BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ QUỲNH MAI XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM AMINOGLYCOSID TRONG THỊT BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN KHỐI PHỔ ( LC – MS/MS ) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ QUỲNH MAI XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM AMINOGLYCOSID TRONG THỊT BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN KHỐI PHỔ ( LC – MS/MS ) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: 1. TS. Lê Đình Chi 2. ThS. Đỗ Thị Thanh Thƣơng Nơi thực hiện: Viện Kiểm Nghiệm An Toàn Vệ Sinh Thực Phẩm Quốc Gia HÀ NỘI - 2015 i   em   n ng dn cho em trong suc hi n.  o Vin kim nghi v sinh thc phm Quc G Hng Hu ki                         14    ii MC LC  i MC LC ii DANH MHI VIT TT v DANH MNG vii T V 1  3 1.1. Tng quan vaminoglycosid 3 1.1.1.  3 1.1.2.  3 1.1.3. t 5 1.1.4.  dit khun ca aminoglycosid 5 1.1.5. Ph ng 5 1.1.6. n 6 1.2. Gii hng t 6 1.3. nh aminoglycosid 7 1.3.1. n dch quang hc (Optical Imunobiosensor) 7 1.3.2. n di mao qun (capillary electrophoresis  CE) 7 1.3.3. Sng hi (HPLC) 8 1.3.4. Sng khi ph (LC - MS, LC - MS/MS) 9 1.4. Tc v sng khi ph 10 1.4.1. Sng hi 11 1.4.2. Khi ph (Mass spectrometry) 12 U 16 2.1. i u 16 2.2. t liu  trang thit b 16 2.2.1. t liu 16 2.2.2. Dng c 18 2.3. Nu 18 iii 2.3.1. Kh 18 2.3.2. Th 18 2.3.3. ng d 18 2.4. u 18 2.4.1.  u 18 2.4.2. oglycosid 20 2.4.3.  20 2.4.3.1. c hiu /chn lc 20 2.4.3.2. Gii hn (LOD), Gii hng (LOQ) 21 2.4.3.3. Khong tuyng chun 21 2.4.3.4.  lp l thu hi 22 2.4.4.   liu 22 T QU O LUN 23 3.1. Kh 23 3.1.1. Khu kin khi ph 23 3.1.1.1. Khu kin bi vi ion m 23 3.1.1.2. Khu kin b 24 3.1.2. u kin sng 24 3.1.2.1. Ch 24 3.1.2.2. Chng 25 3.1.2.3. Kh ng 27 3.1.3. Kh u tht 28 3.1.3.1. Ch u 28 3.1.3.2. Kh m chit 29 3.1.3.3. Khdch chit 31 3.1.3.4. Kht chit pha rn SPE cho mu tht 31 3.1.3.5. Kha gii 32 3.1.3.6. Kh a gii 33 3.2. Th 36 3.2.1. c hiu / chn lc 36 3.2.2. nh khong tuy 38 iv 3.2.3.  lp l thu hi 39 3.2.4. Gii hi hng 41 3.2.5. n 41 3.3. u thc t 42 KT LUN NGH 43 Kt lun 43 Kin ngh 44 U THAM KHO PH LC v DANH M VIT TT u Ting anh Ting vit AOAC Association of Official Analytical Community Hip hi c c APCI Atmospheric pressure chemical ionization Ch   t n CAD Collision Gas Pressure  CE Collision Energy ng b CUR Curtain Gas  CV Coefficient of Variation H s bi CXP Collision Cell Exit Potential Th u ra DP Declustering Potential Th  DHS Dihydrostreptomycin ESI Electrospray ionization n t GS1 Ion Source Gas 1 Ngu GS2 Ion Source Gas 2 Ngu HPLC High performance liquidchromatography Sng hi IS Ionspray Voltage Th phun ion LC- MS/MS Liquid chromatography tandem mass spectrometry Si ph hai ln LOD Limit of detection Gii hn vi LOQ Limit of quantification Gii hng MRL Maximum Residue Limit Gii hng t MS Mass spectrometry Khi ph R(%) Recovery Hiu sut thu hi SPE Solid phase extraction Chit pha rn SD Standard Deviation  lch chun TEM Ion source Temperature Nhi ngun vii DANH MNG Bảng 1.1: Phân loại các kháng sinh nhóm aminoglycosid 4 Bảng 1.2: Mức giới hạn dư lượng tối đa của một số aminoglycosid 7 Bảng 1.3: Một số nghiên cứu dùng phương pháp HPLC xác định aminoglycosid 8 Bảng 1.4: Các nghiên cứu dùng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ để phân tích kháng sinh aminoglycosid 9 Bảng 3.1: Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI 23 Bảng 3.2: Kết quả bắn phá các ion mẹ 23 Bảng 3.3: Năng lượng bắn phá các ion con của aminoglycosid 24 Bảng 3.4: Chương trình gradient 1 25 Bảng 3.5: Chương trình gradient 2 25 Bảng 3.6: Chương trình gradient 3 26 Bảng 3.7: Ảnh hưởng của hệ pha động đến thời gian lưu và diện tích pic 26 Bảng 3.8: Ảnh hưởng của tốc độ dòng đến thời gian lưu và diện tích pic 27 Bảng 3.9: Chương trình chạy gradient tối ưu 28 Bảng 3.10: Khảo sát thể tích dung môi chiết 30 Bảng 3.11: Khảo sát pH dịch chiết 31 Bảng 3.12: Khảo sát loại cột chiết pha rắn SPE cho mẫu thịt 32 Bảng 3.13: Khảo sát tỷ lệ dung môi rửa giải 33 Bảng 3.14: Khảo sát thể tích dung môi rửa giải 34 Bảng 3.15: Ion mẹ và ion con của một số aminoglycosid 36 Bảng 3.16: Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ streptomycin 38 Bảng 3.17: Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp xác định streptomycin trong thịt 40 Bảng 3.18: Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp xác định dihydrostreptomycin trong thịt 40 [...]... nh t tồ ư ịnh ưu việt c a kỹ thuật LC - dạng vế , ế th c 2 hiệ ề : Xác định dư lượng một số kháng sinh nhóm aminoglycosid trong thịt bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC MS/ MS)” ằ 1 X ục ư ng : ị ư ư ng m t số aminoglycosid trong thịt bằng LC - MS/ MS 2 Á ụ ư t số mẫu th c tế 3 n 1.1 Tổng quan về n U m k án sin aminoglycosid 1.1.1 Khái quát chung lycosid, hay aminosid, ậ W ừ ư C... sulfonic trong 880 ml natri hexan - 1 - sulfonic 0,01 M Streptomycin (8 µ / ) Dihydrostreptomycin (12 µ / )  thu hồi : 9 : 0,5 ml/ ph - Tố - Bư 84 - 92 % : 263 nm - Bư ạ: 435 nm 1.3.4 Sắc ký lỏng khối phổ (LC - MS, LC - MS/ MS) D nhạ , ư ặc hiệ , p thu UV - V , S kỹ thuật LC - C- q S/ S ối p cho việ ư ư c nhiều , ứu s dụng ể osid (b ng 1.4) Bảng 1.4: Các nghiên cứu dùng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ. .. HCOOH 0,05 % - ACN, Polymeric HCOOH 0,05 % LCMS /MS 101 – 105 LOQ: 2µ / 1.4 Tổng quan t m l ợc về sắc ký lỏng khối phổ Sắ ý ỏng khối phổ (LC – nối gi a sắ ý ỏng hiệ S) (HP C) ỹ thuậ thiết bị khối phổ (MS) kết 11 S q C nố ư ứ ư i ta m i kết a s chậm trễ ệ thố t lỏ ối phổ Kể từ c 1970 S ề kỹ thuậ triể , ế nghiệ ến nay sắ ý ỏng khối phổ ừ ư c t m quan tr ng c P ối phổ nl , nhạ , ặc hiệu cao Gi i hạn ể ến 10-14... 2.4.2 Phương pháp phân tích các minoglycosid ý ỏng kết nối khối phổ 2 l n (LC - S dụng kỹ thuật sắ S/ S) ể , thịt l n q ẫu ạn  T ồ ư ẫu thịt (nế ịch mẫ bằ ý c t sắ ý ều kiệ  Nhận diệ ư ối phổ ết qu  L a ch n m ặ R ng r a gi i ra ịch chuẩ é 2.4.1 qua ) ặ khỏi c t bằ ư ư ẫu th mb , ổ ư c ặc hiệu ế a từ ết bị khối phổ hai l sinh (nế ư ( ế ều kiệ ỏi nền mẫu h p ị v i phổ ) ể ị ư ư ư ng từ ) trong mẫu thịt. .. Khảo sát phương pháp - Kh ều kiện MS - Kh ều kiện LC - Kh ều kiện x ý ẫu 2.3.2 Thẩm định phương pháp ặc hiệu / ch n l c c - ư ng chuẩn - Kho ng tuyế ện, Gi i hạ - Gi i hạ - ư lặp lạ , thu hồi c ị ư ng ư 2.3.3 Ứng dụng phương pháp Á ụ ư ng ể ị ư ư ư ng m t số trong mẫu thịt l n 2.4 P n p áp n iên cứu 2.4.1 Phương pháp xử lý mẫu T (SPE) ể x ứ ý ư ết pha rắn ẫu Chiết pha rắn (chiết rắn – lỏ hai pha rắ... ch ệ etector sẽ é n trong mẫ c ư ạ ể ư dụng trong HPLC: h p thụ UV-Vis, hu nh quang, ư cs dẫn 1.4.2 Khối phổ (Mass spectrometry) ết bị Khối phổ t c p ch ư ệ c bằng việc ( /z) , ư c gia tố T ư ệ ư ịnh khố ư C ập h ư c tạ ố b ứng v theo tỉ số gi a khối ồng ion ư ến detector ẽ ư c thể hiện bằng m t số vạ ổ khố ( ị ) 13 (khố ư ) , nhận dạ ịnh c ị ư ng t [1] : C u tạo c a thiết bị khối phổ gồm 3 ph ồn ion,... bị , Hệ c P Nguồn ion Detector khối B X ý ư gi số liệu Hình 1.2: Sơ đồ khối của máy khối phổ - Nguồn ion T ối phổ trạ oặ ề ể , ư c s dụng trong sắ t số kỹ thuậ ện t , lỏng khối phổ: , T ứu ện t (ESI) C ra khỏi c t sắ t ống mao qu n bằng kim loại cao thế (3 – 5 kV) S mịn bằ thế q 2 , mao qu ý ện (ESI) dụng kỹ thuậ  I mẫu ống mao qu ạt nhuyễ tạ C d n S , ư D ư c tạ 2 Dư ng c ư ừ ạ ệ ư ư ư c phun ệ ố...viii Bảng 3.19: Độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp xác định gentamicin trong thịt 40 Bảng 3.20: Kết quả phân tích mẫu thực tế 42 ix DANH MỤ Á HÌ H VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Cấu trúc phân tử một số aminoglycosid 4 Hình 1.2: Sơ đồ khối của máy khối phổ 13 Hình 1.3: Bộ nguồn ion hóa ESI 14 Hình 1.4: Bộ phân tích tứ cực... ng 1.2: ư 7 Bảng 1.2: Mức giới hạn dư lượng tối đa của một số aminoglycosid trong thực phẩm STT Aminoglycosid ố ư ng MRL (µg/kg) Thị , 600 Thậ , 1000 (µ / ) 200 S 1 Thịt lợn 600 Dihydrostreptomycin/ Gan l n 600 streptomycin Thận l n 1000 M l n 600 Thị , 100 G , 2000 (µg/l) S 2 Gentamicin 200 2000 Thận l n 5000 M l n ác p 100 Gan l n 1.3 Thịt lợn 100 n p áp xác định aminoglycosid 1.3.1 Đầu dò miễn dịch... n ứ q ẫ , ạng , ị aminoglycosid t kh c… ư c s dụng r ể ẩn hoặ nhiễ c hiệ , m ẩ ư th ố ư c khi xu ư ư ệ ịt sẽ ư, ẫn t i ều trị ư ng [28] Việc ể vậ i kh ng sinh khỏ ể, ư ng ố ồn gốc ư trong thịt tồ p thụ tồn  (EU), ng vật u về qu aminoglycosid ư ại th c [28] ý ể , ề mặ nhạy ư n ể kiể ư ư ng q loại mẫu th c phẩm c n kiể ừ nhu c u th c tế MS/ MS trong ứ aminoglycosid trong ậy Từ ư t số quốc gia (MRL) c . vthc 2 hi   Xác định dư lượng một số kháng sinh nhóm aminoglycosid trong thịt bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép hai lần khối phổ (LC - MS/ MS)c  1. ng. LÊ THỊ QUỲNH MAI XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM AMINOGLYCOSID TRONG THỊT BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN KHỐI PHỔ ( LC – MS/ MS ) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC. LÊ THỊ QUỲNH MAI XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG MỘT SỐ KHÁNG SINH NHÓM AMINOGLYCOSID TRONG THỊT BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP HAI LẦN KHỐI PHỔ ( LC – MS/ MS ) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP