BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH THU HƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ CHIẾT ENZYM PROTEASE TỪ VI KHUẨN Bacillus subtilis natto LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH THU HƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ CHIẾT ENZYM PROTEASE TỪ VI KHUẨN Bacillus subtilis natto LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH MÃ SỐ: 607.204.02 Người hướng dẫn khoa học: TS. Đàm Thanh Xuân HÀ NỘI 2013 LỜI CẢM ƠN Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành nhất tới cô giáo TS. Đàm Thanh Xuân – Giảng viên bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội, người thầy đã luôn quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trên con đường học tập, nghiên cứu khoa học. Đồng thời, tôi cũng xin cảm ơn DS. Lê Ngọc Khánh và DS. Đinh Thị Thanh Thảo cùng toàn thể các thầy, cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể gia đình, các thầy cô giáo trong trường và tất cả bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập. Hà Nội, tháng 10 năm 2013 Học viên Đinh Thu Hương MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ Trang ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis natto …………………………………. 2 1.1.1. Phân loại khoa học…………………………………………. 2 1.1.2. Nguồn gốc……… ………………………………………… 2 1.1.3. Đặc điểm hình thái………………………………………… 2 1.1.4. Đặc điểm sinh dưỡng……………………………………… 3 1.1.5. Đặc điểm sinh lý…………………………………… 3 1.1.6. Sản phẩm trao đổi chất của B. subtilis natto……………… 3 1.2. Nattokinase …………………………………………………… 4 1.2.1. Các enzyme có khả năng tiêu huyết khối trước Nattokinase 4 1.2.2. Nattokinase……………………………………… 5 1.3. Phương pháp tách chiết enzyme từ vi sinh vật ……………. 11 1.3.1. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tổng hợp enzyme từ vi sinh vật……………………………………………………………………. 11 1.3.2. Các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng sinh enzyme Nattokinase của vi khuẩn…………………. 13 1.3.3. Protease và phương pháp chiết tách protease ngoại bào của vi sinh vật……………………………………………………………… 14 1.3.3.1. Protease và chiết tách protease ngoại bào của vi sinh vật thuộc chi Bacillus…………………………………………………… 14 1.3.3.2. Các phương pháp chiết tách protease ngoại bào của B. 17 subtilis natto………………………………………………………… Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị …………………………………… 20 2.1.1. Vi sinh vật sử dụng…………………………………………… 20 2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất và thuốc thử………………………… 20 2.1.3. Môi trường …………………………………………………… 20 2.1.4. Máy móc và dụng cụ………………………………………… 21 2.2. Nội dung nghiên cứu ………………………………………… 21 2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo enzyme protease của Bacillus subtilis natto……… 21 2.2.2. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tách chiết và thử hoạt tính tiêu fibrin của enzyme protease thu được………………………… 21 2.3. Phương pháp nghiên cứu…………………………………… 22 2.3.1. Phương pháp giữ giống và nuôi cấy B. subtilis natto………. 22 2.3.2. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh enzyme……………………………………………… 23 2.3.3. Phương pháp chiết tách và tinh sạch protease……………… 23 2.3.3.1. Phương pháp chiết tách protease bằng amoni sulfat……… 24 2.3.3.2. Phương pháp chiết enzyme bằng dung môi hữu cơ (aceton hay ethanol 96%)…………………………………………………… 25 2.3.3.3. Phương pháp tinh sạch protease bằng sắc kí lọc gel Sephadex G – 75……………………………………………………. 26 2.3.4. Phương pháp sơ bộ định tính các nhóm enzyme trong dịch lên men……………………………………………………………… 26 2.3.5. Phương pháp Biuret xác định nồng độ protein và hoạt độ protease……………………………………………………………… 27 2.3.6. Phương pháp điện di SDS – PAGE…………………………. 29 2.3.7. Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính phân giải fibrin……………. 30 2.3.8. Một số công thức sử dụng trong kết quả thực nghiệm………. 31 Chương 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ ……………………. 33 3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo enzyme protease của Bacillus subtilis natto…………… 33 3.1.1. Sơ bộ xác định các enzyme có mặt trong môi trường nuôi cấy B. subtilis natto…………………………………………………… 33 3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng của nguồn hydratcarbon……………… 34 3.1.3. Lựa chọn nồng độ maltose thích hợp nhất…………………… 36 3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của đậu tương và chất cảm ứng lên khả năng tạo enzyme của vi khuẩn B. subtilis natto…………………. 38 3.1.5. Khảo sát ảnh hưởng của một số muối vô cơ ………………… 39 3.1.6. Đánh giá khả năng sinh enzyme protease ngoại bào của vi khuẩn B. subtilis natto trên môi trường kết hợp…………………… 40 3.2. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp tách chiết và thử hoạt tính tiêu fibrin của enzyme protease thu được ………………… 41 3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH dung môi đến hoạt tính enzyme protease ngoại bào của B. subtilis natto…………………………… 41 3.2.2. Lựa chọn phương pháp tách chiết protease ngoại bào của B. subtilis natto………………………………………………………. 43 3.2.2.1. So sánh khả năng chiết enzyme protease bằng dung môi hữu cơ (aceton, ethanol 96%) và amoni sulfat 60% 43 3.2.2.2. Khảo sát nồng độ amoni sulfat để kết tủa protease ngoại bào của B. subtilis natto……………………………………………… 44 3.2.3. Tinh chế protease bằng phương pháp sắc kí lọc gel Sephadex G – 75………………………………………………………… … 48 3.2.4. Điện di một số phân đoạn thu được sau tinh chế …………… 51 3.2.5. Sơ bộ thử hoạt tính phân giải fibrin của mẫu nghiên cứu…… 52 Chương 4: BÀN LUẬN …………………………………………… 54 4.1. Về ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo enzyme protease của Bacillus subtilis natto……………………… 54 4.2. Về lựa chọn phương pháp tách chiết và thử hoạt tính tiêu fibrin của enzyme protease thu được …………………………… 57 4.2.1. Về ảnh hưởng của pH dung môi đến hoạt tính enzyme protease ngoại bào của B. subtilis natto…………………………… 57 4.2.2. Về lựa chọn phương pháp tách chiết protease ngoại bào của B. subtilis natto…………………………………………………… 58 4.2.3. Về việc tinh chế protease bằng phương pháp sắc kí lọc gel Sephadex G – 75…………………………………………………… 60 4.2.4. Về kết quả điện di một số phân đoạn thu được sau tinh chế… 61 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ………………………………………. 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tên đầy đủ AS Amoni sulfat atm Đơn vị đo áp suất bh Bão hòa B. subtilis natto Bacillus subtilis natto CMC Carboxy methyl cellulose E. coli Escherichia coli FU Fibrinolytic units (Đơn vị đánh giá khả năng phân giải fibrin của chất nghiên cứu) kDa kilo Dalton mBar mili Bar N 0 Lần thí nghiệm nKat nano Katal pI Điểm đẳng điện của protein Điện di SDS – PAGE Điện di gel polyacrylamid với sự có mặt của sodium dodecyl sulfat SD Độ lệch chuẩn (Standard deviation) Tb Trung bình TLPT Trọng lượng phân tử t – PA Tissue plasminogen activator (các tác nhân hoạt hóa plasminogen ở mô) DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1: Các phương pháp đánh giá hoạt tính Nattokinase 6 Bảng 1.2: Thực phẩm chức năng chứa Nattokinase 11 Bảng 1.3: Sản phẩm protease ngoại bào của chi Bacillus 15 Bảng 1.4: Các nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào của B. Subtilis 16 Bảng 1.5: Một số nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào của B. subtilis natto 18 Bảng 2.1: Nguyên liệu và hóa chất 20 Bảng 2.2: Thiết bị được sử dụng 21 Bảng 2.3: Một số công thức sử dụng trong kết quả thực nghiệm 31 Bảng 3.1: Sơ bộ thử hoạt tính các enzyme trong dịch nuôi cấy B. subtilis natto 33 Bảng 3.2: Đường kính vòng phân giải casein của dịch lên men khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ sung các nguồn hydratcarbon khác nhau 34 Bảng 3.3: Đường kính vòng phân giải tinh bột và CMC của dịch lên men khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ sung các nguồn hydratcarbon khác nhau 35 Bảng 3.4: Thời gian tiêu fibrin của dịch lên men thu được khi nuôi cấy trong môi trường có bổ sung các nguồ n hydratcarbon khác nhau 36 Bảng 3.5: Đường kính vòng phân giải casein của dịch lên men khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và MT2 có bổ sung maltose ở các nồng độ khác nhau 37 Bảng 3.6: Đường kính vòng phân giải tinh bột và CMC của dịch lên men khi nuôi cấy trong môi trường MT2 có bổ sung maltose ở các nồng độ khác nhau 37 Bảng 3.7: Đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch lên men khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường MT2 có bổ sung đậu tương và casein 38 Bảng 3.8: Đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch lên men khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và MT2 có bổ sung muối vô cơ 39 Bảng 3.9: Đường kính vòng phân giải cơ chất của dịch lên men khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường kết hợp 40 Bảng 3.10: Thời gian tiêu fibrin của dịch lên men thu được khi nuôi cấy trong môi trường MT2 và môi trường kết hợp 41 Bảng 3.11: Đường kính vòng phân giải casein của dịch trong ở các pH khác nhau 42 Bảng 3.12: Kết quả thử hoạt tính phân giải cơ chất và thời gian tiêu fibrin của enzyme protease ngoại bào thu được khi kết tủa bằng các tác nhân khác nhau 44 Bảng 3.13: Giá trị mật độ quang của dung dịch protein đã biết nồng độ 44 Bảng 3.14: Kết quả đường kính vòng phân giải casein, tinh bột, CMC của các dịch enzyme khi chiết tách với các nồng độ amoni sulfat bão hòa khác nhau 46 Bảng 3.15: Kết quả định lượng protein và xác định hoạt độ protease của các dịch enzyme khi chiết tách với các nồng độ amoni sulfat bão hòa khác nhau 47 Bảng 3.16: Khả năng phân giải casein, nồng độ protein và hoạt độ protease của các dịch enzyme thu được theo quy trình kết tủa phân đoạn 48 [...]... protease từ vi khuẩn Bacillus subtilis natto được thực hiện với 2 mục tiêu: 1 Nghiên cứu được ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy đến khả năng tạo enzyme protease của Bacillus subtilis natto 2 Chọn được phương pháp tách chiết và thử hoạt tính tiêu fibrin của enzyme protease thu được 1 Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 Vi khuẩn Bacillus subtilis natto Bacillus subtilis natto (còn được gọi là Bacillus subtilis. .. nhiều enzyme ngoại bào như protease, amylase, cellulase Vi c thay đổi môi trường dinh dưỡng có thể ảnh hưởng đến sự sinh enzyme của vi khuẩn Vì thế, lựa chọn môi trường tốt nhất cho B subtilis natto sinh lượng lớn protease và giảm bớt các enzyme khác đóng vai trò quan trọng trong vi c tách chiết protease, trong đó có Nattokinase Vì vậy, luận văn Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và chiết enzyme protease từ. .. hiện ra trong Natto có chứa Nattokinase – một enzyme thuộc nhóm các enzyme protease có khả năng phân giải fibrin [28] Từ đó đến nay, nhiều nghiên cứu về B subtilis natto đã được tiến hành và kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này có khả năng sinh ra nhiều enzyme nhóm protease như Nattokinase [21], elastase [27], bacillopeptidase F [57]… Trong điều kiện lên men chìm, vi khuẩn B subtilis natto có khả năng... và biểu hiện gen mã hóa subtilisin từ các chủng B subtilis G1 và RD23 trong E coli BL21/pESUb [11] Tuy vậy, số lượng công trình nghiên cứu về vi c chiết xuất và tinh chế Nattokinase từ môi trường lên men B subtilis natto còn rất hạn chế 19 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 2.1.1 Vi sinh vật sử dụng B subtilis natto (Chủng Nhật Bản được lưu giữ tại phòng Vi. .. tổng hợp enzyme bị giảm rõ rệt [4],[8] d Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Thời gian nuôi cấy thích hợp của mỗi loại vi sinh vật được xác định bằng thời gian cho phép tích tụ enzyme tối đa Thời gian đó phụ thuộc vào từng chủng vi sinh vật và ít phụ thuộc vào enzyme chúng tổng hợp Ngoài ra, tùy từng loại vi khuẩn mà ta lựa chọn điều kiện cấp khí và độ ẩm cho phù hợp [4],[8] 12 1.3.2 Các nghiên cứu về ảnh... [10] Các endoprotease có nhóm OH của Ser đóng vai trò quan trọng trong hoạt động xúc tác được gọi là protease serin Trong protease serin có hai họ được nghiên cứu nhiều là: chymotrypsin và subtilisin Đa số protease họ subtilisin có nguồn gốc từ vi khuẩn như: subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN [10],[24] b Protease ngoại bào của chi Bacillus và các phương pháp chiết tách Chi Bacillus là chi vi sinh vật... pepton từ đậu nành: 3% [50] b Trong nước Lê Thị Bích Phượng và cộng sự (2012) đã phân lập được hai chủng Bacillus sp.7.2 và Bacillus sp.NP3 có khả năng sinh tổng hợp enzyme Nattokinase 470 FU/g trên môi trường đậu nành hấp chín ở điều kiện nuôi cấy trên đĩa petri và trên khay từ một số chủng Bacillus spp lấy từ bộ sưu tập giống của Vi n Sinh học nhiệt đới và phân lập từ thực phẩm Natto [9] 1.3.3 Protease. .. có nguồn gốc từ vi sinh vật cũng đang được nghiên cứu để tìm ra các phương pháp tách chiết tối ưu Một trong số các loài vi sinh vật có khả năng sinh ra protease và được ứng dụng nhiều là vi khuẩn thuộc chi Bacillus [24] Vi khuẩn B subtilis natto thuộc chi Bacillus, loài Bacillus subtilis được biết đến là “nguyên liệu” ủ cùng với đậu tương nấu chín, lên men tạo nên món ăn truyền thống Natto của Nhật... var natto) là một chủng thuộc loài Bacillus subtilis, được giáo sư Sawamura phân lập và định danh lần đầu tiên vào năm 1905 [24] 1.1.1 Phân loại khoa học Bacillus subtilis natto là một vi khuẩn thật (Eurobacteria) thuộc: Họ (Family): Bacillaceae, chi (Genus): Bacillus, loài (Species): Bacillus subtilis, phân loài (Subspecies): Bacillus subtilis natto [18],[24] Khi mới được phát hiện ra, B subtilis natto. .. từ thực phẩm Natto [9] 1.3.3 Protease và phương pháp chiết tách protease ngoại bào của vi sinh vật 1.3.3.1 Protease và chiết tách protease ngoại bào của vi sinh vật thuộc chi Bacillus Hiện nay, các enzyme vi sinh vật được sử dụng ngày càng phổ biến trong nhiều lĩnh vực; trong số đó có các enzyme nhóm protease a Khái niệm về protease Nhóm enzyme protease là các enzyme xúc tác quá trình thủy phân liên . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH THU HƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ CHIẾT ENZYM PROTEASE TỪ VI KHUẨN Bacillus subtilis natto . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH THU HƯƠNG NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ CHIẾT ENZYM PROTEASE TỪ VI KHUẨN Bacillus subtilis natto LUẬN. subtilis natto sinh lượng lớn protease và giảm bớt các enzyme khác đóng vai trò quan trọng trong vi c tách chiết protease, trong đó có Nattokinase. Vì vậy, luận văn Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy và