BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI    TRẦN THỊ THANH HUẾ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CEFIXIM CÓ TRONG NƯỚC THẢI TỪ CƠ SƠ SẢN XUẤT DƯỢC BẰNG HPLC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC     HÀ NỘI – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI    TRẦN THỊ THANH HUẾ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CEFIXIM CÓ TRONG NƯỚC THẢI TỪ CƠ SƠ SẢN XUẤT DƯỢC BẰNG HPLC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC     HÀ NỘI – 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ THANH HUẾ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CEFIXIM CÓ TRONG NƯỚC THẢI TỪ CƠ SƠ SẢN XUẤT DƯỢC BẰNG HPLC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 60 72 0410 Người hướng dẫn: 1. PGS.TS. Nguyễn Thị Kiều Anh 2. TS. Đoàn Cao Sơn HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh và TS. Đoàn Cao Sơn, là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành tốt luận văn này. Đặc biệt, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám đốc Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương và TS. Nguyễn Thị Kim Hương – Trưởng khoa Dược lý, Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương cùng tập thể cán bộ trong khoa đã tạo điều kiện và giúp đỡ cho tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian tôi học tập tại trường và thực hiện đề tài. Cuối cùng, tôi xin c ảm ơn gia đình và bạn bè, những người luôn động viên, khích lệ, tạo động lực cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn. Hà Nội, ngày 20 tháng 8 năm 2013 Học viên Trần Thị Thanh Huế   MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ CEPHALOSPORIN 3 1.1.1. Lịch sử ra đời, nguồn gốc 3 1.1.2. Công thức cấu tạo, phân loại và phổ tác dụng 3 1.1.3. Đặc tính của các cephalosporin nghiên cứu 5 1.2. TỔNG QUAN VỀ CEFIXIM 6 1.2.1. Công thức cấu tạo 6 1.2.2. Tính chất lý hóa 6 1.2.3. Dược lý 6 1.2.4. Chỉ định 7 1.2.5. Một số phương pháp nghiên cứu định lượng cefixim 7 1.4. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 11 1.4.1. Khái niệm 11 1.4.2. Nguyên tắc 11 1.4.3. Phân loại 11 1.4.4. Các thông số đặc trưng 12 1.4.5. Ứng dụng của HPLC 14 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 19 2.2. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 19 2.2.1. Hóa chất - thuốc thử - chất chuẩn 19     2.2.2. Thiết bị - dụng cụ 20 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.3.1. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 21 2.3.2. Xây dựng điều kiện sắc ký 21 2.3.3. Đánh giá phương pháp 21 2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu 23 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 24 3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH 24 3.1.1. Khảo sát phương pháp xử lý mẫu 24 3.1.2. Khảo sát quy trình phân tích 33 3.1.3. Quy trình phân tích 37 3.2. ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP 38 3.2.1. Độ thích hợp của hệ thống 38 3.2.2. Tính chọn lọc của phương pháp 39 3.2.3. Độ tuyến tính 43 3.2.4. Độ đúng và độ chính xác của phương pháp 45 3.2.6. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 49 3.2.6. Khảo sát độ ổn định 50 3.3. ỨNG DỤNG QUY TRÌNH XÂY DỰNG ĐƯỢC ĐỂ XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CEFIXIM CÓ T RONG NƯỚC THẢI CÔNG NGHIỆP DƯỢC 51 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 54 4.1. LỰA CHỌN QUY TRÌNH XỬ LÝ MẪU 54 4.2. LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN PHÂN TÍCH 54 4.3. Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 KẾT LUẬN 58 KIẾN NGHỊ 59     DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ACN Acetonitril BP 2010 Dược điển Anh 2010 (The Bristist Pharmacopoeia) C18 Octadecyl carbon chain DAD Detector chuỗi diod (Diode array detector) HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High perform liquid chromatography) HPLC-MS Sắc kí lỏng khối phổ (High perform liquid chromatography –Mas Spectrometry) t R Thời gian lưu S píc Diện tích pic S i Diện tích pic của chuẩn nội TB Trung bình CFM Cefixim CRF Clorof orm DEE Diethyl ether CHX Cyclohe xan LLOQ Giới hạn định lượng dưới ULOQ Giới hạn định lượng tr ên MeOH Methanol mg Milligram ml Mililit PA Tinh khiết phân tích (Pure analysis) SĐK Số đăng kí USP 32 Dược điển Mỹ 32 (The United States Pharmacopoeia) UV - VIS Quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (Ultraviolet and visible absorption Spectrophotometry)     DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Phổ tác dụng của các cephalosporin 4 Bảng 1.2. Đặc tính của các cephalosporin liên quan nghiên cứu 5 Bảng 3.1. Khảo sát lựa chọn dung m ôi xử lý mẫu 25 Bảng 3.2. Khảo sát xử lý mẫu với dung môi diethyl ether 29 Bảng 3.3. Khảo sát xử lý mẫu với dung môi cloroform 30 Bảng 3.4. Khảo sát xử lý mẫu với dung môi cyclohexan 31 Bảng 3.5. Khảo sát độ ổn định của quá trình xử lý mẫu 32 Bảng 3.6. Kết quả khảo sát thể tích tiêm mẫu 35 Bảng 3.7. Kết quả độ thíc h hợp của hệ thống 39 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát độ tuyến tính của phương pháp 44 Bảng 3.9. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp 46 Bảng 3.10.a. Kết quả độ lặp lại và độ chính xác tr ung gian ở nồng độ LQC 47 Bảng 3.10.b. Kết quả độ lặp lại và độ chính xác trung gian ở nồng độ MQC 47 Bảng 3.10.c. Kết quả độ lặp lại và độ chính xác tr ung gian ở nồng độ HQC .48 Bảng 3.11. Kết quả khảo sá t độ ổn định trong quá trình bảo quản mẫu 50 Bảng 3.12. Kết quả khảo sá t độ ổn định trong giai đoạn chờ tiêm mẫu 51 Bảng 3.13. Kết quả phân tích mẫu nước thải công ty CP dược Medipla ntex .52       DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Công thức chung của cephalosporin 3 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của cefixim 6 Hình 2.1. Hóa chất, thuốc thử, chất c huẩn, thiết bị, dụng cụ 20 Hình 3.1. Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn dung môi xử lý mẫu 25 Hình 3.2. Sắc ký đồ khảo sát lựa chọn lượng dung m ôi xử lý mẫu 27 Hình 3.3. Sắc ký đồ khảo sát quá trình xử lý mẫu với diethyl ether 28 Hình 3.4. Sắc ký đồ khảo sát quá trình xử lý mẫu với cloroform 29 Hình 3.5. Sắc ký đồ khảo sát quá trình xử lý mẫu với cyclohexan 30 Hình 3.6. Sắc ký đồ khảo sát xử lý mẫu bằng c loroform tỷ lệ 6:2 acid hóa 32 Hình 3.7. Sắc ký đồ khảo sát thành phần pha động và tốc độ dòng 34 Hình 3.8. Phổ hấp thụ tử ngoại của cefixim 36 Hình 3.9. Phổ hấp thụ tử ngoại của cefdinir 37 Hình 3.10. Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu: mẫu chuẩn cef dinir (a), mẫu chuẩn cefixim (b), mẫu trắng (c), mẫu tự tạo (d) 41 Hình 3.11. So sánh phổ cefixim trong dung dịch mẫu tự tạo và dung dịch chuẩn 41 Hình 3.12. So sánh phổ cefdinir trong dung dịch mẫu tự tạo và dung dịch chuẩn 42 Hình 3.13. Sắc ký đồ khảo sát độ đặc hiệu khi phân tích cefixim và 4 cephalosporin khác 42 Hình 3.14. a. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ cefixim (ng/ml) và tỷ lệ diện tích pic của cefixim/diện tích pic chuẩn nội 44 Hình 3.14. b. Sắc ký đồ khảo sá t độ tuyến tính 44 Hình 3.15. Sắc ký đồ mẫu LOD 49 Hình 3.16. Sắc ký đồ phâ n tích mẫu nước thải Công ty CP dược Mediplantex 53   ĐẶT VẤN ĐỀ Tình trạng kháng thuốc kháng sinh đang là một thảm họa mà con người phải đối mặt. Theo thống kê của Tổ chức y tế thế giới, chỉ tính riêng năm 2010, tình trạng vi khuẩn Klebsiella Pneumoniae kháng thuốc đã gây ra 25.000 ca tử vong tại châu Âu. Hiện nay, ngay cả những thuốc kháng sinh thế hệ mới nhất, chỉ dùng trong nhiễm khuẩn bệnh viện cũng đã có hiện tượng bị kháng, bằng chứng mới đây nhất là sự lây lan của chủng vi khuẩn kháng carbapenem (ndm-1) ở hơn 16 quốc gia trên thế giới. Tổng Giám đốc Tổ chức y tế thế giới, bà Magaret Chan đã đưa ra lời cảnh báo về khả năng con người quay trở lại thời kỳ trước khi thuốc kháng sinh được ra đời nếu không có một hành động toàn cầu giải quyết vấn đề kháng thuốc đang ngày càng trầm trọng này [32,33]. Để giải quyết vấn đề kháng thuốc kháng sinh, các nghiên cứu trước đây chỉ tập trung chú ý đến nguyên nhân do việc sử dụng thuốc không hợp lý. Ngày nay, các nhà khoa học đã phát hiện được một nguyên nhân cũng không kém phần quan trọng khác: đó là sự tồn dư của kháng sinh và các chất chuyển hóa của chúng trong môi trường vì chỉ cần một dư lượng nhỏ kháng sinh thải ra môi trường nhưng sẽ được tích lũy dần dần vào các vi khuẩn gây bệnh, giúp chúng phát triển những gen kháng thuốc. Cũng vì lý do đó, từ những năm cuối thập kỉ 90 của thế kỷ 20, hướng nghiên cứu về dư lượng thuốc kháng sinh và những chất chuyển hoá cũng như tác động của chúng trong môi trường được ra đời. Hiện nay, hướng nghiên cứu này đang được quan tâm tại các nước phát triển như Mỹ, Đức, Thuỵ Sỹ, Australia… Nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng sự tồn tại của các kháng sinh và chất chuyển hoá của chúng trong môi trường nước đã trở nên phổ biến [17,20,27]. Nhằm góp phần nâng cao nhiệm vụ chăm sóc và khám chữa bệnh cho nhân dân, ngành công nghiệp Dược Việt Nam đang ngày càng lớn mạnh. Hiện cả nước có hơn 200 doanh nghiệp có sản xuất dược phẩm với nhiều sản phẩm thuốc   1 [...]... t tan trong nc, aceton, glycerin, tan trong methanol, propylen glycol, hi tan trong ethanol, thc t khụng tan trong ether, ethyl acetat v hexan, hu nh khụng tan trong dung dch sorbitol 70% v octanol Dung dch cha 0,7 mg cefixim trong 1 ml nc cú pH t 2,6 n 4,1 [6,15,29] tan trong nc: 0,104 g/l Hng s pKa1 = 3,45; pKa2 = 2,92 [35] 1.2.3 Dc lý Cefixim (CFM) l mt khỏng sinh cephalosporin th h 3, c dựng theo... - t tan trong nc, tan trong aceton, ethyl acetat v methanol, ớt tan trong ethanol - tan trong nc: 0,284 g/l - pKa1 = 3,15; pKa2 = 1,1 3 Cefdinir III C14H13N5O5S2 - Bt trng hoc hi vng - Tan trong dung dch m phosphat 0,1M (pH = 7), ớt tan trong nc, trong alcol v diethylether - tan trong nc: 8,87.10-2 g/l - pKa1 = 1,74; pKa2 = 7,45 4 Cefoperazon III C25H26N9NaO8S2 - Bt trng hoc hi vng - D tan trong nc,... sinh trong nc thi bnh vin [3], nhng cha cú ti no kho sỏt i tng nc thi t cỏc c s sn xut dc phm Xut phỏt t nhng lý do trờn, chỳng tụi tin hnh ti: Xõy dng phng phỏp xỏc nh d lng Cefixim cú trong nc thi t c s sn xut Dc bng HPLC vi cỏc mc tiờu chớnh nh sau: 1 Xõy dng c phng phỏp xỏc nh d lng khỏng sinh Cefixim trong nc thi t c s sn xut Dc bng HPLC nng ppb 2 ng dng phng phỏp xõy dng c kim tra d lng Cefixim. .. qua cỏc quỏ trỡnh khỏc nhau õy cng l phng phỏp c s dng trong nghiờn cu ny Sau õy chỳng tụi xin trỡnh by chi tit v phng phỏp chun ni dựng trong nh lng bng HPLC * Phng phỏp dựng chun ni [1,2] Nguyờn tc: Ngi ta chn mt cht chun ni a vo trong mu phõn tớch v trong dung dch chun i chiu T s din tớch pic ca cht phõn tớch v cht chun ni l thụng s phõn tớch c dựng xõy dng ng chun Hai yờu cu i vi chun ni l: - Pic... nhau * nh lng: Vic so sỏnh ln tớn hiu thu c t pic ca cht phõn tớch trong dung dch (din tớch pic hoc chiu cao pic) trong cựng mt iu kin sc ký l c s ca phộp nh lng Cỏc phng phỏp nh lng cú th ỏp dng l: - Phng phỏp dựng chun ngoi - Phng phỏp dựng chun ni 14 - Phng phỏp thờm cht chun - Phng phỏp chun húa din tớch Trong ú phng phỏp dựng chun ni l phng phỏp hay c s dng khi nn mu phc tp, phi qua quỏ trỡnh... cao, hin nay cha ph bin ti Vit Nam Trong khi ú, h thng HPLC- DAD v chit lng lng khỏ thụng dng, d kim, d ỏp dng ti Vit Nam Vỡ vy chỳng tụi xõy 10 dng quy trỡnh phõn tớch CFM trong nc thi nh mỏy vi h thng HPLC vi detector DAD 1.4 SC Kí LNG HIU NNG CAO 1.4.1 Khỏi nim Sc ký lng hiu nng cao (HPLC) l k thut phõn tớch da trờn c s ca s phõn tỏch cỏc cht trờn mt pha tnh cha trong ct, nh dũng di chuyn ca pha... ng thi vi cỏc cht khỏc [12,18,23] Ti Vit Nam, cng ó cú nhng nghiờn cu nh lng CFM trong huyt tng [11] Tuy nhiờn nhng nghiờn cu v CFM trong nc thi nh mỏy cũn khỏ ớt Cỏc quy trỡnh nh lng CFM trong ch phm v huyt tng khụng th ỏp dng cho nh lng CFM trong nc thi nh mỏy Trờn th gii, chỳng tụi mi ch tỡm thy mt nghiờn cu nh lng CFM trong nc thi bnh vin [27] Nghiờn cu ny s dng phng phỏp phõn tớch bng LC-MS/MS,... 8,87.10-2 g/l - pKa1 = 1,74; pKa2 = 7,45 4 Cefoperazon III C25H26N9NaO8S2 - Bt trng hoc hi vng - D tan trong nc, tan trong methanol, hi tan trong ethanol 96% - tan trong nc: 0,286 g/l - pKa1 = 3,38; pKa2 = - 1,7 5 1.2 TNG QUAN V CEFIXIM 1.2.1 Cụng thc cu to 3H2O Hỡnh 1.2 Cụng thc cu to ca cefixim + Cụng thc phõn t: C16H15N5O7S2.3H2O + Khi lng phõn t: 507,5 +Tờn khoa hc: (6R, 7R)- 7- [[(Z)- 2- (2- aminothiazol-... trng * H s phõn b K [2] Trong ú: CS : nng mol ca cht tan trong pha tnh CM: nng mol ca cht tan trong pha ng K cng ln, s di chuyn ca cỏc cht tan qua pha tnh cng chm Nu cỏc cht trong hn hp cú hng s K khỏc nhau cng nhiu thỡ kh nng tỏch din ra cng d dng hn * Thi gian lu tR [2] Thi gian lu tR l khong thi gian t lỳc tiờm mu vo ct n khi cht phõn tớch n detector Trờn cựng mt iu kin HPLC ó chn, thi gian lu... th dựng thi gian lu phỏt hin nh tớnh cỏc cht Thi gian lu ph thuc vo cỏc yu t: - Bn cht ca pha tnh - Bn cht, thnh phn, tc ca pha ng - Cu to v bn cht phõn t ca cht tan - Trong mt s trng hp cũn ph thuc vo pH pha ng * H s dung lng k [2] k = 12 = K  Trong ú: K: h s phõn b VS: th tớch pha tnh VM: th tớch pha ng Cn chn ct, pha ng sao cho k nm trong khong ti u: 1 k 8 * H s i xng ca pic AF [2] AF = Trong . Cefixim trong nước thải từ cơ sở sản xuất Dư c bằng HPLC ở nồng độ ppb. 2. Ứng dụng phương pháp xây dựng được để kiểm t ra dư lượng Cefixim có trong nước thải từ cơ sở sản xuất Dư c trong nước. . dựng phương pháp xác định dư lượng Cefixim có trong nước thải từ cơ sở sản xuất Dư c bằng HPLC với các mục tiêu chính như sau: 1. Xây dựng được phương phá p xác định dư lượng kháng sinh Cefixim. TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ THANH HUẾ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CEFIXIM CÓ TRONG NƯỚC THẢI TỪ CƠ SƠ SẢN XUẤT DƯỢC BẰNG HPLC LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN