ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM PHAN ĐÌNH NHÂN Tên đề tài: NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN IN VITRO CÁC GIỐNG MÍA BR2, BR7515 VÀ QĐ 93-159 NHẬP NỘI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm Khoá : 2010 – 2014 Thái Nguyên, 2014 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM PHAN ĐÌNH NHÂN Tên đề tài: NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN IN VITRO CÁC GIỐNG MÍA BR2, BR7515 VÀ QĐ 93-159 NHẬP NỘI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Khoa : Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm Khoá : 2010 – 2014 Giáo viên hướng dẫn : 1. TS. Hà Thị Thúy Viện di truyền nông nghiệp 2. Ths. Nguyễn Thị Tình Khoa CNSH & CNTP Trường ĐHNL Thái Nguyên Thái Nguyên, 2014 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp trước hết tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Hà Thị Thúy, phó Viện trưởng Viện Di Truyền Nông Nghiệp. Cô đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và tận tình hướng dẫn tôi trong toàn bộ quá trình thực tập và hoàn thành khóa luận này. Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới cô Th.s Nguyễn Thị Tình khoa CNSH- CNTP, trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên đã hướng dẫn, giúp tôi thực tập và hoàn thành khóa luận. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới chị Đỗ Thị Vân đã tận tình chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực tập khoa luận tại trạm thực nghiệm Sinh học Công nghệ cao Văn Giang – Hưng Yên. Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể các cô chú, anh chị làm việc tại trạm thực nghiệm Sinh Học Công nghệ cao, Văn Giang, Hưng Yên; trực thuộc Viện Di Truyền Nông Nghiệp, đã tạo điều kiện tối đa cho tôi trong toàn bộ quá trình thực tập. Tôi xin gửi lời cảm ơn và biết ơn sâu sắc nhất tới tập thể các thầy cô giảng dạy tại khoa CNSH – CNTP, Trường ĐH Nông Lâm Thái Nguyên đã hướng dẫn, giảng dạy tôi trong suốt quá trình học tập tại trường. Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã luôn ở bên động viên và tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận này. Thái Nguyên, ngày 01 tháng 06 năm 2014 Sinh viên Phan Đình Nhân DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 4.1: Khả năng tạo chồi của chồi của ba giống mía Br7515, Br2 và QĐ93-159 sau 3 tuần nuôi cấy 29 Bảng 4.2: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp với Kinetin(0, 2mg/l MT) lên quá trình tái sinh chồi từ callus của hai giống mía Br2 và Br7515 31 Bảng 4.3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp với Kinetin(0, 2mg/l MT) lên quá trình tái sinh chồi từ callus của giống mía QĐ 93-159 32 Bảng 4.4: Ảnh hưởng của nước dừa đến sự hình thành chồi từ callus ở 2 giống mía BR2 và BR7515 35 Bảng 4.5: Ảnh hưởng của nước dừa đến sự hình thành chồi từ callus ở 2 giống mía QĐ 93-159 35 Bảng 4.6: Ảnh hưởng BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình nhân nhanh chồi của của giống mía Br2, Br7515 sau 4 tuần nuôi cấy 38 Bảng 4.7: Ảnh hưởng BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình nhân nhanh chồi của của giống mía QĐ93-159 39 Bảng 4.8: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến quá trình hình thành rễ của của giống mía Br2 sau 2 tuần nuôi cấy (tính theo tỷ lệ %) 42 Bảng 4.9: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến quá trình hình thành rễ của của giống mía Br7515 sau 2 tuần nuôi cấy (tính theo tỷ lệ %) 42 Bảng 4.10:Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến quá trình hình thành rễ của của giống QĐ93-159 sau 2 tuần nuôi cấy (tính theo tỷ lệ %) 43 Bảng 4.11: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất nền đến tỷ lệ sống của cây trên vườn ươm 46 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 4.1: Chồi mía trong môi trường nuôi cấy 28 Hình 4.2. Biểu đồ thể hiện Khả năng tạo chồi của chồi của ba giống mía Br7515, Br2 và QĐ93-159 sau 3 tuần nuôi cấy. 29 Hình 4.3: Chồi tái sinh từ callus sau 1 tuần cấy chuyển 31 Hình 4.4: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp với Kinetin(0, 2mg/l MT) lên quá trình tái sinh chồi từ callus của ba giống mía Br7515, Br2 và QĐ93-159. 32 Hình 4.5: Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến quá trình tái sinh chồi từ callus cau 3 tuần nuôi cấy 34 Hình 4.6: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nước dừa đến sự hình thành chồi từ callus của ba giống mía Br2, Br7515 và QĐ93-159 36 Hình 4.7: Ảnh hưởng của nước dừa đến dự hình thành chồi từ callus sau 3 tuần nuôi cấy 37 Hình 4.8 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình nhân nhanh chồi của ba giống mía BR2, QĐ 93-159 và BR7515. 39 Hình 4.9 Ảnh hưởng của BAP trong kéo dài chồi sau 4 tuần nuôi cấy. 41 Hình 4.10: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ NAA đến quá trình hình thành rễ bất định của các giống mía Br2, Br7515 và QĐ 93-159 tạo cây hoàn chỉnh 43 Hình 4.11: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến quá trình hình thành rễ sau 2 tuần nuôi cấy 45 Hình 4.12: Cây sau khi được rửa sạch môi trường và hóa chất 45 Hình 4.13: Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của chất nền đến tỷ lệ sống của cây trên vườn ươm 46 Hình 4.14: Mía nuôi cấy mô ngoài vườn ươm sau 30 ngày 47 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT BAP : 6- Benzyl Amino Purin IAA : Indol-3-Axetic acid IBA : 3-Indol Butyric acid NAA : α-Naphthyl Axetic acid 2,4 – D : 2,4-Dichlorophenoxy Axetic acid MS : Mura Shige và Skoog CTMT : Công thức môi trường TB : Trung bình CT : Công thức CV : Độ tin cậy LSD : Sai số nhỏ nhất có ý nghĩa MỤC LỤC Trang Phần 1: MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu 2 1.3. Mục đích nghiên cứu 2 1.4. Ý nghĩa của đề tài 2 1.4.1. Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu khoa học 2 1.4.2. Ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất. 3 Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1. Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng 4 2.1.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật. 4 2.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 4 2.1.2.1. Môi trường nuôi cấy 4 2.1.2.2 Vật liệu nuôi cấy 8 2.1.2.3. Điều kiện vô trùng 8 2.1.3. Các hướng ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào thực vật 8 2.1.3.1 Tạo dòng sạch bệnh 8 2.1.3.2. Vi nhân giống bảo tồn gen 9 2.1.4. Các phương pháp vi nhân giống 9 2.1.4.1. Hoạt hóa chồi nách 9 2.1.4.2. Phương pháp tạo chồi bất định 10 2.1.4.3. Phương pháp tạo phôi vô tính 10 2.1.4.4. Các bước chính trong nhân giống in vitro 11 2.2. Giới thiệu về cây mía 13 2.2.1. Nguồn gốc, vị trí phân loại cây mía 13 2.2.2. Đặc điểm hình thái và sinh thái của cây mía 13 2.2.3. Phân loại giống mía ở Việt Nam 14 2.2.4. Ý nghĩa kinh tế của cây mía 14 2.2.5. Tình hình sản xuất mía trên thế giới và Việt Nam 15 2.2.5.1. Trên thế giới 15 2.2.5.2. Việt Nam 16 2.2.6. Tình hình nhân giống cây mía bằng phương pháp in vitro trên thế giới 17 2.2.7. Tình hình nhân giống cây mía bằng phương pháp in vitro ở Việt Nam18 Phần 3: ĐỐI TƯỢNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 19 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành 19 3.3. Hóa chất và thiết bị 19 3.3.1. Hóa chất 19 3.3.2. Thiết bị 19 3.4. Nội dung nghiên cứu. 20 3.5. Phương pháp nghiên cứu 20 3.5.1. Phương pháp nghiên cứu nội dung 1 20 3.5.2. Phương pháp nghiên cứu nội dung 2 21 3.5.3. Phương pháp nghiên cứu nội dung 3. 24 3.5.4. Phương pháp nghiên cứu nội dung 4. 24 3.6. Chỉ tiêu theo dõi, đánh giá 25 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của vật liệu nuôi cấy chồi đỉnh và chồi nách đến khả năng tái sinh chồi của các giống mía Br7515, Br2 và QĐ93-159. 28 4.2. Ngiên cứu ảnh hưởng của các chất đến quá trính tái sinh và nhân nhanh chồi mía 30 4.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp với Kinetin(0, 2mg/l MT) lên quá trình tái sinh chồi từ callus của ba giống mía Br7515, Br2 và QĐ93-159 30 4.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa đến sự hình thành chồi từ callus của ba giống mía Br2, Br7515 và QĐ93-159 34 4.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình nhân nhanh chồi của ba giống mía BR2, QĐ 93-159 và BR7515 38 4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến quá trình hình thành rễ bất định của các giống mía Br2, Br7515 và QĐ 93-159 tạo cây hoàn chỉnh. 