Đang tải... (xem toàn văn)
ĐẶT VẤN ĐỂ Khi xã hội ngày càng phát triển thì mô hình bệnh tật của con người càng trở nên phức tạp và nhu cầu chăm sóc sức khoẻ cũng ngày càng tăng lên. Nếu đơn thuần chỉ dựa vào những thuốc lâu đời có nguồn gốc từ dược liệu hay tổng họp vi sinh thì chưa đủ để đáp ứng được nhu cầu đó. Ngày nay, việc nghiên cứu tìm ra thuốc mới và đưa vào sử dụng trên lâm sàng là thành tựu của nhiều ngành khoa học như bào chế, hoá dược, vi sinh, dược lâm sàng...trong đó tổng hợp hoá dược đóng vai trò rất quan trọng. Được hình thành và phát triển trên cơ sở kĩ thuật tổng hợp hữu cơ, tổng hợp hoá dược đã trở thành một ngành khoa học chuyên biệt chuyên nghiên cứu tìm ra các loại thuốc mới phục vụ cho việc phòng và điều trị bệnh cho con người. Các thuốc có nguồn gốc tổng hợp hoá dược đóng vai trò không thể thiếu trong cuộc sống và chiếm một số lượng rất lớn. Để tìm được các hoạt chất có hiệu quả điều trị cao, ít độc tính và có thể ứng dụng trong điều trị, các nhà tổng hợp hoá dược thường dựa vào cấu trúc của các chất đang được dùng làm thuốc hoặc các chất có tác dụng sinh học triển vọng để tổng họp hoặc bán tổng họp tạo ra nhiều thuốc mới. Một số công trình nghiên cứu cho thấy indirubin và các dẫn chất có tác dụng sinh học rất đáng quan tâm như; kháng các dòng tế bào gây bệnh ung thư ở người, kháng nấm, kháng khuẩn... V ớ i m o n g m u ố n l à m p h o n g p h ú t h ê m c á c n g h i ê n c ứ u v ề t á c d ụ n g s i n h h ọ c của các dẫn chất indirubin, chúng tôi đã quyết định thực hiện đề tài: “Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của indirubin và dẫn chất” với các mục tiêu sau: 1. Tổng hợp indirubin và một số dẫn chất với các nhóm thế khác nhau tại vị trí C5, C7 2. Thử hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn và kháng tế bào ung thư của chất tổng hợp được.
Bộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI PHẠM THỊ HOA TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC • • • CỦA INDIRUBIN VÀ DẪN CHẤT KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Dược SỸ Người hướng dẫn: 1. TS. Nguyễn Hải Nam 2. DS. Nghiêm Thị Minh Nơi thực hiện: Bộ môn Hoá dược \CL HÀ NỘI - 2010 LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến: TS. Nguyễn Hải Nam, DS. Nghiêm Thị Minh, DS. Trần Phương Thảo - Bộ môn Hoả Dược - Trường Đại học Dược Hà Nội, những người thày đã trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt, chỉ bảo cho tôi trong quà trình thực hiện và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp. Tôi xỉn chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thày, các cô, các em kỹ thuật viên Bộ môn Hoá Dược đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khoả luận này. Trong quá trình thực hiện khoá luận, tôi cũng đã nhận được sự giúp đỡ rất nhiệt tình của các cán bộ Phòng Thí nghiệm trung tâm - Trường Đại học Dược Hà Nội; Phòng Sinh học - Viện Hoả học các hợp chất tự nhiên; Phòng Phân tích phổ - Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam cùng toàn thể các thày cô giáo trong trường, các phòng ban, thư viện. Tôi xin chân thành cảm ơn. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đĩnh và bạn bè - những người luôn sát cánh, động viên, khích lệ tôi trong cuộc sống và học tập. Hà nội, ngày 10 tháng 5 năm 2010 Sinh viên Phạm Thị Hoa MỤC LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐÈ 1 Chương 1, TỎNG QUAN 3 1.1. Tác dụng sinh học của indirubin và dẫn chất 3 1.2. Tổng họp indimbin và dẫn chất 5 1.2.1. Tổng hợp một số dẫn chất isatin 8 1.2.2. Tổng hợp một số dẫn chất indirubin 9 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 10 (NGUYÊN LIỆU, THIÉT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU) 2.1. Nguyên liệu, thiết bị, dụng cụ 10 2.1.1. Nguyên vật liệu 10 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ 10 2 .2 . Nội dung nghiên cứu 11 2 . 3 . P h ư ơ n g p h á p n g h i ê n c ứ u 1 1 2.3.1. Tổng họp hoá học và kiểm tra độ tinh khiết 11 2.3.2. Xác định cấu trúc 12 2.3.3. Thử tác dụng sinh học 12 Chương 3. THựC NGHIỆM, KÉT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 13 3.1.Hoáhọ c . 13 3.1.1. Tổng hợp hoá học 13 3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết 17 3.1.3. Xác định cấu trúc 19 3.2. Thử tác dụng sinh học 26 3.2.1. Thử tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 26 3.2.2. Thử tác dụng kháng các dòng tế bào ung thư người 30 3.3. Bàn luận 33 3.3.1. Tổng họp hoá học và xác định cấu trúc 33 3.3.2. Tác dụng sinh học 35 KÉT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1. Một số phương pháp tổng họp indirubin. 7 Bảng 2 : Hiệu suất và một số chỉ số hóa lý của indirubin và dẫn chất 17 Bảng 3: Giá trị Rf với hệ dung môi khai triển n-hexan/aceton (2:1) và 18 t°nc của 6 chất I-VI Bảng 4; số liệu phân tích phổ IR (em'*) 20 Bảng 5: số liệu phổ EI-MS của 6 chất tổng hợp được 22 Bảng 6: số liệu p h â n tích phổ *H-NMR 25 Bảng 7: Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm 29 Bảng 8 : Kết quả thử độc tính tế bào của các chất I, II, IV 32 DANH MỤC CÁC sơ ĐÒ Trang Sơ đồ 1 : Tổng họp indirubin theo phương pháp Baeyer 5 Sơ đồ 2: Tổng hợp indirubin theo phương pháp Rusell và Kaupp 6 Sơ đồ 3; Tổng hợp dẫn chất 5-bromoisatin 8 Sơ đồ 4: Tổng họp một số dẫn chất khác của isatin 8 Sơ đồ 5: Tổng hợp một số dẫn chất của indirubin 9 Sơ đồ 6 : Tổng họp các dẫn chất của i n d ir u b i n . 13 Sơ đồ 6 : Sơ đồ phân mảnh của chất II. 23 Sơ đồ 7: Sơ đồ phân mảnh của chất VI. 23 CHÚ GIẢI CÁC CHỮ VIẾT TẮT K562 DCM DMSO IC50 ‘h -n m r IR MS KLPT MDA-MB-231 DPT MIC v s v SKLM Tế bào ung thư bạch cầu Dicloromethan Dimethylsulfoxid Inhibitory Concentration 50 (Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào) ^H-Nuclear Magnetic Resonance Spectrometry (Phổ cộng hưỏng từ hạt nhân) Infrared spectrometry (Phổ hồng ngoại) Mass Spectrometry (Phổ khối lượng) Khối lượng phân tử Tế bào ung thư vú đã di căn của người Deoxypodophyllotoxin (Chất chuẩn dương tính) Minimal Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu) Vi sinh vật Sắc ký lóp mỏng ĐẶT VẤN ĐỂ Khi xã hội ngày càng phát triển thì mô hình bệnh tật của con người càng trở nên phức tạp và nhu cầu chăm sóc sức khoẻ cũng ngày càng tăng lên. Nếu đơn thuần chỉ dựa vào những thuốc lâu đời có nguồn gốc từ dược liệu hay tổng họp vi sinh thì chưa đủ để đáp ứng được nhu cầu đó. Ngày nay, việc nghiên cứu tìm ra thuốc mới và đưa vào sử dụng trên lâm sàng là thành tựu của nhiều ngành khoa học như bào chế, hoá dược, vi sinh, dược lâm sàng trong đó tổng hợp hoá dược đóng vai trò rất quan trọng. Được hình thành và phát triển trên cơ sở kĩ thuật tổng hợp hữu cơ, tổng hợp hoá dược đã trở thành một ngành khoa học chuyên biệt chuyên nghiên cứu tìm ra các loại thuốc mới phục vụ cho việc phòng và điều trị bệnh cho con người. Các thuốc có nguồn gốc tổng hợp hoá dược đóng vai trò không thể thiếu trong cuộc sống và chiếm một số lượng rất lớn. Để tìm được các hoạt chất có hiệu quả điều trị cao, ít độc tính và có thể ứng dụng trong điều trị, các nhà tổng hợp hoá dược thường dựa vào cấu trúc của các chất đang được dùng làm thuốc hoặc các chất có tác dụng sinh học triển vọng để tổng họp hoặc bán tổng họp tạo ra nhiều thuốc mới. Một số công trình nghiên cứu cho thấy indirubin và các dẫn chất có tác dụng sinh học rất đáng quan tâm như; kháng các dòng tế bào gây bệnh ung thư ở người, kháng nấm, kháng khuẩn V ớ i m o n g m u ố n l à m p h o n g p h ú t h ê m c á c n g h i ê n c ứ u v ề t á c d ụ n g s in h h ọ c của các dẫn chất indirubin, chúng tôi đã quyết định thực hiện đề tài: “Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của indirubin và dẫn chất” với các mục tiêu sau: 1. Tổng hợp indirubin và một số dẫn chất với các nhóm thế khác nhau tại vị trí C-5, C-7 2. Thử hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn và kháng tế bào ung thư của chất tổng hợp được. Với những mục tiêu trên, chúng tôi hy vọng khoá luận này sẽ góp phần vào việc nghiên cứu, tổng hợp các dẫn chất indirubin có hoạt tính sinh học có thể được ứng dụng trong lâm sàng. Chương 1. TỎNG QUAN 1.1. TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA INDIRUBIN Trong những năm gần đây, thế giới đang phải đối mặt với nhiều bệnh nan y do đó nhu cầu tìm ra các phương thuốc đặc trị càng trở nên bức thiết. Với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật đồng thời do yêu cầu thực tiễn, năm 1966, Viện huyết học thuộc Học viện khoa học y dược Trung Quốc nghiên cứu tác dụng chữa bệnh máu trắng của bài thuốc truyền thống Trung Quốc có tên Danggui Longhui Wan gồm 11 loài cây thuốc. Nghiên cứu cho thấy, tác dụng chữa bệnh máu trắng được xác định là do sự có mặt của indirubin [8,13], Ngoài ra, indirubin cũng được biết đến trong việc điều trị các bệnh: Bệnh do virus, bệnh tiểu đường [8], các bệnh về thần kinh như Alzheimer's, parkinson. Tuy nhiên indirubin rất ít tan trong nước, sinh khả dụng thấp vì vậy để tăng khả năng hấp thu, giảm tác dụng phụ và đặc biệt là tăng tác dụng sinh học, các nhà khoa học đã và đang tiếp tục nghiên cứu để tổng hợp ra các dẫn chất mới của indirubin (hình 1.1) Hình 1.1: Công thức cấu tạo của indirubin Tên khoa học: 2',3-Bis(2,3-dihydroindolyliden)-2,3'-dion Sau đây chúng tôi xin trình bày một số tác dụng chính của indirubin. Năm 1999, Hoessel và cộng sự phát hiện ra tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư của indirubin, là do ức chế enzym CDK (cyclin- dependent kinase) [9,13] - enzym đóng vai trò quan trọng trong quá trình [...]... phng phỏp tng hp indirubin Tuy nhiờn phng phỏp ca Baeyer c Rusell v Kaupp ci tin bng cỏch thay indoxyl bng indoxylacetat, thay dung mụi C2H5OH bng dung mụi C H 3O H [14] Phng phỏp ci tin ny cho hiu sut i vi cỏc dn xut th ca indirubin cú th t c t 25-98% [12] Hin nay phng phỏp ny ang c s dng rng rói tng hp indirubin v dn cht C H ,O H N O azC j o Indoxylacetat Isatin Indirubin S 2: Tng hp indirubin theo... DNG SINH HC Vi mc ớch tỡm kim cỏc cht cú hot tớnh sinh hc cao, cú trin vng trong s dng lm thuc, chỳng tụi ó tin hnh th tỏc dng sinh hc, bao gm: th tỏc dng khỏng khun, khỏng nm ca c 6 cht ó tng hp c v th hot tớnh khỏng t bo ung th 3 cht i din (I, II, IV) ó tng hp c 3.2.1 Th tỏc dng khỏng khun, khỏng nm 3.2.1.1 Nguyờn tc, cỏch tin hnh Hot tớnh khỏng khun, khỏng nm ca cỏc cht tng hp c th ti phũng Sinh. .. 1.2 TNG HP INDIRUBIN V DN CHT Ngoi cỏc phng phỏp tỏch, phõn lp trc tip t cỏc ngun thc vt, indirubin cú th c tng hp ton phn t cỏc dn xut indoxyl v dn xut isatin Indimbin c tng hp ln u tiờn vo nm 1881 bi Baeyer t i n d o x y l v i s a t i n v i x ỳ c t ỏ c N a a C O s t r o n g d u n g m ụ i C 2H 5O H v i m ụ i t r n g tr Argon nhit phũng [14] OH > H o Indoxyl H Isatin S 1: Tng hp indirubin theo... khỏm phỏ ra tỏc dng c ch GSK-3 (glycogen synthase kinase 3) ca dn xut indirubin ng thi, khi nghiờn cu c lp, Meijer v cng s cng phỏt hin hot tớnh ny cỏc dn xut th indirubin (GSK-3 l mt loi protein kinase ca serin/threonin ph bin trong nóo, tham gia vo quỏ trỡnh iu chnh lng glycogen nh vai trũ ca insulin [5] v liờn quan ti mt s quỏ trỡnh sinh hc khỏc nh quỏ trỡnh phỏt trin ca t bo sng v ca mụ t bo Cỏc GSK... phỏt sinh, phỏt trin bnh ung th, hot tớnh ny s tr thnh mt liu phỏp nhm trỳng ớch khi iu tr bnh ung th Hin nay, khong 30% lng thuc trong cụng nghip dc phm nhm ti ớch l cỏc protein kinase [4] Nm 2006, theo Yoan Ferandin v cỏc cng s, mt s dn cht th C-7 c bit l cỏc dn xut th halogen cú hot tớnh c ch enzym CDK v GSK3 cao hn indirubin [12' Nm 2006, MJ.Moon v cng s chng minh mt s dn cht th C-5, C-7 ca indirubin. .. Cỏc chng v s v ny c hot húa v pha loóng ti nng 0,5 n v Mc Fland tin hnh thớ nghim, v s v kim nh khụng trn khỏng sinh v cht th úng vai trũ l chng õm tớnh Khỏng sinh kim nh bao gm: Septomycin i vi vi khun Gram (-), Ampicillin i vi vi khun Gram (+), Nystatin i vi nm si v nm men Cỏc khỏng sinh c pha trong DMSO 100% vi nng thớch hp: Streptomycin; 50 mM; Tetracyclin: 10 mM; Nystatin: 0,04 mM, v c s dng... H-NMR 2.3.3 Th tỏc dng sinh hc - Th tỏc dng khỏng khun, khỏng nm theo phng phỏp Vanden Bergher v Vlietlinhk trờn phin kớnh vi lng 96 ging - Th tỏc dng khỏng t bo ung th c tin hnh theo phng phỏp SRB 13 Chng 3 THC NGHIM, KT QU V BN LUN 3.1 HểA HC 3.1.1 Tng hp húa hc Sau khi tham kho cỏc ti liu v da vo iu kin thớ nghim, cỏc húa cht cho phộp, chỳng tụi ó tin hnh tng hp dn cht ca indirubin da trờn c s phn... phn ng ngng t gia 3-indoxyl acetat vi cỏc dn cht isatin khỏc nhau S phn ng chung to cỏc cht t I n VI nh sau: R 0 CO CH 3 4 R NasCOs MeOH =0 + H 7' d/c isatin H // 0 ' d/c indirubin 3 -indoxylacetat S 6: Tng hp cỏc dn cht ca indirubin Trong ú: R=H I IV R = 7-Cl II R = 5-Br V R = 5 -F III R = 5-Cl VI R = 5 -OCH3 Di õy l cỏc phn ng c th tng hp cỏc dn cht t I n VI 3.1.1.1 Tng hp ỡndirubin (I) - S phn... bt dung mụi, kt tinh trong t lnh, lc, sy 60c, hỳt m v lm khan bng KOH thu c 0,7312g ta - Kt qu: sn phm indirubin l tinh th hỡnh kim, mu tớm m T^nc >26(fc Hiu sut phn ng: 93% IR (KBr, cm'^): bng 4 (trang 20); EIMS (70 eV, m/z): 262 ^HNMR (DMSO-dg): [ppm]\ bng 6 (trang 25) 3.1.1.2 Tng hp 5-bromoindirubin (II) Br OCOCH3 - 0 N H 5-bromoisatin + NajCOa MeOH 3 -indoxylacetat 15 Tin hnh thc hin phn ng tng... nõu tớm T^nc > 260c Hiu sut phn ng: 93% IR (KBr, cm'^): bng 3 (trang 20); EIMS (70 eV, m/z): 342 (M^) ^HNMR (DMSO-d): [ppm]: bng 5 (trang 25) 3.1.1.3 Tng hp 5-cloroindirubin (III) OCOCH3 o + \ NasCO MeOH 3-inoxylacetat 5-cloroisatin 5-cloroindirubin Tin hnh thc hin phn ng tng t cht /, nhng vi cỏc húa cht l 0,525g (3 mmol) 3 -indoxyl acetat v 0,543g (3 mmol) 5-cloroisatin thu c 0,7994g sn phm tinh khit . của các dẫn chất indirubin, chúng tôi đã quyết định thực hiện đề tài: Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của indirubin và dẫn chất với các mục tiêu sau: 1. Tổng hợp indirubin và một số dẫn. Tác dụng sinh học của indirubin và dẫn chất 3 1.2. Tổng họp indimbin và dẫn chất 5 1.2.1. Tổng hợp một số dẫn chất isatin 8 1.2.2. Tổng hợp một số dẫn chất indirubin 9 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG. Bộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI PHẠM THỊ HOA TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC • • • CỦA INDIRUBIN VÀ DẪN CHẤT KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP Dược SỸ Người hướng dẫn: 1. TS. Nguyễn Hải Nam 2.