BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM QUỐC HUY BÀO CHẾ VÀ TIÊU CHUẨN HÓA CAO ĐẶC BÀI THUỐC TESTIN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM QUỐC HUY BÀO CHẾ VÀ TIÊU CHUẨN HÓA CAO ĐẶC BÀI THUỐC TESTIN LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC DƯỢC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 60720406 Người hướng dẫn khoa học: TS. HÀ VÂN OANH PGS.TS VŨ VĂN ĐIỀN HÀ NỘI 2014 LỜI CẢM ƠN Vi lòng bic, tôi xin gi li c ti cô giáo TS. Hà Vân Oanh và thy giáo PGS.TS. Vũ Văn Điền (B c hc c truyn  ng i hc Hà Ni). Cô và thy  bên tn tình dìu dt, ch bng dn ng viên tôi trong sut quá trình nghiên cu và hoàn thành lu. i toàn th thy cô, các anh ch k thut viên ca b môn c hc c truyn - i hc Hà N tôi trong quá trình thc hi tài. Tôi xin gi li ci TS. Đỗ Thị Hà, Dược sĩ Lê Thị Loan , ch, em k thut viên ca Khoa Hóa thc vt  Vic liu luôn to u kin giúp ng dn tôi trong sut quá trình nghiên cu ti vin. Tôi xin gi li ci Khoa kim nghim Vi sinh và Khoa kim nghim  dc  c liu, Vin kim nghim thu tôi hoàn thành lu Xin gi li ci Dược sĩ Đỗ Thùy Linh khóa 64  ng i hc Hà Ni  tài ti b c hc c truyn  i hc Hà N tôi trong thi gian nghiên cu và thc hi Cui cùng tôi xin gi li ci nh và toàn th ng nghip ti Trung tâm kim nghim Thuc  M phm  Thc phm Hi  ng h tôi trong trong suc hi  Tôi xin chân thành c Hà Nội, tháng 08 năm 2014  Phạm Quốc Huy MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1. Thông tin về bài thuốc TESTIN và các vị thuốc trong bài thuốc. 2 1.1.1. Thông tin về bài thuốc TESTIN 2 1.1.2 Thông tin về các vị thuốc trong bài thuốc. 3 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu 17 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 18 2.2.1. Điều chế cao đặc 18 2.2.2. Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cao đặc 18 2.3. Dự kiến tiêu chuẩn cao đặc 20 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 21 3.1 Điều chế cao. 21 3.1.1. Xác định độ ẩm của dƣợc liệu 21 3.1.2. Điều chế cao đặc 22 3.1.3. Tính hiệu suất chiết cao 24 3.2 Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc. 26 3.2.1. Các chỉ tiêu hóa lý 26 3.2.2. Định tính một số nhóm chất chính trong cao đặc. 30 3.2.3. Kiểm tra các vị thuốc trong cao đặc bằng SKLM 31 3.2.4. Kiểm tra giới hạn nhiễm khuẩn 36 3.2.5. Kiểm tra giới hạn kim loại nặng 37 3.2.6. Định lƣợng một số hợp chất trong cao đặc bằng phƣơng pháp HPLC 38 3.2.7. Xác định dấu vân tay và định lƣợng một số thành phần trong viên nang Testin. 55 3.8. Dự kiến tiêu chuẩn cao đặc bài thuốc 58 3.8.1. Yêu cầu kỹ thuật 58 3.8.3. Đóng gói, bảo quản 62 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 63 4.1. Kiểm tra chất lƣợng các vị thuốc đầu vào nghiên cứu 63 4.2. Vai trò của các vị dƣợc liệu trong bài thuốc và các chất chọn để phân tích 63 4.3. Điều chế cao đặc 63 4.4. Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cao đặc bài thuốc 64 4.4.1. Định tính các nhóm chất trong cao đặc 64 4.4.2. Kiểm tra các vị thuốc trong cao bằng SKLM 64 4.4.3. Định lƣợng 2 thành phần Imperatorin và Osthole bằng phƣơng pháp HPLC 65 4.4.4. Giới hạn nhiễm khuẩn 65 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 67 Kết luận 67 Kiến nghị 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CĐ Cao đặc DD Dung dịch DĐVN IV Dược điển Việt Nam 4 HPLC High performance liquid chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) LOD Limit of detection (Giới hạn phát hiện) LOQ Limit of quantitation (Giới hạn định lượng) PL Phụ lục RSD Relative standard deviation (Độ lệc chuẩn tương đối) SD Standard deviation (Độ lệc chuẩn) SKĐ Sắc ký đồ SKLM Sắc ký lớp mỏng STT Số thứ tự TB Trung bình YHCT Y học cổ truyền CFU Colony Forming Unit (Số đơn vị khuẩn lạc) DANH MỤC HÌNH Hình 3.1. Sơ đồ bào chế cao đặc theo phương pháp chiết hồi lưu. 26 Hình 3.2. SKĐ của cao đặc và Bá Bệnh 34 Hình 3.3. SKĐ của cao đặc và Bạch tật lê 34 Hình 3.4. SKĐ của cao đặc và Xà sàng tử 35 Hình 3.5. SKĐ của cao đặc và Hoàng kỳ 35 Hình 3.6. SKĐ của cao đặc và Đương quy 35 Hình 3.7. SKĐ của cao đặc và Cốt khí củ 35 Hình 3.8. SKĐ của cao đặc và Câu kỷ tử 36 Hình 3.9. SKĐ của cao đặc và Ba kích 36 Hình 3.10. Sắc ký đồ của chương trình 1 41 Hình 3.11. Sắc ký đồ của chương trình 2 42 Hình 3.12. Sắc ký đồ của chương trình 3 42 Hình 3.13. Sắc ký đồ của chương trình 4 43 Hình 3.14. Sắc ký đồ của chương trình 5 43 Hình 3.15. Sắc ký đồ của chương trình 6 44 Hình 3.16. Sắc ký đồ của chương trình 7 44 Hình 3.17. Sắc ký đồ của hỗn hợp các chất chuẩn 45 Hình 3.18. Sắc ký đồ của hỗn hợp các chất chuẩn và cao đặc ở bước sóng 305 nm 46 Hình 3.19. Sắc ký đồ của hỗn hợp các chất chuẩn và cao đặc ở bước sóng 243 nm 47 Hình 3.20. Đồ thị của Piceid 49 Hình 3.21. Đồ thị của 8- methoxyproralen 50 Hình 3.22. Đồ thị của Imperatorin 50 Hình 3.22. Đồ thị của Osthole 50 Hình 3.23. Sắc ký đồ của hỗn hợp các chất chuẩn, cao bài thuốc và viên nang Testin ở bước sóng 305 nm 54 Hình 3.24. Sắc ký đồ của hỗn hợp các chất chuẩn, cao bài thuốc và viên nang Testin ở bước sóng 305 nm 55 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Hóa chất, dung môi 17 Bảng 2.2. Trang thiết bị sử dụng trong phân tích 18 Bảng 3.1. Độ ẩm của các dược liệu 22 Bảng 3.2. Độ ẩm của cao đặc 24 Bảng 3.3. Hiệu suất bào chế cao đặc 25 Bảng 3.4. Độ ẩm cao đặc 40% bào chế theo phương pháp chiết hồi lưu 27 Bảng 3.5. Hàm lượng chất chiết được bằng nước trong cao đặc 28 Bảng 3.6. pH của cao đặc 29 Bảng 3.7. Tro toàn phần của cao đặc 30 Bảng 3.8. Tóm tắt kết quả định tính một số nhóm chất của cao đặc bài thuốc 30 Bảng 3.9. Giới hạn nhiễm khuẩn của cao đặc 36 Bảng 3.10. Giá trị λmax của các hợp chất trong cao bài thuốc 40 Bảng 3.11. Chương trình dung môi 41 Bảng 3.12. Kết quả xác định khoảng tuyến tính của một số hợp chất trong cao đặc 49 Bảng 3.13. Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 51 Bảng 3.14. Độ đúng của phương pháp 52 Bảng 3.15. Độ lặp lại về thời gian lưu trong ngày và giữa các ngày 52 Bảng 3.16. Độ thu hồi của phương pháp đối với một số hợp chất 53 Bảng 3.17. Kết quả định lượng Piceid và 8-methoxypsoralen 54 Bảng 3.18. Kết quả định lượng Imperatorin và Osthole 54 Bảng 3.19. Kết quả định lượng một số chất trong viên nang Testin 57 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, chứng suy giảm chức năng sinh dục ở nam giới ngày càng gia tăng, nhất là các nước phát triển. Cường độ làm việc tăng cao, gây stress năng; sự ô nhiễm môi trường, ô nhiễm thực phẩm, tiếp xúc nhiều với hóa chất; sự phát triển mạnh của các thiết bị có từ trường mạnh … đều góp phần làm tăng tỷ lệ vô sinh không trong xã hội. [1], [7]. Theo y học cổ truyền, các biểu hiện của suy sinh dục muộn có thể được sắp xếp thành các dạng bệnh danh khác nhau như: liệt dương (dương nuy), di tinh, xuất tinh sớm gọi là chứng hoạt tinh, suy giảm (hoặc không) có tinh trùng dẫn đến vô sinh được gọi là chứng nam tử bất dục. Nhìn chung, mọi nguyên nhân của suy giảm sinh dục đều được xem là có nguồn gốc tại “thận” và có thể chia ra các thể như: Thận khí hư nhược, tiên thiên bất túc, phòng dục quá độ làm hao tổn thận tinh. Thận âm hư dẫn đến thận tinh hư tổn, dương vật không đủ độ cương cứng, xuất tinh sớm, tinh trùng ít, thiểu năng sinh dục. Mệnh môn hỏa suy gây liệt dương, xuất tinh sớm, chất lượng tinh trùng kém Ngoài ra, khí huyết lưỡng hư (tâm tỳ hư), can uất khí trệ huyết ứ, đàm thấp ứ trệ, thấp nhiệt hạ tiêu cũng là nguyên nhân của suy tinh trùng, thiểu năng sinh dục, khó có con [9], [11],[25]. Thuốc điều trị chứng bệnh này còn hạn chế, nhất là các thuốc có nguồn gốc thảo dược. nhằm hỗ trợ điều trị suy giảm chức năng sinh dục nam PGS.TS Vũ Văn Điền xây dựng bài thuốc Testin có nguồn gốc thảo dựa trên cơ sở lý luận của y học cổ truyền, tính năng, tác dụng dược lý và thành phần hóa học của các vị thuốc. Qua thử nghiệm dược lý bước đầu xác định cao đặc chiết từ ethanol 40% có tác dụng khả quan [15],[18], bài thuốc đang được tiếp tục nghiên cứu đầy đủ hơn thuộc đề tài cấp thành phố. Cao đặc là sản phẩm trung gian để nghiên cứu đánh giá dược lý, độc tính, để đưa cao đặc vào quá trình sản xuất thành dạng bào chế tiện dùng cần phải được tiêu chuẩn hóa. Do đó chúng tôi tiến hành đề tài: “Bào chế và tiêu chuẩn hóa cao đặc bài thuốc Testin" với 2 mục tiêu: - Bào chế cao đặc bài thuốc Testin. - Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa cao đặc. [...]... [4] 16 CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu A Cao đặc được chiết từ 8 vị dược liệu trong bài thuốc TESTIN, các vị dược liệu đã được kiểm định và đạt theo tiêu chuẩn DĐVN IV Riêng Bá Bệnh hiện chưa có tiêu chuẩn trong DĐVN IV B Viên nang Testin đã được bào chế [10] - Các hóa chất sử dụng đạt tiêu chuẩn phân tích Bảng 2.1 Hóa chất, dung môi Hóa chất, dung môi STT Xuất... hữu cơ: Căn cứ vào các nhóm chất có trong các vị thuốc của bài thuốc để định hướng định tính Tiến hành các phản ứng định tính với các thuốc chung và thuốc thử đặc hiệu của từng nhóm chất theo phương pháp thường quy được ghi trong các tài liệu hóa thực vật [4], [5] - Định tính các vị thuốc trong cao đặc bằng SKLM: Chiết riêng từng vị thuốc với lượng tương ứng có trong 1 g cao đặc của bài thuốc với cùng... dung dịch 1% (kl/tt) cao đặc bằng máy đo pH Thử theo Phụ lục 6.2 – DĐVN IV - Kiểm tra độ nhiễm khuẩn: Thử theo Phụ lục 13.6 – DĐVN IV 19 - Kiểm tra giới hạn kim loại nặng: Thử theo Phương pháp 3, Phụ lục 9.4.8 – DĐVN IV 2.3 Dự kiến tiêu chuẩn cao đặc Dựa vào kết quả nghiên cứu, và căn cứ vào quy trình xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao thuốc để đự kiển tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao thuốc 20 CHƢƠNG 3 KẾT... Mỹ Và các dụng cụ, thiết bị khác 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Điều chế cao đặc - Điều chế cao ethanol bằng phương pháp chiết hồi lưu với dung môi là ethanol 40% - Điều chế cao đặc bằng phương pháp ngâm lạnh: với dung môi là ethanol 40% với 2 thời gian: ngâm lạnh 2 ngày và ngâm lạnh 3 ngày 2.2.2 Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cao đặc Qua thăm dò tác dụng dược lí của các loại cao thấy rằng cao điều... [TLTK], chúng tôi thấy cao đặc chiết theo 3 phương pháp trên đều có tác dụng khả quan, nhưng cao đặc chiết theo 25 phương pháp hồi lưu cho hiệu suất cao, và tiết kiệm thời gian, phù hợp nhất với thời gian nghiên cứu của đề tài Do vậy, nên chúng tôi chọn cao đặc chiết theo phương pháp chiết hồi lưu để sử dụng làm nguyên liệu trong nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cao đặc Sơ đồ bào chế cao đặc theo phương pháp... như hình 3.1 Hình 3.1 Sơ đồ bào chế cao đặc theo phương pháp chiết hồi lưu 3.2 Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cao đặc Nguyên liệu nghiên cứu: là mẫu cao được điều chế theo sơ đồ ở hình 3.1 26 3.2.1 Các chỉ tiêu hóa lý [7] 3.2.1.1 Hình thức, cảm quan - Độ đồng nhất: Cho một ít cao và dàn đều trên lam kính, đặt lamen ép sát Đem soi dưới kính hiển vi nhận thấy cao thuốc đồng nhất, không có kết... suất bào chế trung bình theo phần trăm cao khô tuyệt đối trên dược liệu khô tuyệt đối (kí hiệu H) theo công thức sau: ( ( ) Trong đó ) x100 m1 : Khối lượng dược liệu khô tuyệt đối (m1 = 442,649 g) m2: Khối lượng cao đặc (g) X: Độ ẩm của cao đặc (%) Kết quả được trình bày ở bảng 3.3 Bảng 3.3 Hiệu suất bào chế cao đặc Mẫu Khối lượng Độ ẩm cao Hiệu suất Hiệu suất cao – m2 (g) STT đặc (%) (%) TB (%) Cao. .. Lấy 1g cao đặc hòa với 25 ml ethanol 40%, cao tan hoàn toàn - Màu sắc: Lấy khoảng 1 g cao lên tờ giấy trắng, quan sát thấy cao thuốc có màu nâu đen - Mùi (xác định bằng khứu giác): Cao thuốc có mùi thơm - Vị (xác định bằng vị giác): Cao thuốc có vị cay nhẹ, hơi ngọt 3.2.1.2 Mất khối lượng do làm khô [6] Tiến hành theo Phụ lục 9.6 – DĐVN IV Cân khoảng 1 g cao đặc cho vào chén sứ (đã cân bì), cho vào tủ...CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Thông tin về bài thuốc TESTIN và các vị thuốc trong bài thuốc 1.1.1 Thông tin về bài thuốc TESTIN Bài thuốc gồm các vị thuốc sau: - Bá bệnh (Radix Eurycomae longifoliae) 10g - Bạch tật lê (Fructus Tribuli terrestris) 12g - Xà sàng tử (Fructus Cnidii) 12g - Hoàng kỳ 14g... Xuất xứ bài thuốc: Bài thuốc do PGS.TS Vũ Văn Điền thiết kế + Cơ sở thiết kế bài thuốc: - Dựa vào lý luận của Y học cổ truyền về các bệnh do thận hư gây ra, trong đó đi sâu vào các chứng liên quan đến suy giảm sinh sản, sinh dục nam [4] - Dựa vào tính năng của các vị thuốc để chọn vị thuốc kê đơn cho phù hợp với điều trị bệnh suy giảm chức năng sinh sản nam [5], [25] - Dựa vào tác dụng dược lý và thành . Testin& quot; với 2 mục tiêu: - Bào chế cao đặc bài thuốc Testin. - Nghiên cứu tiêu chuẩn hóa cao đặc. 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Thông tin về bài thuốc TESTIN và các vị thuốc trong bài thuốc. 1.1.1 tính, để đưa cao đặc vào quá trình sản xuất thành dạng bào chế tiện dùng cần phải được tiêu chuẩn hóa. Do đó chúng tôi tiến hành đề tài: Bào chế và tiêu chuẩn hóa cao đặc bài thuốc Testin& quot;. SKĐ của cao đặc và Hoàng kỳ 35 Hình 3.6. SKĐ của cao đặc và Đương quy 35 Hình 3.7. SKĐ của cao đặc và Cốt khí củ 35 Hình 3.8. SKĐ của cao đặc và Câu kỷ tử 36 Hình 3.9. SKĐ của cao đặc và Ba