BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHAN LÊ BÌNH MAI ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG TRÌNH TỰ ADN RIBOSOM ITS CỦA BA LOÀI DƯỢC LIỆU CHỨA BERBERIN HỌ RUTACEAE Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHAN LÊ BÌNH MAI ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG TRÌNH TỰ ADN RIBOSOM ITS CỦA BA LOÀI DƯỢC LIỆU CHỨA BERBERIN HỌ RUTACEAE Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH HÓA SINH DƯỢC 60720408 Người hướng dẫn khoa học: TS. Phùng Thanh Hương HÀ NỘI 2014 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới cô giáo hướng dẫn luận văn của tôi, Tiến sĩ Phùng Thanh Hương, đã tạo mọi điều kiện, động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành tốt luận văn “Đánh giá sự đa dạng trình tự ADN ribosom ITS của ba loài dược liệu chứa berberin họ Rutaceae ở Việt Nam”. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới Thạc sĩ Hà Thu. Trong suốt quá trình nghiên cứu, chị đã kiên nhẫn hướng dẫn, trợ giúp và động viên tôi rất nhiều. Sự hiểu biết sâu sắc về khoa học, cũng như kinh nghiệm của hai người thầy chính là tiền đề giúp tôi đạt được những thành tựu và kinh nghiệm quý báu. Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, tạo điều kiện của tập thể lãnh đạo, cán bộ Phòng Vi sinh phân tử - Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam ; Ban Giám Hiệu, bộ môn Hóa sinh, phòng Sau đại học, phòng Đào tạo trường Đại học Dược Hà Nội. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành về sự giúp đỡ này. Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã động viên, khích lệ, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn! MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ẢNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương I. TỔNG QUAN 3 1.1. Tổng quan về vùng phiên mã nội thuộc ADN ribosom nhân (ITS- rADN) 3 1.1.1. Cấu trúc của AND ribosom nhân 3 1.1.2. Cấu trúc của ITS-rADN nhân 4 1.1.3. Vai trò của ITS-rADN nhân 7 1.1.4. Ứng dụng của ITS-rADN trong nghiên cứu cây thuốc 7 1.2. Tổng quan về berberin 9 1.3. Các dược liệu chứa berberin ở Việt Nam và thế giới 11 1.4. Ba loài dược liệu là đối tượng nghiên cứu của đề tài 15 1.4.1. Dấu dầu xoan (Tetradium glabrifolium) 15 1.4.2. Xít xa (Toddalia asiatica) 17 1.4.3. Muồng truổng (Zanthoxylum avicennae) 19 Chương II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1. Đối tượng nghiên cứu 21 2.2. Hóa chất, sinh phẩm 22 2.3. Trang thiết bị 23 2.4. Phương pháp nghiên cứu 23 2.4.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số 25 2.4.2. Phương pháp khuếch đại ADN bằng PCR 25 2.4.3. Phương pháp điện di ADN trên gel agarose 27 2.4.4. Phương pháp tách dòng 27 2.4.5. Phương pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào khả biến E.coli chủng TOP10F’ 28 2.4.6. Phương pháp tách chiết ADN plasmid từ vi khuẩn. 29 2.4.7. Phương pháp cắt ADN bằng enzym giới hạn 30 2.4.8. Phương pháp tinh sạch ADN plasmid 30 2.4.9. Phương pháp giải trình tự ADN 31 2.4.10. Phương pháp so sánh trình tự ADN 32 Chương III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33 3.1. Kết quả giải trình tự ITS-rADN loài Muồng truổng 33 3.1.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số của các mẫu Muồng truổng 33 3.1.2. Kết quả khuếch đại ADN bằng PCR của các mẫu Muồng truổng 34 3.1.3. Kết quả chọn dòng gen ITS-rADN của các mẫu Muồng truổng 35 3.1.4. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rADN của các mẫu Muồng truổng 37 3.1.5. Kết quả so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN của các mẫu Muồng truổng 41 3.1.6. Cây phân loại trình tự ITS-rADN của 10 mẫu Muồng truổng 46 3.2. Kết quả giải trình tự ITS-rADN loài Xít xa 47 3.2.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số của các mẫu Xít xa 47 3.2.2. Kết quả khuếch đại ADN bằng PCR của các mẫu Xít xa 48 3.2.3. Kết quả chọn dòng gen ITS-rADN của các mẫu Xít xa 49 3.2.4. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rADN của các mẫu Xít xa 51 3.2.5. Kết quả so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN của các mẫu Xít xa 52 3.2.6. Cây phân loại trình tự ITS-rADN của 3 mẫu Xít xa 55 3.3. Kết quả giải trình tự ITS-rADN loài Dấu dầu xoan 55 3.3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số của các mẫu Dấu dầu xoan 55 3.3.2. Kết quả khuếch đại ADN bằng PCR của các mẫu Dấu dầu xoan 57 3.3.3. Kết quả chọn dòng gen ITS-rADN của các mẫu Dấu dầu xoan 58 3.3.4. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rADN của các mẫu Dấu dầu xoan 60 3.3.5. Kết quả so sánh trình tự nucleotid vùng ITS-rADN của các mẫu Dấu dầu xoan 63 3.3.6. Cây phân loại trình tự ITS-rADN của 5 mẫu Dấu dầu xoan 66 Chương IV. BÀN LUẬN 68 4.1. Về quy trình xác định trình tự ITS-rADN 68 4.2. Về sự đa dạng di truyền của loài Muồng truổng ở Việt Nam 70 4.3. Về sự đa dạng di truyền của loài Xít xa ở Việt Nam 71 4.4. Về sự đa dạng di truyền của loài Dấu dầu xoan ở Việt Nam 72 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 75 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT A,T,G,C Adenin, Thymin, Guanin, Cytosin ADN Acid deoxyribonucleic AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism bp Base pair dNTP Deoxyribonucleotid triphosphat COX Cylco oxygenase C-FLIP Cellular FLICE like inhibitory protein DMH Dimethyl hydrazine DSS Dextran sodium sulfate E.coli Escherichia coli EDTA Ethylen Diamin Tetra acetic Acid EtBr Ethidium Bromid ETS External transcribed spacer IGS Intergenic spacer ITS Internal Transcribed Spacer (Vùng phiên mã nội) ITS-rADN Internal Transcribed Spacer – ribosomal ADN (Trình tự ADN ribosom đoạn ITS) LB Luria-Bertani LSU Large subunit MCL-1 Myeloid cell leukemia – 1 NTS Non-transcribed spacer PCR Polymerase Chain Reaction rADN ADN mã hóa cho ARN ribosom RAPD Random Amplified Polymorphic DNA RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism ROS Reactive oxygen species SSU Small subunit TAE Tris - Acetic acid – EDTA Taq Thermus aquaticus TRAIL Tumor necrosis factor related apoptosis including ligand X-gal 5-bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactosid DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Kích thước và phần trăm G+C của vùng ITS1 và ITS2 của một số loài thực vật hạt kín 5 Bảng 1.2. Các loài chứa berberin ở Việt Nam 12 Bảng 1.3. Trình tự gen đã được công bố trên NCBI của Tetradium glabrifolium 16 Bảng 1.4. Trình tự gen đã được công bố trên NCBI của Toddalia asiatica 18 Bảng 1.5. Trình tự gen đã được công bố trên NCBI của Zanthoxylum avicennae 20 Bảng 2.1. Danh sách địa điểm thu hái mẫu 21 Bảng 2.2. Cặp mồi dùng trong phản ứng PCR 22 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR 26 Bảng 2.4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 26 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng tạo vector tái tổ hợp 27 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng cắt plasmid 30 Bảng 2.7. Thành phần phản ứng tổng hợp 31 Bảng 2.8. Chu trình nhiệt phản ứng đọc trình tự 32 Bảng 3.1. Kết quả kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ ADN tổng số của 10 mẫu Muồng truổng 34 Bảng 3.2. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rADN của 10 mẫu Muồng truổng 38 Bảng 3.3. Tỉ lệ %(G+C) và kích thước vùng ITS-rADN của 10 mẫu Muồng truổng 41 Bảng 3.4. Hệ số tương đồng trình tự vùng ITS-rADN giữa 10 mẫu Muồng truổng 45 Bảng 3.5. Kết quả kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ ADN tổng số của 3 mẫu Xít xa 48 Bảng 3.6. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rADN của 3 mẫu Xít xa 51 Bảng 3.7. Tỉ lệ %(G+C) và kích thước vùng ITS-rADN của 3 mẫu Xít xa 52 Bảng 3.8. Hệ số tương đồng trình tự vùng ITS-rADN giữa 3 mẫu Xít xa 54 Bảng 3.9. Kết quả kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ ADN tổng số của 5 mẫu Dấu dầu xoan 57 Bảng 3.10. Kết quả giải trình tự vùng ITS-rADN của 5 mẫu Dấu dầu xoan 61 Bảng 3.11. Tỉ lệ %(G+C) và kích thước vùng ITS-rADN của 5 mẫu Dấu dầu xoan 63 Bảng 3.12. Hệ số tương đồng trình tự vùng ITS-rADN giữa 5 mẫu Dấu dầu xoan 66 [...]... nhất là trình tự vùng phiên mã nội thuộc ADN ribosom nhân (ITS- rADN) do nhiều ưu điểm về cả giá trị khoa học và khả năng áp dụng thực tế Do đó, trong đề tài này, 1 chúng tôi tiến hành nghiên cứu về trình tự ITS- rADN nhân của 3 loài dược liệu chứa berberin họ Rutaceae ở Việt Nam với mục tiêu: - Xác định được trình tự ITS- rADN nhân của các mẫu thu hái thuộc 3 loài dược liệu chứa berberin ở Việt Nam gồm:... xoan (Tetradium glabrifolium) - So sánh độ tương đồng trình tự ITS- rADN nhân giữa các mẫu thu được của mỗi loài trong 3 loài nói trên để đánh giá sự đa dạng di truyền của dược liệu chứa berberin họ Rutaceae ở Việt Nam 2 Chương I TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về vùng phiên mã nội thuộc ADN ribosom nhân (ITS- rADN nhân) 1.1.1 Cấu trúc của ADN ribosom nhân ADN ribosom (rADN) là các gen mã hóa rARN nằm trong nhân... vùng bảo thủ cao, với sự biến đổi rất ít trong trình tự ở tất cả các loài Trong các mẫu nghiên cứu, 11 mẫu có trình tự tương đồng hoàn toàn 100% với trình tự ADN của loài C javanica trên GenBank, 1 mẫu có trình tự tương đồng hoàn toàn với trình tự ADN của loài C tangshen trên GenBank [9] Trong lĩnh vực nhận diện dược liệu, nghiên cứu của Xing GUO và cộng sự cho thấy vùng gen ITS cung cấp số lượng thông... đánh giá sự tương đồng trình tự ADN, dùng các phần mềm chuyên dụng tạo ra các cây tiến hóa loài, đánh giá đa dạng di truyền trong phạm vi một bậc phân loại [12] 1.1.4 Ứng dụng của ITS- rADN trong nghiên cứu cây thuốc Với những ưu điểm nổi trội trên, giá trị dữ liệu về trình tự vùng ITS được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu phát sinh loài, đánh giá đa dạng di truyền hay nhận diện dược liệu Chi Zanthoxylum... thấy berberin có ở 20 loài thực vật thuộc 5 họ khác nhau là Berberidaceae, Menispermaceae, Ranunculaceae, Rutaceae, Papaveraceae (Bảng 1.2) 11 Bảng 1.2 Các loài chứa berberin ở Việt Nam Hàm TT Tên Tên khoa cây học Bộ phận Họ chứa berberin lượng Hàm Tài alcaloid lượng liệu toàn phần berberin tham (%) khảo (%) 1 Hoàng liên gai Hoàng 2 liên Kloss Berberis wallichiana Mahonia klossi Bak f liên lá baelii... đó giải thích quan hệ giữa các loài trong chi Zanthoxylum [62] Một số nghiên cứu ở Việt Nam gần đây trong lĩnh vực cây thuốc bắt đầu hướng vào phân tích tính đa dạng sinh học ở cấp độ phân tử, dựa trên chỉ thị RAPD hoặc ADN ribosom ITS Nghiên cứu của Nguyễn Thị Thanh Nga cho thấy trình tự ADN vùng gen ITS của 12 mẫu dược liệu thuộc chi Đẳng Sâm có chiều dài giữa các loài dao động từ 638 đến 650 bp,... thực vật Vùng ITS có 3 phần: ITS1 , ITS2 và vùng có tính bảo tồn cao là 5,8S nằm giữa (hình 1.2.) Vùng ITS Hình 1.2 Cấu trúc của vùng ADN ribosom ITS [15] Ở một số loài thực vật có hoa, kích thước của vùng ITS1 và ITS2 thường nhỏ hơn 300 bp (ITS1 : 187-298 bp; ITS2 : 187-252 bp) Vùng tiểu phân 5,8S có kích thước không đổi là 163-164 bp Ở thực vật, kích thước của vùng ITS xấp xỉ 650-750 bp ở thực vật hạt... lượng berberin; phân tích đa dạng di truyền nguồn gen Trong phạm vi đề tài luận văn cao học, chúng tôi tiến hành một phần nhỏ trong dự án, tập trung vào phân tích đa dạng di truyền các loài chứa berberin họ Rutaceae ở Việt Nam Hiện nay, trong các nghiên cứu về đa dạng di truyền, quan hệ tiến hóa trên thế giới, nhiều chỉ thị phân tử đã và đang được áp dụng rộng rãi làm tiêu chí đánh giá, trong đó, một trong... từ 60,3% đến 62,5%, có 113 điểm sai khác giữa các loài, chiếm 17,4% trên toàn bộ trình tự, trong đó có 51 sai khác được tìm thấy ở vùng ITS1 , 8 điểm ở vùng 5,8S và 53 điểm ở vùng ITS2 Trong đó sai khác trong nội loài từ 0,0-0,2%, sai khác giữa các loài khác nhau đạt đến 15,4% Nghiên cứu này kết luận sự đa hình trong trình tự nucleotid ở vùng ITS1 và ITS2 là rất cao, tại đây xảy ra các biến đổi lớn như... sàng Berberin được phát hiện trong 150 loài thuộc nhiều họ thực vật khác nhau, trong đó ở Việt Nam có: họ Mao lương (Ranunculaceae), họ Hoàng liên gai (Berberidaceae), họ Tiết dê (Menispermaceae), họ Cam (Rutaceae) , họ Anh túc (Papaveraceae) Với các giá trị làm thuốc rất lớn và tính chất quý hiếm của các loài trên, chúng đã và đang được khai thác triệt để để làm thuốc, chiết xuất và buôn bán ở thị . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHAN LÊ BÌNH MAI ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG TRÌNH TỰ ADN RIBOSOM ITS CỦA BA LOÀI DƯỢC LIỆU CHỨA BERBERIN HỌ RUTACEAE Ở VIỆT. BÌNH MAI ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG TRÌNH TỰ ADN RIBOSOM ITS CỦA BA LOÀI DƯỢC LIỆU CHỨA BERBERIN HỌ RUTACEAE Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH HÓA SINH DƯỢC 60720408 . trình tự ITS- rADN 68 4.2. Về sự đa dạng di truyền của loài Muồng truổng ở Việt Nam 70 4.3. Về sự đa dạng di truyền của loài Xít xa ở Việt Nam 71 4.4. Về sự đa dạng di truyền của loài Dấu