỏ màu tun, hoặc nâu đen bóng. Mùa ra hoa, quả từ tháng 3-6. Phân bố: mọc dọc theo các khe đá, bờ suối có độ cao từ 700m-1500m thuộc địa bàn các tỉnh Lào Cai (Sa Pa), Quảng Ninh (Yên Tử), Hà Giang (Mèo Vạc), Hà Tây (Ba Vì), w PHẦN 1 : TỔNG QUAN Hình 1: Cây Hoa tiên 1.1.3. Thành phần hóa học của Hoa tiên Trong chi Asarum, hầu hết tất cả các loài đều chứa tinh dầu, hàm lượng thay đổi từ 1-3% và là hỗn hợp của rất nhiều thành phần trong đó hầu hết đều có chứa methyl eugenol, safrole, [1],[2],[14],[22],[36],[41],[42]. Hiện chưa có nghiên cứu nào đầy đủ và về thành phần hóa học của cây Hoa tiên. Một số nghiên cứu sơ bộ cho thấy trong thân và thân rễ Hoa tiên có chứa 1%- 3% là tinh dầu, tỷ lệ này thay đổi theo mùa và noi thu hái [1],[2],[14]. Trong một vài nghiên cứu gần đây cho thấy, trong lá Hoa tiên cũng có chứa tinh dầu tinh dầu. Thành phần chủ yếu của tinh dầu bao gồm: methyl eugenol, safrole, và một số thành phần khác. Trong lá và hoa có chứa nhiều sắc tố anthocyanosid, khi ngâm vói rượu cho màu xanh đậm (lá) và màu hồng tươi hoặc hồng tím (hoa) [1],[2],[14],[22]. Một số loài khác trong chi Asarum đã được nghiên cứu tương đối đầy đủ về thành phần hóa học. Phân tích thành phần hóa học trong lá và rễ Asarum forbeii Maxim, bằng phương pháp sắc kí khí, Feng Zhang và cộng sự cho kết quả thành phần tinh dầu ngoài methyl eugenol và asarone, còn có chứa a-asarone, methyl isoeugenol. Tinh dầu lá có chứa 20 hợp chất hữu cơ trong đó methyl isoeugenol chiếm 33,3%, a-asarone chiếm 19,3%- Trong lá có chứa 17 hợp chất trong đó a- asarone chiếm 58,8% và methyl eugenol 10,3% [41]. Theo kết quả nghiên cứu Zhang sx và cộng sự khi tiến hành phân tích bằng phưoỉng pháp sắc kí dịch chiết methanol của A. longer hizomatosum tách được 5 hợp chất là: Asarone, 2,4,5-trimethoxybenzaldehyde, ß-sitosterol, 4(2,4,5 trimethoxyphenyl)-3-en-butylone và 3-ß-hydroxylstigmast-en-7-one [42]. Theo từ điển bách khoa dược học thì trong thân và rễ của loài Tế tân A. heterotropoides Fr.Schmidit chứa 2,75% tinh dầu chủ yếu là pinen, methyl eugenol, một số hợp chất ceton, 1 chất có nhóm chức phenol có T„c =110”c, acid hữu cơ và chất nhựa [22]. Loài Tế tân A. sieboldii fMiq.) F. Maekawa chứa 2,75% tinh dầu trong đó có 1,8-cineol, asaricin, methyl eugenol, croweacin, a-pinen, ß-pinen, a-thuyen, myrcen, terpinen -4-ol, a- terpineol, safrole, myristicin [1]. Theo kết quả nghiên cứu được đưa ra bỏd Rostogi và Mehrotra thì thành phẩn hóa học của loài A. europaenum L. có chứa a asarone, triacylglycerid [36]. Rất nhiều loài trong chi Asarum tìm thấy có sự xuất hiện của Acid aristolochic một chất độc với thận và có khả năng gây ung thư đã được cơ quan Quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (FDA) khuyến cáo không nên sử dụng [25]. Acid aristolochic I (AA-I) được tìm thấy không chỉ có trong các cây thuộc chi Asarum mà còn tìm thấy trong nhiều cây thuộc các chi như Arìstolochia spp. , Bragantia spp., Stephanỉa spp., Clematis spp., Akebia spp., Cocculus spp., Diploclisia spp., Menispernum spp., Sinomenium spp. [25],[37]. Các cây trong chi Asarum có hàm lượng AA-I khác nhau và thay đổi khá nhiều giữa các loài khác nhau. Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng 9 loài thuộc chi này đã được nghiên cứu có hàm lượng AA-I từ 3,3ng/mg (A. sieboldii) đến 3376,9 ng/mg(A. crispulatum ) [25],[29]. 1.1.4. Tác dụng dược lý a. Tác dung gây tê cuc bổ Dịch chiết bằng cồn của Hoa tiên trên tiêu bản thần kinh cơ đùi ếch có tác dụng phong bế dẫn truyền các xung thần kinh. Khi bôi dạng cồn thuốc nên lưỡi sau [...]... các phương pháp [4],[8],[20],[27],[34],[35] 1.4 Các phương pháp nhân giống cây trồng và phương pháp nhân giống nuôi cấy mô (nhân giống In vitro) Nhân giống cây trồng là quá trình tạo ra và phát triển cá thể mới Các cá thể này dùng để thiết lập nên mùa vụ mới Có 2 phương pháp nhân giống chính đó là: nhân giống hữu tính (sexual) dùng hạt và phuofng pháp nhân giống vô tính hay còn gọi là phưofng pháp nhân. .. floribunda khi nhân bằng củ đạt 8-10 cây/ năm, của Cam thảo là 5-7 của Bạc hà Mentha arvensis là 6-7 + Việc sử dụng chính bộ phận làm thuốc đé nhân giống gây lãng phí và tốn kém 16 1.4.3 Nhân giống nuôi cấy mô ị nhân giống In vitro) Là phương pháp nuôi cấy mô, tế bào trong môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng để tái sinh thành cây non Nhân giống In vitro là một trong các phương pháp bổ... 1.4,2 Nhân giống vô tính - Là khái niệm sử dụng khả năng tái sinh của các cơ quan sinh dưỡng khác nhau như cành, thân, rễ, mô, tế bào, w Nhân giống vô tính bao gồm nhân giống truyền thống ( giâm, chiết, ghép) và nhân giống In vitro (nuôi cấy mô tế bào, nuôi cấy tế bào,w ) 15 Nhân giống truvền thống bao gồm: Chiết: là phưong pháp tạo cá thể mới, thường là trên thân cây, trước khi tách khỏi cây mẹ... hành khử trùng mẫu cấy bằng các hoá chất diệt vi khuẩn và vi nấm - Tác nhân khử trùng mẫu (hoá chất khử trùng mẫu) phải được lựa chọn dựa trên các yếu tố như mức độ nhiễm khuẩn và độ mẫn cảm của mẫu cấy đối vói hoá chất khử trùng 3 Xác định điều kiện nuôi cấy Xác định điều kiện nuôi cấy (môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng) để điều khiển quá trình phát triển của mô nuôi cây theo định hướng... điểm chính của phương pháp nhân giống In vitro là đòi hỏi phải có trang thiết bị đắt tiền, kỹ thuật tiến hành khá phức tạp, yêu cầu kỹ thuật nghiêm ngặt, chỉ có những người được trang bị kỹ thuật tốt và phải có kinh nghiệm mới có thể tiến hành nhân giống In vitro Giá thành nhân giống cây có thể cao hofn so với các phương pháp nhân giống khác - Mặc dù thu được hệ số nhân rất lớn nhưng cây con thu được... hàng nghìn loài cây đã được nhân giống In vitro thành công, hàng trăm loài cây đã trở thành sản phẩm thương mại có giá trị như lan Hồ điệp Cymbidium, các giống hoa Tulip,w Trong suốt khoảng thòi gian từ đầu thế kỷ 20 đến trước năm 1962 thì phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật không đạt được nhiều thành tựu đáng kể Nhưng đến năm 1962 khi môi trường nuôi cấy MS (Murashige & Knoog) ra đòd đã mở ra... hướng nghiên cứu 4 Xác định môi trường nuôi cấy Cho đến nay có rất nhiều các loại môi trường khác nhau như Murashige và Skoog (196 2), môi trưòtig Linsmainer và Skoog (196 3), môi trưòíng Gamborg (196 8), môi trường Knop (197 4), w đây là các môi trường cơ bản và được cải tiến cho phù hợp với các đối tương nghiên cứu khác nhau Trong đó môi trường MS (Murashige và Skoog 196 2) được đánh giá là phù hợp với... mục đích nuôi cấy Khả năng thành công của mẫu nuôi cấy phụ thuộc vào trạng thái sinh lý và độ tuổi của mẫu nghiên cứu Tế bào phôi là lựa chọn hàng đầu sau đó đến đỉnh sinh trưởng như đỉnh ngọn, đầu rẽ sau đó đến tế bào nghỉ (chồi nách) - Nhân nhanh chồi: Đây là giai đoạn đánh giá tính ưu việt của phương pháp vi nhân giống quyết định tói hệ số nhân của chồi và của cả quá trinh vi nhân giống Môi trường... các phương pháp bổ sung cho các kỹ thuật nhân giống truyền thống và có nhiều ưu điểm nổi bật, có thể khắc phục được những hạn chế của các phương pháp truyền thống a Cơ sở lý luân của phương pháp nuối cây mồ Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào In vitro dựa trên học thuyết về tính toàn năng của tế bào Theo Haberlandt G 1902 thì “Tất cả các tế bào của cây đều mang toàn bộ lượng thông tin di... phí thấp • Nhược điểm: + Nhân giống gặp khó khăn rất lớn đối vói các loài cây lâu cho ra hoa, quả Ví dụ Sơn thù, Đỗ trọng {Ẹ ulmoides Oliv .) là cây thuốc quý nhập nội về trổng ở Sa Pa, phải mất 10 năm cây mói có khả năng cho hạt Bộ phận làm thuốc của Sofn thù là quả khi còn trẻ cây chỉ cho hoa đực vì vậy không có quả Đỗ trọng là cây đcfn tính cùng gốc nên khi nhân giống Đỗ trọng bằng hạt không những lâu . nhân giống cây trồng và phương pháp nhân giống nuôi cấy mô (nhân giống In vitro) 14 1.4.1. Nhân giống hữu tính 14 1.4.2 Nhân giống vô tính 15 1.4.3. Nhân giống nuôi cấy mô ị nhân giống In vitro). hiện giữa các phương pháp [4],[8],[20],[27],[34],[35]. 1.4. Các phương pháp nhân giống cây trồng và phương pháp nhân giống nuôi cấy mô (nhân giống In vitro). Nhân giống cây trồng là quá trình. Hoa tiên (Asarum glabrum Merr) Cây Hoa tiên (Ạsarum glabrum Merr. ) thuộc họ Aristolochiaceae (Họ Mộc hưofng) còn gọi là Trầu tiên, Dầu tiên, Trà tiên, Pền Phvả (Ba V ), Phiu Hỏa Mia’(Sa Pa). Cây