BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐẶNG LAN HƢƠNG NGHIÊN CỨU TRIỂN KHAI KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT ARN TỪ MÔ ĐỘNG VẬT VÀ RT-PCR KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐẶNG LAN HƢƠNG NGHIÊN CỨU TRIỂN KHAI KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT ARN TỪ MÔ ĐỘNG VẬT VÀ RT-PCR KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: 1.TS. Đào Thị Mai Anh 2.TS. Phùng Thanh Hƣơng Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa Sinh Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin được gửi lời cảm ơn đến toàn thể thầy cô Trường Đại học Dược đã dạy dỗ và truyền đạt những tri thức quý báu cho em trong suốt thời gian em học tập và rèn luyện tại trường. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô, anh chị kỹ thuật viên bộ môn Hóa Sinh, bộ môn Thực vật, bộ môn Vi sinh – Ký sinh, bộ môn Vi sinh – Công nghiệp Dược, bộ môn Dược lực – trường Đại học Dược Hà Nội, cũng như Viện công nghệ sinh học, đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình nghiên cứu. Đặc biệt, em xin tỏ lòng cảm ơn sâu sắc nhất tới sự quan tâm và hướng dẫn tận tình của TS. Đào Thị Mai Anh, người thầy tâm huyết đã trực tiếp hướng dẫn, góp ý và truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để giúp em hoàn thành khóa luận của mình một cách tốt nhất. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới cô giáo TS. Phùng Thanh Hƣơng đã luôn hết mình hỗ trợ chúng em trong quá trình học tập và nghiên cứu. Đồng thời em xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã quan tâm, động viên và giúp đỡ em trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận này. Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2015 Sinh Viên Đặng Lan Hƣơng MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………… 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. ARN 3 1.1.1. Cấu trúc 3 1.1.2. Phân loại, chức năng 4 1.1.3. Quá trình sinh tổng hợp ARN 8 1.1.4. Quá trình phiên mã ngược 9 1.2. Kỹ thuật tách chiết ARN 10 1.2.1. Yêu cầu chung của các phương pháp tách chiết ARN 10 1.2.2. Các phương pháp tách chiết ARN 11 1.2.3. Các thông số đánh giá chất lượng và số lượng ARN 12 1.3. Phương pháp RT-PCR 13 1.3.1. Phản ứng RT (Reverse transcription) 13 1.3.2. Kỹ thuật PCR 14 1.3.3. Các biến thể của RT-PCR 17 1.4. Vai trò của tách chiết ARN và RT-PCR trong lĩnh vực Y Dược 18 1.4.1. Vai trò của tách chiết ARN: 18 1.4.2. Vai trò của RT-PCR 19 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị 21 2.1.1. Nguyên liệu 21 2.1.2. Hóa chất 21 2.1.3. Thiết bị 22 2.1.4. Dụng cụ 22 2.2. Nội dung nghiên cứu 22 2.3. Phương pháp thực nghiệm 24 2.3.1. Phương pháp tách chiết ARN 24 2.3.2. Phương pháp kiểm tra chất lượng ARN 25 2.3.3. Phương pháp tiến hành phản ứng phiên mã ngược sử dụng enzym reverse transcriptase (phản ứng RT) 26 2.3.4. Phương pháp PCR 27 2.3.5. Xử