BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGỌ THỊ THU PHƯƠNG XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CEFADROXIL VÀ CEFOTAXIM TRONG NƯỚC BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGỌ THỊ THU PHƯƠNG XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CEFADROXIL VÀ CEFOTAXIM TRONG NƯỚC BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: DS: Lê Xuân Kỳ DS: Dương Thị Vân Nơi thực hiện: Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài, em đã nhận được sự giúp đỡ, tạo điều kiện của các thầy cô giáo, các anh chị trong Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia, Bộ môn Vật lý – Hóa Lý, Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất – Trường Đại học Dược Hà Nội, cùng bạn bè và gia đình. Sự giúp đỡ quý giá đó là động lực giúp em có thể hoàn thành tốt khóa luận của mình. Trước tiên, em xin chân thành cảm ơn DS. Lê Xuân Kỳ, người đã tận tình hướng dẫn, đóng góp ý kiến quý báu và tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài này. Em xin chân thành cảm ơn DS. Dương Thị Vân, DS. Nguyễn Thị Hạnh đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ và hỗ trợ em hoàn thành khóa luận. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, người đã tận tình chỉ bảo, đóng góp ý kiến quý báu cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài và viết khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn Hóa phân tích và Độc chất, Bộ môn Vật lý – Hóa lý – Trường Đại học Dược Hà Nội, Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài. Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình và bạn bè đã luôn chia sẻ, động viên em hoàn thành khóa luận. Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2015 Sinh viên Ngọ Thị Thu Phương MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Công thức cấu tạo chung của các kháng sinh β- lactam 2 1.1.1. Kháng sinh Penicillin 2 1.1.2. Kháng sinh Cephalosporin 2 1.2. Tổng quan về các đối tượng nghiên cứu 3 1.2.1. Cefotaxim natri 3 1.2.2. Cefadroxil monohydrat 4 1.3. Tổng quan về phương pháp nghiên cứu 6 1.3.1. Chiết pha rắn (SPE - solid phase extraction) 6 1.3.2. Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng khối phổ: 7 1.4. Một số nghiên cứu về dư lượng thuốc kháng sinh có trong nước ở Việt Nam và trên thế giới 14 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. Đối tượng và phương tiện nghiên cứu 16 2.1.1. Hoá chất - chất chuẩn 16 2.1.2. Máy móc - trang thiết bị 16 2.1.3. Đối tượng nghiên cứu 17 2.2. Phương pháp nghiên cứu 17 2.2.1. Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng kháng sinh trong nước thải bằng LC - MS/MS 17 2.2.2. Thẩm định quy trình phân tích đã xây dựng 18 2.3. Phương pháp xử lý số liệu 20 Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21 3.1. Xây dựng điều kiện phân tích các chất bằng LC-MS/MS 21 3.1.1. Khảo sát các điều kiện khối phổ 21 3.1.2. Khảo sát các điều kiện sắc ký lỏng hiệu nâng cao 24 3.2. Thẩm định phương pháp 32 3.2.1. Độ thích hợp hệ thống 32 3.2.2. Độ đặc hiệu của phương pháp 33 3.2.3. Độ tuyến tính, đường chuẩn 35 3.2.4. Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 36 3.2.5. Độ đúng, độ chính xác của phương pháp 38 3.3. Bàn luận 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu ACN C18 ESI HPLC IS LC - MS/MS LOD LOQ MeOH MS R(%) RSD SD SPE S pic t R Tiếng Anh Acetonitril Octadecyl carbon chain Electrospray ionization High perform liquid chromatography Internal standard High perform liquid chromatography – Tandem Mass Spectrometry Limit of Detection Limit of Quantitation Methanol Mass Spectrometry Recovery Relative Standard Deviation Standard Deviation Dispersive Solid Phase Extraction Area under the peak Retention time Tiếng Việt Acetontril Gốc octadecyl Ion hóa bằng phun sương điện Sắc ký lỏng hiệu nâng cao Chuẩn nội Sắc ký lỏng ghép khối phổ hai lần Giới hạn phát hiện Giới hạn định lượng Methanol Khối phổ Hiệu suất thu hồi Độ lệch chuẩn tương đối Độ lệch chuẩn Chiết pha rắn Diện tích pic Thời gian lưu DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Các nguyên liệu nghiên cứu 16 Bảng 3.1. Điều kiện phân mảnh của các kháng sinh 21 Bảng 3.2. Kết quả lựa chọn ion mẹ 23 Bảng 3.3. Các hệ pha động đã khảo sát 26 Bảng 3.4. Điều kiện chạy sắc ký lỏng khối phổ 31 Bảng 3.5. Bảng khảo sát độ thích hợp hệ thống 32 Bảng 3.6. Nồng độ dung dịch chuẩn gốc 35 Bảng 3.7. Khảo sát độ tuyến tính của dung dịch chất phân tích 35 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 39 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Công thức chung của Penicillin [10] 2 Hình 1.2. Công thức chung của Cephalosporin [10] 2 Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của Cefotaxim natri [5] 3 Hình 1.4. Cấu trúc phân tử Cefadroxil monohydrate [5] 5 Hình 1.5. Cấu tạo thiết bị khối phổ 9 Hình 3.1. Phổ khối của Cefotaxim ở điều kiện định lượng (Fragmentor:130V, CE:17V) 22 Hình 3.2. Phổ khối của Cefadroxil ở điều kiện định lượng (Fragmentor:130V, CE:13V) 22 Hình 3.3. Phổ khối của Trimethoprim 13C3 ở điều kiện đã chọn (Fragmentor:154V, CE:21V) 22 Hình 3.4. Sắc ký đồ pha động 1 25 Hình 3.5. Sắc ký đồ pha động 2 25 Hình 3.6. Sắc ký đồ pha động 3 26 Hình 3.7. Sắc ký đồ tại tốc độ dòng 0,2 ml/phút 27 Hình 3.8. Sắc ký đồ tại tốc độ dòng 0,3 ml/phút 28 Hình 3.9. Sắc ký đồ tại tốc độ dòng 0,5 ml/phút 28 Hình 3.10. Thể tích tiêm 1 µl 29 Hình 3.11. Thể tích tiêm 3 µl 30 Hình 3.12. Thể tích tiêm 5 µl 30 Hình 3.13. Sắc ký đồ mẫu trắng 33 Hình 3.14. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn 34 Hình 3.15. Sắc ký đồ dung dịch thêm chuẩn 34 Hình 3.16. Đường chuẩn dung dịch Cefotaxim và Cefadroxil 36 Hình 3.17. Sắc ký đồ tại giới hạn phát hiện của Cefotaxim 37 Hình 3.18. Sắc ký đồ tại giới hạn định lượng của Cefadroxil 37 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Kháng kháng sinh luôn là vấn đề được nhiều người quan tâm và cũng là thực trạng mà xã hội hiện nay đang phải đối mặt. Trong khi các kháng sinh mới ra đời ngày càng ít, thì việc kháng các kháng sinh phổ rộng, tác dụng mạnh như quinolon, các cephalosporin thế hệ mới ngày càng phổ biến và đe dọa sức khỏe con người. Một trong những nguyên nhân gây ra tình trạng kháng kháng sinh là sự tồn dư của kháng sinh và các chất chuyển hóa của chúng trong môi trường. Vì chỉ một lượng rất nhỏ kháng sinh có mặt trong môi trường sống cũng giúp vi khuẩn sinh ra những gen kháng thuốc. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng sự tồn tại của các kháng sinh và sự kháng kháng sinh trong môi trường nước đã trở nên phổ biến [7], [20], [30]. Cùng với việc kiểm soát sử dụng kháng sinh hợp lý, vấn đề kiểm soát nồng độ kháng sinh thải ra môi trường tại các cơ sở sản xuất dược phẩm cũng cần được quan tâm. Kháng sinh nhóm β-lactam là nhóm kháng sinh rất đa dạng và có phổ kháng khuẩn rộng. Hiện nay, nhiều nhà máy, xí nghiệp dược đang sản xuất nhóm kháng sinh này với các dạng bào chế khác nhau. Tuy nhiên, việc kiểm soát sự tồn dư kháng sinh nhóm β-lactam trong nước thải ở các cơ sở sản xuất này vẫn chưa được quan tâm đúng mức. Tới thời điểm hiện nay, ở Việt Nam mới có một số nghiên cứu xác định dư lượng một số kháng sinh trong nước thải bệnh viện và nước thải từ cơ sở sản xuất dược. [4], [11], [14]. Phương pháp xác định dư lượng kháng sinh hay sử dụng là HPLC với detector khác nhau như UV-VIS, FLD, nhưng dùng nhiều nhất là LC-MS/MS. Để có thể ứng dụng phân tích mẫu thực, phương pháp phân tích cần được xây dựng và thẩm định. Do đó chúng tôi tiến hành bước đầu đề tài: “Xây dựng phương pháp xác định Cefadroxil và Cefotaxim trong nước bằng sắc ký lỏng khối phổ” với các mục tiêu: 1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện phân tích (điều kiện sắc ký, điều kiện MS) để xác định Cefotaxim và Cefadroxil trong nước bằng LC-MS/MS. 2. Thẩm định phương pháp định lượng Cefotaxim và Cefadroxil trong nước. [...]... khó xây dựng được quy trình chiết tối ưu, lượng dung môi đã giảm nhiều nhưng hãy còn lớn, giá thành của phương pháp còn cao 1.3.2 Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng khối phổ: [12], [16] Sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) là kỹ thuật phân tích chất dựa trên sự kết nối giữa sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC) và phân tích khối phổ (MS) Về cơ bản, có 8 thể coi sắc ký lỏng khối phổ là phương pháp sắc ký lỏng. .. sinh của Trần Quang Hải: "Nghiên cứu xác định hàm lượng một số chất hữu cơ trong dược phẩm và nước tiểu bằng phương pháp vonampe" đã nghiên cứu thành công phương pháp chiết pha rắn (SPE) sử dụng cột chiết HLB xử lý nước tiểu xác định Ofloxacin và Cefadroxil bằng phương pháp von-ampe xung vi phân và phương pháp von-ampe hòa tan hấp phụ [8] 1.3 1.3.1 Tổng quan về phương pháp nghiên cứu Chiết pha rắn (SPE... 5ml H2O + 5ml H2O pH 2 - Thể tích mẫu: 100 ml nước thải đã được acid hóa đến pH 2 18 - Dung môi rửa giải: 1 ml hỗn hợp dung môi MeOH : H2O (1:1) 2.2.1.3 Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng cefadroxil và cefotaxim trong nước bằng phương pháp LC - MS/MS Xây dựng quy trình phân tích sao cho có thể sử dụng định lượng đồng thời Cefadroxil và Cefotaxim trong mẫu thử nghiên cứu Tiến hành khảo sát theo... lượng 03 kháng sinh: Cefixim, Cefuroxim và Cephalexin trong nước thải Đề tài sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ và phương pháp chiết pha rắn Giới hạn phát hiện của các kháng sinh từ 0,58 – 1,22 ng/ml Phương pháp đã được sử dụng để phân tích các kháng sinh này trong mẫu nước thải nhà máy sản xuất dược [16] - Nghiên cứu của Vishal Diwan và cộng sự (2010) đã xây dựng và đánh giá dư lượng của 7 kháng sinh:... phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 235 nm Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút Thể tích tiêm: 10 ml - Nghiên cứu của Từ Bình Minh và cộng sự (2009) đã xây dựng phương pháp và đánh giá dư lượng của 4 nhóm kháng sinh, trong đó gồm 3 kháng sinh β-lactam: Amoxicilin, Cephalexin và Cefotaxim Nghiên cứu đã xử lý mẫu bằng kỹ thuật chiết pha rắn và xác định dư lượng kháng sinh bằng LC - MS/MS Nhóm tác giả đã xây dựng được phương. .. điều kiện sắc ký khác như: cột Agilent SB - C18 (2,1 mm × 50 mm; 1,8µm), thể tích tiêm mẫu 3 µl (nhiệt độ cột: 25oC), tốc độ dòng 0,3 ml/phút Pha động A: HCOOH 0,1% trong H2O Pha động B: HCOOH 0,1% trong ACN Kết quả sắc ký đồ thu được như sau: 25 Cefotaxim Cefadroxil IS Hình 3.4 Sắc ký đồ pha động 1 Cefotaxim Cefadroxil IS Hình 3.5 Sắc ký đồ pha động 2 26 Cefotaxim Cefadroxil IS Hình 3.6 Sắc ký đồ pha... hóa của thiết bị khối phổ Trong sắc ký lỏng khối phổ, bộ phận nạp mẫu chính là đầu ra của cột sắc ký Có hai phương pháp nạp mẫu chính, tuỳ thuộc vào trạng thái vật lý của chất cần phân tích - Nạp mẫu trực tiếp : Với mẫu lỏng, mẫu được đưa vào buồng trung gian (áp suất giảm) trước khi vào buông chân không của máy Có thể tách phần hơi của mẫu trắng bằng một màng bán thấm đưa thẳng vào buồng ion hóa Dôi... 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Xây dựng phương pháp xác định hàm lượng kháng sinh trong nước thải bằng LC - MS/MS 2.2.1.1 Phương pháp thu thập, xử lý mẫu thô trước khi tiến hành chiết tách - Lấy nước thải từ nhà máy sản xuất kháng sinh trong giai đoạn nhà máy không sản xuất kháng sinh - Xử lý mẫu thô: lọc qua giấy lọc, màng lọc thủy tinh, màng lọc 0,45µm, acid hóa đến pH 2 bằng HCl 10%, loại tạp bằng. .. bệnh viện bằng HPLC với detector huỳnh quang Điều kiện sắc ký: cột C16, nhiệt độ cột 50ºC, tốc độ dòng 0,7ml/phút, bước sóng kích thích 278nm và bước sóng phát xạ 445nm Hiệu suất thu hồi trong nền nước thải đạt từ 80 đến 106% và giới hạn phát hiện trong khoảng 0,5 đến 1,0 µg/L [4] - Luận văn thạc sĩ Dược học của Trần Thị Thanh Huế (2013) đã xây dựng phương pháp xác định dư lượng Cefixim có trong nước thải... Amikacin, Ofloxacin, Ciprofloxacin, Norfloxacin và Levofloxacin trong nước thải tại một bệnh viện ở Ấn Độ Nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn và phương pháp HPLC-MS/MS Kết quả đã xây dựng được phương pháp với LOD từ 0,01 đến 2,5 ng/ml tùy thuộc vào kháng sinh Phương pháp này đã được ứng dụng để phân tích sự có mặt các kháng sinh trên ở trong nước thải bệnh viện tại một số thời điểm khác nhau . thực, phương pháp phân tích cần được xây dựng và thẩm định. Do đó chúng tôi tiến hành bước đầu đề tài: Xây dựng phương pháp xác định Cefadroxil và Cefotaxim trong nước bằng sắc ký lỏng khối phổ . sát và lựa chọn điều kiện phân tích (điều kiện sắc ký, điều kiện MS) để xác định Cefotaxim và Cefadroxil trong nước bằng LC-MS/MS. 2. Thẩm định phương pháp định lượng Cefotaxim và Cefadroxil trong. TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGỌ THỊ THU PHƯƠNG XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CEFADROXIL VÀ CEFOTAXIM TRONG NƯỚC BẰNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