BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI  HÀ THỊ MAI HẠNH XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI ADENOSIN VÀ CORDYCEPIN TRONG CHẾ PHẨM TPCN DẠNG BỘT CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI HÀ THỊ MAI HẠNH XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI ADENOSIN VÀ CORDYCEPIN TRONG CHẾ PHẨM TPCN DẠNG BỘT CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: 1. PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh 2. DS. Nguyễn Thị Quế Mai Nơi thực hiện: Viện thực phẩm chức năng (VIDS) HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Sau thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép bày tỏ lòng biết ơn của mình tới những ngƣời đã nhiệt tình dạy dỗ, giúp đỡ tôi trong thời gian qua. Trƣớc hết tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh, ngƣời đã giao đề tài và tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn DS. Nguyễn Thị Quế Mai đã định hƣớng cho tôi trong quá trình tìm tài liệu cũng nhƣ hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ, công nhân viên Viện thực phẩm chức năng (VIDS) đã tạo mọi điều kiện thuận lợi đề tôi hoàn thành đề tài. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trƣờng, các phòng ban, cùng các giảng viên, nhân viên bộ môn Hóa phân tích – Độc chất và các bộ môn khác trong Trƣờng đại học Dƣợc Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã quan tâm động viên tôi trong quá trình học tập và hoàn thiện khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 08 tháng 05 năm 2015 Sinh viên Hà Thị Mai Hạnh MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Tổng quan về Đông trùng hạ thảo: 2 1.1.1. Đặc điểm của Đông trùng hạ thảo 2 1.1.2. Phân loại Đông trùng hạ thảo 2 1.1.3. Thành phần hóa học Đông trùng hạ thảo 2 1.1.4. Tác dụng Đông trùng hạ thảo 4 1.2. Tổng quan về adenosin, cordycepin 6 1.2.1. Công thức cấu tạo, đặc điểm vật lý hóa học 6 1.2.2. Dƣợc động học cordycepim và adenosin 6 1.2.3. Tác dụng của cordycepin, adenosine 7 1.3. Phƣơng pháp xác định cordycepin và adenosine 8 1.3.1. Một số nghiên cứu định lƣợng adenosin và cordycepin bằng phƣơng pháp HPLC 8 1.3.2. Các nghiên cứu định lƣợng adenosin và cordycepin bằng phƣơng pháp khác 12 1.4. Đại cƣơng về phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 13 1.4.1. Nguyên lý và các thông số đặc trƣng của sắc ký lỏng 13 1.4.2. Cấu tạo của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao 14 1.4.3. Ứng dụng 15 Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị: 18 2.1.1. Thiết bị - dụng cụ 18 2.1.2. Hóa chất, dung môi 18 2.2. Nội dung nghiên cứu 18 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.3.1. Xử lý mẫu 19 2.3.2. Khảo sát chọn điều kiện sắc ký: 20 2.3.3. Thẩm định phƣơng pháp phân tích 21 2.3.4. Ứng dụng trên một số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo 22 2.3.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu 22 Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1. Chuẩn bị mẫu 23 3.2. Lựa chọn điều kiện sắc ký 24 3.2.1. Khảo sát lựa chọn bƣớc sóng phát hiện 24 3.2.2. Khảo sát và lựa chọn pha động 25 3.3. Khảo sát quy trình xử lý mẫu 26 3.3.1. Khảo sát dung môi chiết 27 3.3.2. Khảo sát phƣơng pháp chiết 27 3.3.3. Khảo sát nhiệt độ chiết 28 3.3.4. Khảo sát thời gian chiết 29 3.3.5. Khảo sát số lần chiết 30 3.3.6. Điều kiện tối ƣu của quá trình xử lý mẫu 31 3.4. Thẩm định phƣơng pháp phân tích 32 3.4.1. Độ đặc hiệu 32 3.4.2. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính và lập đƣờng chuẩn 33 3.4.3. Độ lặp lại 34 3.4.4. Độ đúng 35 3.5. Ứng dụng định lƣợng trên một số chế phẩm thực phẩm chức năng dạng bột chứa Đông trùng hạ thảo. 36 3.6. Bàn luận 37 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 45 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Tiếng Anh hoặc tên khoa học Tiếng Việt ACN Acetonitril AOAC Association of Official Analytical Chemists Hiệp hội các nhà Hóa phân tích CE Capillary electrophoresis Điện di mao quản DD Dung dịch DMSO Dimethyl sulfoxide ĐTHT Đông trùng hạ thảo EtOH Ethanol HL Hàm lƣợng HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu năng cao MeOH Methanol MS Mass spectrometry Khối phổ PDA Photo diode array Dãy diod quang ppm Parts per million Phần triệu r Hệ số tƣơng quan RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối SOD Superoxide Dismutase SD Standard deviation Độ lệch chuẩn TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng UV Ultraviolet Tử ngoại VIS Visible Khả kiến DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số phƣơng pháp nghiên cứu xác định adenosine và cordycepin. 9 Bảng 2.1. Các hóa chất dung môi sử dụng trong quá trình thí nghiệm. 18 Bảng 3.1. Cách pha dãy dung dịch chuẩn 23 Bảng 3.2. Khảo sát thành phần pha động 26 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát chƣơng trình gradient 1, 2, 3 26 Bảng 3.4. Khảo sát số lần chiết 30 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ tuyến tính giữa nồng độ adenosin, cordycepin và diện tích pic 33 Bảng 3.6. Kết quả đánh giá độ lặp lại của phƣơng pháp 35 Bảng 3.7. Kết quả đánh giá độ thu hồi adenosin và cordycepin của phƣơng pháp 36 Bảng 3.8. Kết quả phân tích các mẫu TPCN chứa Đông trùng hạ thảo đƣợc gửi tới Viện TPCN 37 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1. Công thức cấu tạo một số nucleosid trong Đông trùng hạ thảo. 3 Hình 1.2. Công thức cấu tạo adenosin. 6 Hình 1.3. Công thức cấu tạo cordycepin 6 Hình 1.4. Con đƣờng chuyển hóa của adenosin ở động vật có vú 7 Hình 1.5. Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao. 14 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu dự kiến 20 Hình 3.1. Phổ hấp thụ của adenosin 25 Hình 3.2. Phổ hấp thụ của cordycepin 25 Hình 3.3. Kết quả khảo sát dung môi chiết 27 Hình 3.4. Kết quả khảo sát phƣơng pháp chiết 28 Hình 3.5. Khảo sát nhiệt độ chiết 29 Hình 3.6. Khảo sát thời gian chiết 30 Hình 3.7. Quy trình phân tích mẫu thực 31 Hình 3.8. Sắc ký đồ của mẫu chuẩn adenosin và cordycepin 32 Hình 3.9. Sắc ký đồ của mẫu trắng 32 Hình 3.10. Đƣờng chuẩn của adenosin ( nồng độ 1–40 µg/mL) 34 Hình 3.11. Đƣờng chuẩn của cordycepin ( nồng độ 1–40 µg/mL) 34 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Đông trùng hạ thảo là một loại dƣợc liệu quý hiếm có từ rất lâu trên thế giới, sách y học cổ truyền Trung Quốc từ xa xƣa đã coi Đông trùng hạ thảo là vị thuốc “cải lão hoàn đồng”, “hồi xuân sinh lực”. Mặt khác, các nghiên cứu y học cổ truyền hiện đại đều xác định Đông trùng hạ thảo hầu nhƣ không có tác dụng phụ đối với cơ thể ngƣời. Trong Đông trùng hạ thảo có nhiều loại nucleosid, đây là thành phần có hoạt tính chính, trong đó có adenosin và cordycepin là hai thành phần có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa năng lƣợng của cơ thể nhƣ: giúp cải thiện tuần hoàn ngoại biên và tim mạch, cải thiện năng lƣợng cơ bắp, giảm sinh trƣởng của tế bào xấu, tăng lƣợng oxy trong máu… Vì vậy, trên thị trƣờng càng ngày càng có nhiều các dòng sản phẩm Thực phẩm chức năng chứa loài dƣợc liệu quý hiếm này để phục vụ cho nhu cầu chăm sóc sức khỏe của ngƣời dân. Với việc sử dụng ngày càng nhiều các sản phẩm chứa Đông trùng hạ thảo đòi hỏi có các phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng của chúng bởi trên thực tế các sản phẩm này có giá thành rất đắt nhƣng khi phân tích, chất lƣợng rất khác nhau. Trong Dƣợc điển Trung Quốc đã đƣa ra chuyên luận đánh giá dƣợc liệu Đông trùng hạ thảo Cordyceps sinensis với thành phần adenosin, nhƣng thành phần cordycepin chƣa đƣợc đánh giá. Vì vậy việc xây dựng phƣơng pháp định lƣợng hai thành phần này trong Thực phẩm chức năng chứa Đông trùng hạ thảo là vô cùng cần thiết. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu để tài: “Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng đồng thời adenosine và cordycepin trong chế phẩm TPCN dạng bột chứa Đông trùng hạ thảo” nhằm góp phần kiểm soát chất lƣợng chế phẩm chứa Đông trùng hạ thảo với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng phương pháp định lượng adenosin và cordycepin trong chế phẩm Thực phẩm chức năng dạng bột chứa Đông trùng hạ thảo bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. 2. Ứng dụng phương pháp để phân tích một số chế phẩm Thực phẩm chức năng dạng bột chứa Đông trùng hạ thảo lưu hành trên thị trường. 2 Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Đông trùng hạ thảo: 1.1.1. Đặc điểm của Đông trùng hạ thảo Nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps) đƣợc các nhà khoa học Trung Quốc xác định mới đầu xuất hiện từ vùng núi cao nguyên Tây Tạng. Đây là loại đông dƣợc quý hiếm có bản chất là dạng ký sinh của loài nấm Ophiocordyceps sinensisthuộc nhóm nấm Ascomycetes trên cơ thể ấu trùng của một vài loài bƣớm trong chi Thitarodes trƣớc đây phân loại trong chi Hepialus [32]. Tên gọi “ Đông trùng hạ thảo” (tiếng Trung: dongchungxiacao) là xuất phát từ quan sát thực tế khi thấy vào mùa đông thì nhìn cặp cá thể này giống con sâu (côn trùng), đến mùa hè thì chúng giống nhƣ một loài thực vật. Vào mùa đông sâu bị nhiễm bào tử nấm do ăn phải bào tử nấm hoặc qua hơi thở của sâu. Đến khi sợi nấm phát triển mạnh, chúng xâm nhiễm vào các mô của vật chủ, khi nấm đạt đến độ trƣởng thành nhất, nó tiêu thụ đến 99% chất dinh dƣỡng từ thân sâu biến sâu thành xác khô. Nấm quả thể thành thục sẽ phát tán các bào tử ra xung quanh. Thời gian để nấm phát triển thành dạng quả thể kéo dài trong cơ thể sâu cả các tháng mùa đông đến cuối xuân đầu hè, đến mùa hè nấm phát triển thành dạng cây và phát tán bào tử [32]. Tại Trung Quốc, ĐTHT thƣờng gặp ở những rừng ẩm ƣớt các tỉnh Tứ Xuyên, Vân Nam, Tây Khang, Tây Tạng, nhiều nhất ở Tứ Xuyên và Tây Khang [13]. 1.1.2. Phân loại Đông trùng hạ thảo Chi nấm Cordyceps có hơn 350 loài khác nhau, riêng ở Trung Quốc đã tìm thấy 60 loài tuy nhiên cho đến nay hai loài đƣợc nghiên cứu nhiều nhất và đƣa vào nuôi trồng là Cordyceps sinensis (Berk) Sacc. và Cordyceps militaris (L. ex Fr) Link. 1.1.3. Thành phần hóa học Đông trùng hạ thảo ĐTHT chứa nhiều hoạt chất có hoạt tính sinh học nhƣ : các nucleosid; sterol; các acid hữu cơ; các loại đƣờng mono- , di-, oligosaccharid và polysaccharid; các protein; polyamin; vitamin và rất nhiều khoáng chất. [...]... số chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo Thu thập một số chế phẩm TPCN chứa ĐTHT dạng bột Tiến hành phân tích thành phần adenosin và cordycepin trong chế phẩm theo quy trình đã xây dựng 2.3.5 Phương pháp xử lý số liệu Kết quả thực nghiệm đƣợc xử lý bằng phƣơng pháp thống kê trên Microsoft Ofice Excel 2007 23 Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Chuẩn bị mẫu Dung dịch chuẩn: - Dung dịch chuẩn adenosin: ... tƣợng nghiên cứu: Mẫu TPCN dạng bột chứa Đông trùng hạ thảo gửi tới Viện Thực phẩm chức năng dạng bột màu vàng nâu, tơi mịn Nội dung nghiên cứu của đề tài này là: - Xây dựng quy trình định lƣợng adenosin và cordycepin bằng kỹ thuật sắc ký lỏng với detector PDA (xử lý mẫu, điều kiện chạy sắc ký, thẩm định) 19 - Lấy mẫu và áp dụng phƣơng pháp để đánh giá một số mẫu thực tế 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu Nguyên... - Thời gian rửa giải:15 phút - Nhiệt độ cột: 30⁰C 12 1.3.2 Các nghiên cứu định lượng adenosin và cordycepin bằng phương pháp khác Phương pháp sắc ký bản mỏng Nghiên cứu của MA King Wah và các cộng sự [17] tiến hành xác định cordycepin và 7 nucleoside khác trong Cordycepin sinensis bằng phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng sử dụng kỹ thuật rửa giải gradient Dịch chiết nƣớc của 11 sản phẩm chứa Đông trùng hạ thảo. .. kinh và đau thần kinh [9] Adenosin còn có khả năng điều chỉnh chức năng của nhiều tế bào khác nhau liên quan đến đƣờng hô hấp nhƣ bạch cầu trung tính, bạch cầu ƣa acid, tế bào lympho và đại thực bào 1.3 Phƣơng pháp xác định cordycepin và adenosine 1.3.1 Một số nghiên cứu định lượng adenosin và cordycepin bằng phương pháp HPLC Có nhiều phƣơng pháp phân tích adenosin và cordycepin nhƣng phƣơng pháp HPLC... sóng 254 nm Phƣơng pháp cho độ thu hồi cordycepin 98,09 %, của adenosin là 97,88 % Phương pháp điện di mao quản Nghiên cứu của Koteswara Rao và cộng sự [19] đã định tính và định lƣợng cordycepin trong Cordyceps militaris bằng phƣơng pháp điện di mao quản với điều kiện: DD đệm borat 0,02M với 28,6 % methanol, pH 9,5, điện thế 20 kV, nhiệt độ 25oC, bƣớc sóng 254 nm Đƣờng chuẩn xây dựng từ 20 – 100 μg/mL,... đánh dấu tƣơng ứng b Định lượng[ 2] Việc so sánh độ lớn tín hiệu của chất phân tích trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn và dung dịch thử (diện tích hoặc chiều cao pic) trong cùng một điều kiện sắc ký xác định là cơ sở của phép định lƣợng Các phƣơng pháp định lƣợng có thể áp dụng: Phƣơng pháp dùng chuẩn ngoại Phƣơng pháp dùng chuẩn nội Phƣơng pháp thêm chuẩn Phƣơng pháp chuẩn hóa diện tích Trong khuôn khổ khóa... một số nucleosid trong Đông trùng hạ thảo[ 30] Các nucleosid là một trong những thành phần có hoạt tính trong ĐTHT, trong đó adenosin, cordycepin đƣợc sử dụng là hoạt chất để đánh giá chất lƣợng của ĐTHT Có hơn 10 loại nucleosid và các chất tƣơng tự đƣợc tìm thấy trong ĐTHT tự nhiên hay nuôi trồng nhƣng hàm lƣợng khác nhau [16] Một nghiên cứu cho thấy nồng độ adenosin đƣợc tìm thấy trong ĐTHT nuôi trồng... dụng của cordycepin Cordycepin có tác dụng ức chế sinh tổng hợp purin, ADN/ARN [31] Khi vào trong tế bào, cordycepin chuyển hóa thành dạng 5’ mono, di và tri phosphate ức chế các enzym nhƣ ribose phosphate pyrophosphokinase và 5 – phosphoribosyl – 1 – pyrophosphate amidotransferase trong tổng hợp purin Do cấu trúc gần giống adenosin nên trong quá trình phiên mã tổng hợp ARN, enzyme kết hợp cordycepin, ... 100-2% B) thì pic adenosin và cordycepin rất nhọn, cân đối, sắc ký đồ chạy ổn định, lặp lại với thời gian lƣu hợp lý Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn chƣơng trình gradient 5 để tách và định lƣợng chất phân tích 3.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu Theo quy trình xử lý mẫu dự kiến, trân nền mẫu TPCN chứa ĐTHT dạng bột, tiến hành khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình chiết nhƣ: phƣơng pháp 27 chiết,... 30 Đun hồi lƣu 20 10 0 Adenosin Cordycepin Hình 3.4 Kết quả khảo sát phương pháp chiết Nhận xét: Hàm lƣợng của adenosine (23,04 mg/100g) và cordycepin (61,12 mg/100g) thu đƣợc trong mẫu khi chiết bằng siêu âm đều cao hơn so với hàm lƣợng của adenosin (18,01 mg/100g) và cordycepin (58,2 mg/100g) khi chiết bằng phƣơng pháp hồi lƣu vì siêu âm có tác dụng tăng mạnh tính thấm thấu và khuếch tán nhờ những . Đông trùng hạ thảo nhằm góp phần kiểm soát chất lƣợng chế phẩm chứa Đông trùng hạ thảo với các mục tiêu sau: 1. Xây dựng phương pháp định lượng adenosin và cordycepin trong chế phẩm Thực phẩm. năng chứa Đông trùng hạ thảo là vô cùng cần thiết. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu để tài: Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng đồng thời adenosine và cordycepin trong chế phẩm TPCN dạng bột chứa Đông. DƢỢC HÀ NỘI  HÀ THỊ MAI HẠNH XÂY DỰNG PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI ADENOSIN VÀ CORDYCEPIN TRONG CHẾ PHẨM TPCN DẠNG BỘT CHỨA ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