lí số liệu 28 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 29 3.1. Kết quả 29 3.1.1. Kết quả tách chiết ARN 29 3.1.2. Kết quả khảo sát một số thông số của RT-PCR 34 3.1.3. Kết quả sử dụng RT-PCR để nghiên cứu biểu hiện gen 36 3.2. Bàn luận 42 3.2.1. Về kết quả tách ARN tổng số bằng TRIzol 42 3.2.2. Về ứng dụng RT-PCR để nghiên cứu sự biểu hiện gen: 44 KẾT LUẬN 46 KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tên đầy đủ tiếng Anh Tên tiếng việt A Adenin ADN Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic bps Base pairs cặp bazơ nitơ C Cytosin cADN Complementary DNA ADN bổ sung CTAB Cetyltrimethylammonium bromid dNTPs Deoxynucleosid triphosphat G Guanin G6Pase Glucose 6 phosphatase GAPDH Glyceraldehyd-3-phosphat dehydroxylase lncARN Long noncoding RNA ARN lớn không mã hóa mARN Message RNA ARN thông tin miARN Micro RNA ARN siêu nhỏ NMP ribonucleosid monophosphat OD Optical density Mật độ quang PCR Polymer chain reaction Phản ứng khuếch đại gen PPi Pyrophosphat qRT-PCR Quantitative Reverse transcription Polymerase chain reaction rARN ribosom RNA ARN ribosom RT Reverse transcription Phiên mã ngược RT-PCR Reverse transcription Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại gen có phiên mã ngược S Sedimentation Hệ số lắng siARN Small interfering RNA ARN can thiệp nhỏ snARN Small nuclear ARN ARN nhỏ ở nhân snoARN Small nucleolar ARN ARN nhỏ ở hạch nhân STZ Streptozotocine Streptozotocin T Thiamin tARN Transfer RNA ARN vận chuyển TBE Đệm Tris - Borat - acid Ethylenediaminetetraacetic U Uridin UTR Untranslated region Vùng không được dịch mã DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 3.1 Nồng độ của ARN tách chiết từ mô gan 31 Bảng 3.2 Nồng độ của ARN tách chiết từ mô mỡ 31 Bảng 3.3 Tỷ lệ OD 260 /OD 230 và OD 260 /OD 280 của ARN tách chiết từ mô gan 32 Bảng 3.4 Tỷ lệ OD 260 /OD 230 và OD 260 /OD 280 của ARN tách chiết từ mô mỡ 32 Bảng 3.5 Kết quả phân tích đậm độ của băng bằng phần mềm ImageJ 39 Bảng 3.6 Kết quả phân tích đậm độ các băng bằng phần mềm ImageJ và tính toán lượng ARN biểu hiện. 41 Bảng 3.7 So sánh khả năng biểu hiện của gen G6Pase so với GADPH 41 Bảng 3.8 Các hóa chất sử dụng trong tách chiết ARN 43 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ STT Tên hình vẽ, đồ thị Trang Hình 1.1 Cấu tạo của một ribonucleotid 2 Hình 1.2 Liên kết phosphodieste 4 Hình 1.3 Một số cấu trúc bậc 2 của ARN 4 Hình 1.4 Cấu tạo của phân tử mARN 5 Hình 1.5 Cấu trúc bậc hai của phân tử tARN 6 Hình 1.6 Quá trình phiên mã ngược của virus 9 Hình 1.7 Nguyên lý của phản ứng RT 14 Hình 1.8 Nguyên lý của kỹ thuật PCR 15 Hình 2.1 Đồ thị và hàm số biểu thị mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ ARN 25 Hình 3.1 Phổ hấp thụ của ARN tách từ mô gan từ bước sóng 200 nm đến 300 nm 29 Hình 3.2 Phổ hấp thụ của ARN tách từ mô mỡ từ bước sóng 200 nm đến 300 nm 30 Hình 3.3 Hình ảnh điện di gel các mẫu ARN được tách từ mô gan 33 Hình 3.4 Hình ảnh điện di gel các mẫu ARN được tách từ mô mỡ 33 Hình 3.5 Sự biểu hiện gen của GAPDH và G6Pase ở mô gan ở 28 chu kỳ 34 Hình 3.6 Sự biểu hiện gen của GAPDH và G6Pase ở mô gan ở 36 chu kỳ 35 Hình 3.7 Sự biểu hiện gen G6Pase ở mô gan và mô mỡ 36 Hình 3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR gen GAPDH với số chu kỳ PCR là 28 chu kỳ trên gel agarose 37 Hình 3.9 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR gen GAPDH với số chu kỳ PCR là 30 chu kỳ trên gel agarose 37 Hình 3.10 Hình ảnh điện di sản phẩm RT-PCR gen GAPDH với số chu kỳ PCR là 32 chu kỳ trên gel agarose 38 Hình 3.11 Đồ thị và hàm số mô tả sự phụ thuộc của đậm độ băng sản phẩm và lượng ARN/cADN ban đầu 39 Hình 3.12 Sự biểu hiện gen của GAPDH ở các mẫu gan chuột 40 Hình 3.13 Sự biểu hiện gen của G6Pase ở các mẫu gan chuột 40 Hình 3.14 Sự biểu hiện gen G6Pase ở các nhóm chuột 42 Sơ đồ 2.1 Nội dung nghiên cứu 23 Sơ đồ 2.2 Các bước tiến hành nghiên cứu 24 [...]... những nghiên cứu trên phân tử ARN còn khá mới mẻ, số lượng đề tài có liên quan đến lĩnh vực này còn hạn chế Với mong muốn nhằm góp phần đẩy mạnh những nghiên cứu ARN và biểu hiện gen ở trường Đại 2 học Dược Hà Nội, chúng tôi thực hiện đề tài Nghiên cứu triển khai kỹ thuật tách chiết ARN từ mô động vật và RT- PCR với các mục tiêu sau: 1 Tách chiết được ARN từ mô động vật 2 Thực hiện RT- PCR từ ARN tách chiết. .. gồm các nội dung chính sau (Sơ đồ 2.1): 23 Mục tiêu 1 Tách chiết ARN Mục tiêu 2 Mục tiêu 2 Phản ứng RT- PCR Phản ứng RT- PCR Mục tiêu 3 Mục tiêu 3 Sử dụng RT- PCR nghiên cứu Sử dụng RT- PCR nghiên cứu biểu hiện gen biểu hiện gen Tách chiết ARN từ 2 loại Tách chiết ARN từ 2 loại (mỡ, gan) bằng TRizol (mỡ, gan) bằng TRizol Chuyển ARN -> cADN bằng Chuyển ARN -> cADN bằng phản ứng sử dụng enzym phản ứng sử dụng... chế quá trình dịch mã của mARN 19 đích đó Tuy nhiên, nguồn gốc của siARN hiện nay vẫn còn nhiều ý kiến trái chiều [12] Từ ARN tổng số, mARN được tách chiết ra là nguyên liệu để điều chế siARN [24, 51, 58] Đến nay, hướng nghiên cứu và điều trị dựa trên siARN đã đem đến nhiều kết quả ngoài mong đợi [69, 77] 1.4.2 Vai trò của RT- PCR 1.4.2.1 Trong nghiên cứu biểu hiện gen RT- PCR là phương pháp kinh điển... tích bán định lượng mức độ biểu hiện gen - Áp dụng nghiên cứu biểu hiện gen G6Pase ở gan trên mô hình chuột gây tiểu đường Các bước tiến hành nghiên cứu lần lượt được thực hiện như Sơ đồ 2.2: 24 Lấy mô gan và mô mỡ từ chuột (Bảo quản -80oC) Tách chiết ARN từ mô gan và mô mỡ Định lượng, kiểm tra độ tinh sạch của ARN bằng phương pháp quang phổ Điện di ARN trên gel agarose 1,2% Chụp ảnh gel đã nhuộm Ethidium... Các phƣơng pháp tách chiết ARN Một cách tổng quát, dựa vào thể chất vật liệu tách ARN, có thể chia các phương pháp tách chiết ARN làm 2 nhóm - Sử dụng các dung dịch tách chiết - Sử dụng các vật liệu rắn 1.2.2.1 Các phương pháp sử dụng các dung dịch tách chiết: Các phương pháp này sử dụng dung dịch hóa chất để tách ARN khỏi tế bào Quy trình tách chiết được thực hiện như quy trình chung đã trình bày ở... phân tử ARN 1.1.2 Phân loại, chức năng Trong số các hệ thống phân loại ARN hiện nay, hệ thống phân loại dựa vào chức năng của ARN trong quá trình sinh tổng hợp protein là phổ biến nhất Theo hệ 5 thống này ARN được phân thành 4 nhóm: ARN thông tin, ARN vận chuyển, ARN ribosom và các ARN khác 1.1.2.1 ARN thông tin (mARN) ARN thông tin, chiếm 5% ARN tổng số, là ARN mang thông tin mã hóa protein từ ADN... gồm sợi ADN cũ và sợi ADN mới Các ADN mới tổng hợp là khuôn cho các chu kỳ sau, cho phép khuếch đại các ADN đích lên gấp hàng triệu lần (Hình 1.8) [61] Hình 1.8 Nguyên lý của kỹ thuật PCR 1.3.2.2 Các thành phần - Khuôn ADN: Có thể là ADN được tách chiết từ mô động thực vật, tế bào nuôi cấy, vi sinh vật, hoặc là đoạn cADN được tổng hợp từ quá trình phiên mã ngược, tùy vào mục đích nghiên cứu - Mồi: là... dựa vào mạch khuôn ADN 10 Enzym reverse transcriptase không có hoạt tính sửa sai 3’-5’, vì vậy tỷ lệ đột biến diễn ra ở retrovirus là khá cao và nhanh (1/20000 nucleotid) 1.2 Kỹ thuật tách chiết ARN Thế giới về ARN rất đa dạng và cung cấp nhiều thông tin về các quá trình sinh tổng hợp cũng như hoạt động của tế bào, chính vì thế cùng với sự phát triển không ngừng của cơ sở dữ liệu ARN, các kỹ thuật tách. .. huỳnh quang [79] 18 1.4 Vai trò của tách chiết ARN và RT- PCR trong lĩnh vực Y Dƣợc 1.4.1 Vai trò của tách chiết ARN: 1.4.1.1 Nghiên cứu biểu hiện gen Biểu hiện gen là thuật ngữ để chỉ quá trình chuyển đổi thông tin di truyền chứa trong gen thành các protein, thể hiện chức năng của gen ra bên ngoài ARN là một phân tử đóng vai trò quan trọng trong quá trình điều hòa và biểu hiện gen ở mức độ phân tử Như... pháp định lượng sự biểu hiện gen: Northerm blot, qRTPCR, vi mảng cADN, đặc biệt trong đó có vai trò của các phương pháp RT- PCR sẽ được trình bày ở mục 1.4.2 Ngoài mARN, còn có các ARN khác tham gia điều hòa sự biểu hiện gen như lncARN, siARN, miARN hay các ribozym là những phân tử mà ngày nay vẫn còn nhiều bí ẩn Tách được ARN giúp nghiên cứu vai trò và cơ chế của các phân tử này trong tế bào 1.4.1.2 . tài Nghiên cứu triển khai kỹ thuật tách chiết ARN từ mô động vật và RT-PCR với các mục tiêu sau: 1. Tách chiết được ARN từ mô động vật 2. Thực hiện RT-PCR từ ARN tách chiết được 3. Dùng RT-PCR. Bảng 3.1 Nồng độ của ARN tách chiết từ mô gan 31 Bảng 3.2 Nồng độ của ARN tách chiết từ mô mỡ 31 Bảng 3.3 Tỷ lệ OD 260 /OD 230 và OD 260 /OD 280 của ARN tách chiết từ mô gan 32 Bảng 3.4. BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI ĐẶNG LAN HƢƠNG NGHIÊN CỨU TRIỂN KHAI KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT ARN TỪ MÔ ĐỘNG VẬT VÀ RT-PCR KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2015