TRƯỜ NG Đ NGUY NGHIÊN CỨ U Đ THÀNH PHẦ N HÓA H HOÀNG LIÊN FOLIOLOSUM KHÓA LU BỘ Y TẾ NG Đ ẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUY ỄN THỊ LƯƠNG U Đ ẶC ĐIỂM THỰ C V N HÓA H ỌC CỦ A CÂY TH HOÀNG LIÊN - THALICTRUM FOLIOLOSUM DC. KHÓA LU ẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC S Ĩ HÀ NỘI - 2015 C V ẬT VÀ A CÂY TH Ổ THALICTRUM Ĩ BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ LƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY THỔ HOÀNG LIÊN -THALICTRUM FOLIOLOSUM DC. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ N gười hướng dẫn: TS.Hoàng Quỳnh Hoa Nơi thực hiện: Bộ môn Thực Vật HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới TS. Hoàng Quỳnh Hoa, người Thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. Người không ngại vất vả giúp tôi vượt qua những ngày khó khăn nhất để tôi trưởng thành hơn. Tôi xin bày tỏ lòng chân thành cảm ơn tới: - PGS. TS. Trần Văn Ơn, PGS. TS. Nguyễn Thu Hằng, ThS. Nghiêm Đức Trọng, ThS. Nguyễn Hương Giang, DS. Chu Thị Thoa và tập thể giảng viên, kỹ thuật viên Bộ môn Thực vật đã hết lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận. - DS. Nguyễn Thị Thùy Linh, DS. Phạm Thị Linh Giang, DS. Tạ Khắc Công, DS. Vũ Lê Thu và các anh chị đã tham gia nghiên cứu và làm khóa luận tại bộ môn, đã giúp đỡ, chỉ bảo cho tôi rất nhiều kinh nghiệm trong quá trình nghiên cứu khoa học tại bộ môn. - Các bộ môn Dược Cổ Truyền. Dược liệu. Hóa sinh, Hóa phân tích, Hóa vô cơ, Bào chế… đã tạo điều kiện cho tôi được thực hiện đề tài. - Các bạn Bùi Thanh Loan, Nguyễn Thị Ngọc Huyền, Lương Thị Lan, Nguyễn Đoàn Thoan, Nguyễn Thanh Tùng đã chia sẻ cùng tôi những lúc khó khăn. - Bạn Lê Tùng Sơn đã luôn góp ý giúp tôi hoàn thiện mình hơn. - Các bạn khóa 65 và khoá 66 cùng nghiên cứu và làm đề tài tại bộ môn đã động viên tôi trong thời gian nghiên cứu khoa học tại bộ môn. - Em Nguyễn Đình Tuấn luôn nhắc nhở và cổ vũ tôi. Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất tới những người thân, anh chị, bạn bè thân của tôi vẫn luôn bên tôi, hỏi thăm quan quan tâm tôi. Và tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban giám hiệu, các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội, những người đã dìu dắt tôi trong suốt 5 năm học qua để tôi có được ngày hôm nay. Hà Nội, 14 tháng 5 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Lương DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT Br Berberin Dd Dung dịch HPLC High Performance Liquid Chromatography HPTLC High Performance Thin Layer Chromatigraphy IR Infrared Radiation MS Mass spectrometry NMR Nuclear magnetic resonance P. t. l Phân tử lượng SKLM Sắc ký lớp mỏng STT Số thứ tự TLC Thin Layer Chromatography TN Thí nghiệm TT Thuốc Thử UV Ultraviolet DANH MỤC CÁC BẢNG STT Bảng Tên bảng Trang 1 Bảng 2.1. Các dãy nồng độ của dung dịch mẫu chuẩn 18 2 Bảng 3.1. Kết quả định tính các nhóm hợp chất trong dược liệu bằng phản ứng hoá học 25 3 Bảng 3.2. Khoảng nồng độ lựa chọn 29 4 Bảng 3.3. Khảo sát độ pha loãng 31 5 Bảng 3.4. Nồng độ Berberin chuẩn và diện tích pic đáp ứng 33 6 Bảng 3.5. Giá trị R f và diện tích pic của các vết 34 7 Bảng 3.6. Kết quả bán định lượng Berberin bằng HPTLC 35 DANH MỤC CÁC HÌNH STT Hình Tên hình Trang 1 Hình 2.1. Hình ảnh hệ thống máy sắc ký HPTLC 12 2 Hình 2.2. Sơ đồ định tính các nhóm hợp chất bằng phản ứng hóa học 15 3 Hình 3.1. Ảnh mẫu nghiên cứu 21 4 Hình 3.2. Vi phẫu rễ Thổ hoàng liên 23 5 Hình 3.3. Đặc điểm bột dược liệu 24 6 Hình 3.4. Các hình ảnh sắc ký đồ dung dịch alcaloid với các hệ dung môi khác nhau ở bước sóng 366 nm 27 7 Hình 3.5. Hình ảnh sắc ký đồ dung dịch alcaloid toàn phần ở hệ IV 28 8 Hình 3.6. Đường chuẩn dãy 1 29 9 Hình 3.7. Đường chuẩn dãy 2 30 10 Hình 3.8. Đường chuẩn dãy 3 30 11 Hình 3.9. Đồ thị khảo sát độ pha loãng 31 12 Hình 3.10. Kết quả chồng pic của mẫu trắng (1), mẫu thử (2), mẫu chuẩn (3). 32 13 Hình 3.11. Mối liên hệ giữa nồng độ và diện tích pic 33 14 Hình 4.1. Hình ảnh Thalictrum foliolosum DC. (A; C; E) và Thalictrum ichangensis Lecoyer ex Oliv. (B; D; C) 36 MỤC LỤC TÊN MỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. VỀ THỰC VẬT 2 1.1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm của chi Thalictrum L. 2 1.1.2. Loài Thalictrum foliolosum DC. 3 1.2. VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 4 1.3. BỘ PHẬN DÙNG 5 1.4. TÁC DỤNG DƯỢC LÝ 5 1.4.1. Tác dụng kháng khuẩn – kháng viêm 5 1.4.2. Tác dụng hạ nhiệt 6 1.4.3. Độc tính cấp 6 1.5. CÔNG DỤNG 6 1.6. VÀI NÉT VỀ BERBERIN 6 1.6.1. Công thức hoá học và nguồn gốc của berberin 6 1.6.2. Tác dụng sinh học của berberin 7 1.6.3. Chỉ định của berberin 8 1.6.4. Chống chị định 8 1.6.5. Dạng thuốc và hàm lượng 8 1.6.6. Định lượng Berberin 8 1.7. ỨNG DỤNG CỦA HPTLC TRONG NGHIÊN CỨU DƯỢC LIỆU 9 1.7.1. Định tính 9 1.7.2. Định lượng 10 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 12 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 12 2.1.2. Hóa chất 12 2.1.3. Máy móc và dụng cụ nghiên cứu 12 2.2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.2.1. Nội dung nghiên cứu 13 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu 13 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 21 3.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 21 3.1.1. Đặc điểm hình thái thực vật 21 3.1.2. Đặc điểm cấu tạo giải phẫu 22 3.1.3. Đặc điểm bột Thổ hoàng liên 23 3.2. ĐỊNH TÍNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC 24 3.2.1. Định tính sơ bộ bằng phản ứng hóa học 24 3.2.2. Định tính Berberin và Palmatin bắng sắc ký lớp mỏng 26 3.3. BÁN ĐỊNH LƯỢNG BERBERIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPTLC 28 3.3.1. Chiết alcaloid toàn phần: 28 3.3.2. Khảo sát lựa chọn dãy nồng độ berberin chuẩn 28 3.3.3. Khảo sát lựa chọn độ pha loãng cho dung dich thử 31 3.3.4. Lựa chọn các điều kiện triển khai HPTLC 31 3.3.5 Thẩm định phương pháp bán định lượng 31 3.3.6. Kết quả bán định lượng Berberin bằng phương pháp HPTLC 34 BÀN LUẬN 36 4.1. VỀ THỰC VẬT 36 4.2. VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 37 4.2.1. Về định tính các nhóm chất chính 37 4.2.2. Về định tính alcaloid 37 4.3. VỀ BÁN ĐỊNH LƯỢNG BERBERIN BĂNG PHƯƠNG PHÁP HPTLC . 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay,Berberin được biết đến là một alcaloid có nhiều tác dụng chữa bệnh như: Bệnh đường tiêu hóa (tiêu chảy, viêm dạ dày ruột),tiểu đường, bệnh tim mạch (tăng lipid máu, hạ huyết áp), các tình trạng viêm, điều trị ung thư ,[24],[25],[29],[31], [36].Các tác dụng này đã được nghiên cứu, chứng minh và được ứng dụng rộng rãi trên lâm sàng. Berberin được tìm thấy trong 150 loài thuộc 23 chi và 7 họ thực vật khác nhau. Ở Việt Nam, các họ thường chứa berberin làhọ Hoàng liên (Ranunculaceae), họ Hoàng liên gai (Berberidaceae), họ Tiết dê (Menispermaceae), họ Cam (Ruta- ceae)[17], họ Thuốc phiện (Papaveracae)[8]. Với nhiều tác dụng của Berberin, các nguồn dược liệu chứa Berberin đã được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trong y học cổ truyền và y học hiện đại. Thổ hoàng liên -Thalictrum foliolosum DC. thuộc họ Hoàng liên- Ranuncula- ceae được xếp vào diện những cây thuốc quý hiếm có hàm lượng berberin cao[1].Do nạn phá rừng làm nương rẫy và thường xuyên bị khai thác quá mức làm thuốc nên hiện nayThổ hoàng liên đã được xếp vào diện những cây thuốc có nguy cơ bị tuyệt chủng.Những nghiên cứu về Thổ hoàng liên chỉ tập trung chủ yếu vào bảo tồn và nhân giống[16]. Trong khuôn khổ đề tài cấp Nhà nước về đa dạng di truyền các dược liệu chứa Berberin ở Việt Nam, đề tài "Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây Thổ hoàng liên - Thalictrum foliolosum DC.”thu hái tại Sơn Lađược thực hiện với 3 mục tiêu: 1. Nghiên cứu đặc điểm thực vậtvà giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu. 2. Định tính thành phần alcaloid chính trong dược liệu bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng. 3. Bán định lượng Berberin trong cây Thổ hoàng liênThalictrum foliolosum bằng phương pháp HPTLC. [...]... loài Thalictrumfoliosum DC được phân bố ở Lai Châu (Phong Thổ, Sìn Hồ), Điện Biên (Tủa Chùa), Lào Cai (Sa Pa), Hà Giang (Đồng Văn), Vĩnh Phúc, Sơn la[4],[15],[22] 1.2 VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC Các nghiên cứu đều cho thấy thành phần chính trong thân r Thổ hoàng liên làBerberin, palmatin, atrorrhizin và thalictrin[1],[4],[10],[15] Dược điển Việt Nam có quy định dược liệu Thổ hoàng liên (Thalictrum foliolosum. .. có mỏ 50,100 và 200 ml; bình định mức 5, 10, 25, 50,100 ml; pipet 1, 2, 5, 10 ml; đũa thủy tinh; phễu thủy tinh 2.2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1.Nội dung nghiên cứu 2.2.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái và giải phẫu thực vật  Mô tả đặc điểm hình thái mẫu nghiên cứu  Làm vi phẫu rễ, quan sát, mô tả đặc điểm qua kính hiển vi màn hình  Làm tiêu bản giọt ép soi bột và xác định đặc điểm bột dược... bào thành mỏng từ ruột ra lớp vỏ (3) 23 Hình 3.2 Vi phẫu rễ Thổ hoàng liên ph 1 Lát cắt toàn phần rễ Thổ hoàng liên; 2 Bần; 3 Ruột; 4 Mô mềm àn ph ần; vỏ; 5 Tầng phát sinh libe –gỗ; 6 Gỗ cấp 2 ỏ; 3.1.3 Đặc điểm bột Thổ hoàng liên ặc ho Soi bột rễ Thổ hoàng liên dưới kính hiển vi, quan sát thấy các đặc điểm àng dưới đ sau: Mảnh bần màu vàng nâu (1) cấu tạo bởi các tế bào hình chữ nhật th àu ữ thành. .. và trong mẫu thân là khoảng 1.6% đến 3.1% [13] 12 CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Thân rễ Thổ hoàng liên thu hái tại xã Co Mạ, huyện Thuận Châu, tỉnh Sơn La vào thời gian 11/04/2012 Mẫu nghiên cứu hình thái và giải phẫu được làm tiêu bản cây khô và lưu tại phòng tiêu bản, Trường Đại học Dược Hà Nội Mã số tiêu bản là: HNIP/18125/15 Mẫu nghiên. .. 745T 2.2.1.2 Định tính thành phần hóa học  Định tính các nhóm hợp chất chính trong dược liệu bằng phản ứng hóa học  Định tính berberin và palmatin bằng sắc ký lớp mỏng  Chiết xuất alcaloid toàn phần  Tiến hành sắc ký lớp mỏng  Phát hiện vết bằng thiết bị UV-Visualizer và sử lý kết quả bằng phần mềm wincat 2.2.1.3.Bán định lượng Berberin trong cây Thổ hoàng liên -Thalictrum foliolosum bằng phương... khoa học là Thalictrum foliolosum DC. , họ Ranunculaceae (Phụ lục 5) 3.1.2 Đặc điểm cấu tạo giải phẫu Hình 3.2 là hình ảnh vi phẫu rễ Thalictrum foliolosum DC Mặt cắt ngang vi phẫu rễ có thiết diện tròn (1) Quan sát từ ngoài vào trong thấy các đặc điểm sau: Bần gồm 2 –4 lớp tế bào hình chữ nhật có thành dày, hóa bần xếp đều thành các vòng tròn đồng tâm Tầng phát sinh bần –lục bì gồm 1 lớp tế bào thành. .. CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 VỀ THỰC VẬT 1.1.1 Vị trí phân loại và đặc điểm của chi ThalictrumL 1.1.1.1 Vị trí phân loại Theo một số tài liệu phân loại, chi Thalictrum được xếp vào vị trí phân loại như sau: Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngoc Lan (Magoliopsida) Phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae) Bộ Hoàng liên (Ranuculales) Họ Hoàng liên (Ranuculaceae) Chi Thailictrum L.[5],[37] Thalictrum L là một chi... lưỡng tính Đài 4 – 10, màu xanh vàng hoặc tím, hình mác hoặc hình thìa, không tồn tại cùng quả; không có tràng; bộ nhị nhiều; bộ nhuỵ gồm 4 – 6 hoặc nhiều lá noãn, 1 noãn Quả đóng [5], [37] 3 1.1.2 Loài Thalictrum foliolosum DC 1.1.2.1 Khóa phân loại xác định loài Thalictrum foliolosum DC theo Thực vật chí Trung Quốc Thực vật chí Trung Quốc đã xác định Thalictrumfoliosum DC dựa trên khoá như sau [37]:... bản giọt ép soi bột rễ để phân tích đặc điểm bột dược liệu  Các mẫu được chụp ảnh trên kính hiển vi gắn kết camera Nikon DS Fi2 2.2.2.2 Định tính thành phần hóa học  Định tính bằng phản ứng hóa học Định tính bằng phản ứng hóa học theo tài liệu Dược liệu học[ 3]  Chuẩn bị dược liệu: Rễ sấy khô ở 600C đến độ ẩm ≤ 8 %, nghiền nhỏ thành bột bằng máy xay  Dụng cụ hóa chất  Dược liệu khô: khoảng 50 g... chọnkhoảng tuyến tính và nồng độ chất chuẩn định lượng 21 CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ TH ẾT 3.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT ẶC 3.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật th Hình 3.1 Ảnh mẫu nghiên cứu 1,2 Ảnh mẫu tươi;3 Ảnh toàn thể; 4 Thân rễ; 5 Thân rễ phân đốt; ươi;3 ễ 6 Rễ có nhiều nếp nhăn; 7 Mặt cắt ngang rễ; 8 Mặt cắt ngang thân rễ ễ ặt Cây thảo, sống lâu năm Cao kho ng khoảng 90 cm Lá kép 3 lầ cuống chung . NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY THỔ HOÀNG LIÊN -THALICTRUM FOLIOLOSUM DC. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ N gười hướng dẫn: TS .Hoàng Quỳnh Hoa Nơi thực. phần hóa học của cây Thổ hoàng liên - Thalictrum foliolosum DC. ”thu hái tại Sơn Lađược thực hiện với 3 mục tiêu: 1. Nghiên cứu đặc điểm thực vậtvà giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu. 2 đã được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều trong y học cổ truyền và y học hiện đại. Thổ hoàng liên -Thalictrum foliolosum DC. thuộc họ Hoàng liên- Ranuncula- ceae được xếp vào diện những cây thuốc