BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - ĐÀO QUANG TÙNG TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA N-HYDROXY-4-(3-HYDROXYIMINO-2OXO-1-INDOLINYL)METHYLCINNAMAMID VÀ MỘT SỐ DẪN CHẤT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - ĐÀO QUANG TÙNG TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA N-HYDROXY-4-(3-HYDROXYIMINO-2OXO-1-INDOLINYL)METHYLCINNAMAMID VÀ MỘT SỐ DẪN CHẤT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: DS Đỗ Thị Mai Dung Nơi thực hiện: Bộ mơn Hóa Dược HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực đề tài với nhiều nỗ lực cố gắng, thời điểm hồn thành khố luận lúc tơi xin phép bày tỏ lòng biết ơn chân thành với người dạy dỗ, hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian qua Trước hết với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tơi xin bày tỏ lời cám ơn chân thành đến GS.TS Nguyễn Hải Nam - Trưởng mơn Hóa Dược DS Đỗ Thị Mai Dung - Bộ mơn Hố Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy trực tiếp hướng dẫn tận tình bảo tơi thời gian thực khố luận Tơi xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo, cô giáo anh chị kỹ thuật viên Bộ mơn Hố Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hoá Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, Khoa Dược - Đại học Quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc tạo điều kiện thuận lợi cho thực khố luận tốt nghiệp Cuối cùng, tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình bạn bè ln động viên khích lệ tơi suốt trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2015 Sinh viên Đào Quang Tùng MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 HISTON DEACETYLASE (HDAC) 1.1.1 Khái niệm histon deacetylase 1.1.2 Phân loại HDAC 1.1.3 Mối liên quan ung thư hoạt động bất thường HDAC 1.2 CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC 1.2.1 Phân loại chất ức chế HDAC 1.2.2 Cấu trúc chất ức chế HDAC 1.3 MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRÊN THẾ GIỚI 10 1.3.1 Liên quan cấu trúc tác dụng acid hydroxamic ức chế HDAC 10 1.3.2 Một số hướng thiết kế nghiên cứu tổng hợp giới 11 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 17 2.1.1 Hóa chất 17 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 17 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18 2.2.1 Tổng hợp hóa học 18 2.2.2 Thử tác dụng sinh học chất tổng hợp 18 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.3.1 Tổng hợp hóa học 18 2.3.2 Thử tác dụng sinh học 19 2.3.3 Đánh giá mức độ giống thuốc cuả chất tổng hợp 22 2.3.4 Nghiên cứu Docking 22 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KÊT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 HÓA HỌC 23 3.1.1 Tổng hợp hóa học 23 3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết 30 3.1.3 Xác định cấu trúc 31 3.2 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 37 3.2.1 Thử hoạt tính sinh học 37 3.2.2 Đánh giá mức độ giống thuốc 39 3.2.3 Sơ đánh giá khả tương tác với HDAC (docking) 41 3.3 BÀN LUẬN 40 3.3.1 Tổng hợp hóa học 41 3.3.2 Tác dụng sinh học 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ, CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT AML : Bệnh ung thư bạch cầu dạng tuỷ cấp tính AsPC-1 : Dòng tế bào ung thư tuyến tuỵ 13 : C-NMR Phổ cộng hưởng từ carbon (carbon nuclear magnetic resonance) CTCL : U tế bào lympho T da (Cutaneous T cell lymphoma) DCM : Dicloromethan DHFR : Dihydrofolat reductase DMF : Dimethylformamid DMSO : Dimethyl sulfoxid HAT : Histon acetyltransferase HDAC : Histon deacetylase : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (proton nuclear magnetic H-NMR resonance) IC50 : Nồng độ ức chế hoạt độ tế bào giảm xuống nửa IR : Phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy) MeOH : Methanol MS : Phổ khối lượng NSCLC : Ung thư phổi tế bào tế bào không nhỏ (non-small lung cell) NST : Nhiễm sắc thể PC-3 : Dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt SAHA : Acid sulberoylanillid hydroxamic SRB : Sulforhodamin B SW620 : Dòng tế bào ung thư đại tràng TLC : Phương pháp sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography) Tonc : Nhiệt độ nóng chảy TSA : Trichosatin A DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Bảng 1.1: Các chất ức chế HDAC thử nghiệm lâm sàng 16 Bảng 3.1: Chỉ số lý hóa hiệu suất tổng hợp acid hydroxamic từ ester 13 Bảng 1.4: Cấu trúc tác dụng ức chế HDAC DHFR dẫn chất acid hydroxamic khung acid folic (IC50, µM) 12 Bảng 1.3: Hoạt tính số acid hydroxamic mang khung 3-oximisatin Bảng 1.2: Một số acid hydroxamic mang khung benzimidazol Trang 29 Bảng 3.2: Giá trị Rf nhiệt độ nóng chảy (tonc) cuả chất 3a-d 30 Bảng 3.3: Kết phân tích phổ IR chất 3a-d 31 Bảng 3.4: Kết phân tích phổ MS chất 3a-d 33 Bảng 3.5: Kết phân tích phổ 1H-NMR chất 3a-d 34 10 Bảng 3.6: Kết phân tích phổ 13C-NMR chất 3a-d 36 12 Bảng 3.7: Kết thử tác dụng ức chế HDAC chất 3a-d 13 Bảng 3.8: Kết thử hoạt tính kháng tế bào ung thư 14 38 Bảng 3.9: Đánh giá mức độ giống thuốc chất 3a-d theo quy tắc Lipinsky 39 11 Bảng 3.10: Kết docking chất 3a-d với HDAC2 41 15 Bảng 3.11: So sánh hoạt tính kháng tế bào ung thư 3a-d IIIa,d,f 44 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1: Cấu trúc lõi histon với vị trí ε-N acetyl lysin mạch nhánh 2 Hình 1.2: Vai trị cân động HDAC HAT 3 Hình 1.3: Mô tả đặc điểm loại HDAC “kinh điển” 4 Hình 1.4: Các chất ức chế HDAC nồng độ ức chế HDAC Hình 1.5: Liên kết SAHA trung tâm hoạt động HDAC 10 Hình 1.6: Cấu trúc số dẫn chất N-hydroxy-3-phenyl-2propenamid 14 Hình 3.1: Đánh giá mức độ ức chế HDAC theo phương pháp Western blot 38 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ STT Tên sơ đồ Trang Sơ đồ 3.1: Quy trình tổng hợp chung 23 Sơ đồ 3.2: Sơ đồ tổng hợp chất 2a 23 Sơ đồ 3.3: Sơ đồ tổng hợp chất 3a 24 Sơ đồ 3.4: Sơ đồ tổng hợp chất 2b 26 Sơ đồ 3.5: Sơ đồ tổng hợp chất 3b 26 Sơ đồ 3.6: Sơ đồ tổng hợp chất 2c 27 Sơ đồ 3.7: Sơ đồ tổng hợp chất 3c 28 Sơ đồ 3.8: Sơ đồ tổng hợp chất 2d 28 Sơ đồ 3.9: Sơ đồ tổng hợp chất 3d 29 ĐẶT VẤN ĐỀ Acid suberoylanilid hydroxamic (Zolinza®, 2006) chất ức chế histon deacetylase Cục quản lý thực phẩm dược phẩm Mỹ (USFDA) phê duyệt điều trị u lympho da tế bào T Sau đó, năm 2009 depsipeptid (Romidepsin®) chất ức chế HDAC khác FDA cấp phép điều trị ung thư Mỹ Như thấy, HDAC mục tiêu phân tử quan trọng điều trị ung thư chất ức chế HDAC tác nhân chống ung thư đầy triển vọng Nhóm nghiên cứu mơn Hóa Dược - Đại học Dược Hà Nội thiết kế, tổng hợp công bố nhiều dãy chất với định hướng ức chế HDAC có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt [1,2,4] Các nghiên cứu gần mơn acid hydroxamic có tác dụng ức chế HDAC cho thấy thiết kế nhóm nhận diện bề mặt của acid hydroxamic hướng ức chế HDAC vịng thơm 3-hydroxyimino-2-oxoindolin cho hoạt tính in vitro khả quan [4] Hơn nữa, số nghiên cứu cho thấy việc thay đổi cầu nối mạch thẳng acid hydroxamic cầu nối có chứa nhân thơm mang lại hoạt tính kháng tế bào ung thư cao đồng thời tạo hợp chất có xu hướng ức chế chọn lọc HDAC [9] Trên sở nghiên cứu trên, thiết kế dẫn chất acid hydroxamic mang khung 3-hydroxyimino-2-oxoindolin với cầu nối 3-phenyl-2-propenamid tiến hành đề tài “Tổng hợp thử tác dụng sinh học N-hydroxy-4-(3-hydroxyimino-2-oxo-1- indolinyl)methylcinnamamid số dẫn chất” với hai mục tiêu: Tổng hợp N-hydroxy-4-(3-hydroxyimino-2-oxo-1-indolinyl)methyl cinnamamid dẫn chất Thử tác dụng ức chế HDAC độc tính tế bào chất tổng hợp CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 HISTON DEACETYLASE (HDAC) Quá trình dịch mã tế bào eukaryota bị ảnh hưởng trạng thái xoắn ADN [36] Ở tế bào pha nghỉ, ADN trạng thái đóng xoắn để ngăn tiếp cận yếu tố dịch mã ADN gắn vào chromatin, phức hợp protein - ADN có cấu trúc động tính tổ chức cao Đơn vị cấu trúc chromatin nucleosom, gồm octamer hình đĩa bốn lõi histon (1 tetramer H3/H4 dimer H2A/H2B) bao quanh 146 cặp ADN [36,38] (hình 1.1): Hình 1.1: Cấu trúc lõi histon với vị trí ε-N acetyl lysin mạch nhánh Sự có mặt phân tử lysin bị acetyl hóa histon dẫn đến việc xuất nhiều chromatin dạng tháo xoắn kích hoạt q trình dịch mã gen, deacetyl hóa phần lysin tạo nhiều chromatin trạng thái đóng xoắn hạn chế q trình dịch mã gen Q trình deactyl hóa histon làm tăng tương tác ion đầu amin tích điện dương histon nhóm phosphat mang điện âm ADN khiến cho chromatin trạng thái đóng xoắn làm ức chế trình dịch mã gen tổng hợp protein Mức độ acetyl hóa histon kết cân hoạt động hai enzym HO N O H3C N O NH OH Phụ lục 10: Phổ 1H-NMR chất 3b (mở rộng) HO N H3C O O N O NH OH Phụ lục 11: Phổ 1H-NMR chất 3c HO N H3C O O N O NH OH Phụ lục 11: Phổ 1H-NMR chất 3c (mở rộng) HO N O Br N O NH OH Phụ lục 12: Phổ 1H-NMR chất 3d HO N O Br N O NH OH Phụ lục 12: Phổ 1H-NMR chất 3d (mở rộng) HO N O N O NH OH Phụ lục 13: Phổ 13C-NMR chất 3a HO N O N O NH OH Phụ lục 13: Phổ 13C-NMR chất 3a (mở rộng) HO N O H3C N O NH OH Phụ lục 14: Phổ 13C-NMR chất 3b HO N O H3C N O NH OH Phụ lục 14: Phổ 13C-NMR chất 3b (mở rộng) HO N H3C O O N O NH OH Phụ lục 15: Phổ 13C-NMR chất 3c HO N H3C O O N O NH OH Phụ lục 15: Phổ 13C-NMR chất 3c (mở rộng) HO N O Br N O NH OH Phụ lục 16: Phổ 13C-NMR chất 3d HO N O Br N O NH OH Phụ lục 16: Phổ 13C-NMR chất 3d (mở rộng) Phụ lục 17: Kết thử hoạt tính sinh học chất 3a-d ... 14 3 , 41 2 (C4”); 1 42 ,6 04 (C3); 13 7,7 91 (C4’); 13 7,6 12 (C1’); 1 34, 15 0 (C8”); 13 1, 922 (C6”); 12 7 ,883 (C2’,6’); 12 7 ,8 12 (C3’,5’); 12 6 , 910 (C7”); 11 9 ,2 14 (C2); 11 5 , 41 4 (C5”); 10 9,5 51 (C9”); 42 ,368 (C1”)... -N- hydroxy- 4- (3- hydroxyimino- 2- oxo- 1- indolinyl )methylcinnamamid (3a) -N- hydroxy- 4( 3 -hydroxyimino- 5-methyl- 2oxo- 1indolinyl )methylcinnamamid (3b) -N- hydroxy- 4( 3hydroxyimino- 5methoxy- 2oxo- 1indolinyl )methylcinnamamid (3c) -N- hydroxy- 4( 5-bromo-3 -hydroxyimino- 2- oxo- 1indolinyl )methylcinnamamid. .. 17 2. 1. 1 Hóa chất 17 2. 1 .2 Thiết bị, dụng cụ 17 2. 2 N? ??I DUNG NGHI? ?N CỨU 18 2. 2 .1 Tổng hợp hóa học 18 2. 2 .2 Thử tác dụng sinh học chất tổng hợp 18 2. 3