41 4.4. Giai đoạn ngoài vườn ươm 45 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 5.1. Kết luận 48 5.2. Đề nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 I. Tài liệu tiếng Việt 49 II. Tài liệu tiếng nước ngoài 50 1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Mía là tên gọi chung của một số loài thuộc chi mía (Saccharum), chúng là các loài sống lâu năm, thuộc tông Andropogoneae của họ hòa thảo (Poacea). Thân mía to mập, chia đốt, chứa nhiều đường, cao từ 2- 6m. Hầu hết các vùng trồng mía hiện nay đều dùng để cung cấp nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất đường. Năm 2007, Thủ tướng Chính phủ đã phê duyệt Quy hoạch phát triển ngành Mía đường đến năm 2010, định hướng đến năm 2020 với các chỉ tiêu chủ yếu đến năm 2010 như diện tích mía 300.000 ha; năng suất mía bình quân 65 tấn/ha; sản lượng mía cả nước 19,5 triệu tấn; tổng sản lượng đường sản xuất 1,5 triệu tấn (trong đó sản lượng đường công nghiệp đạt 1,4 triệu tấn). Định hướng đến năm 2020 tổng diện tích khoảng 300, 000 ha, năng suất bình quân đạt 80 tấn/ha, tổng sản lượng đạt 24 triệu tấn. Tuy nhiên tất cả các chỉ tiêu đặt ra cho ngành mía đường đều đã không đạt kế hoạch. Vụ mía đường 2012 - 2013 kết thúc với những thống kê, tổng sản lượng đường chỉ đạt 19, 4 triệu tấn. Công suất chế biến của các nhà máy chỉ đạt 72,5%- 74,4% so với thiết kế. Các chỉ tiêu thực tế năm 2013đạt được là: Diện tích mía 298.200 ha; năng suất mía bình quân 63, 9 tấn/ha (vẫn chưa đạt được mức dự kiến đặt ra năm 2010). Để tăng năng suất mía khi mà diện tích reo trồng vẫn giữ nguyên đòi hỏi phải cải tiến về kĩ thuật canh tác cũng như cải tiến chất lượng giống. Việc nghiên cứu nhân nhanh các giống mía mới bằng phương pháp nuôi cấy mô phục vụ cho sản xuất mía đường ở Việt Nam cũng như trên thế giới là một trong những hướng đi nhằm tạo ra giống nhanh có chất lượng,cũng như là nguồn cung cấp cây giống đồng đều sạch bệnh cho các vùng sản xuất. Chính vì thế chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro các giống mía Br2, Br7515 và QĐ 93-159 nhập nội”. [...]... tái sinh chồi của giống mía Br7515, Br2 và Q 93-159 - Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình nhân nhanh chồi của các giống mía Br2, Br7515 và QĐ 93-159 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến quá trình hình thành rễ bất định của các giống mía Br2, Br7515 và QĐ 93-159 tạo cây hoàn chỉnh Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số giá thể đến sinh trưởng và phát... ở các nồng độ khác nhau lên quá trình tái sinh chồi của các giống mía Br2, Br7515 và QĐ 93-159 - Xác định được ảnh hưởng của nồng độ NAA đến quá trình hình thành rễ của các giống mía Br2, Br7515 và QĐ 93-159 - Xác định được ảnh hưởng của một số giá thể đến sinh trưởng và phát triển của cây mía ngoài vườn ươm 1.3 Mục đích nghiên cứu - Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ nhân nhanh các giống mía. .. vật liệu nuôi cấy chồi đỉnh và chồi nách đến khả năng tái sinh chồi của các giống mía Br7515, Br2 và Q 93-159 Nội dung 2: Ngiên cứu ảnh hưởng của các chất đến quá trính tái sinh và nhân nhanh chồi mía - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Kinetin =0.2mg/l khi kết hợp với BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình tái sinh chồi của các giống mía Br2, Br7515 và QĐ 93-159 .- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ... tiêu nghiên cứu - Xác định được ảnh hưởng của chồi đỉnh và chồi nách đến khả năng tái sinh của các giống mía Br7515, Br2 và Q 93-159 - Xác định được ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau khi kết hợp với Kinetin 0.2mg/l lên quá trình tái sinh chồi của các giống mía Br2, Br7515 và QĐ 93-159 .- Xác định được ảnh hưởng của nồng độ nước dừa đến quá trình tái sinh chồi của giống mía Br7515, Br2 và Q 93-159. .. pháp in vitro - Tạo tập đoàn giống mía in vitro ban đầu sẵn sàng cung ứng vật liệu giống mới cho nhân giống sản xuất tại các vùng nguyên liệu mía khác nhau trong nước 1.4 Ý nghĩa của đề tài 1.4.1 Ý nghĩa trong học tập và nghiên cứu khoa học Nghiên cứu quy trình nhân nhanh thích hợp nhất với một số giống mía mới nhập nội từ đó hoàn thiện công nghệ nhân nhanh các giống mía duy trì và nhân nhanh các nguồn... phổ biến và được ứng dụng rộng rãi trong duy trì và nhân nhanh những kiểu gen quý hiếm, các dòng tốt, bảo quản các tập đoàn giống nhân vô tính và đặc biệt là sản xuất giống thương mại ở quy mô công nghiệp [1] 2.1.4 Các phương pháp vi nhân giống Theo tác giả Đỗ Năng Vịnh vi nhân giống (nhân giống vô tính in vitro) là phương pháp sử dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật để nhân nhanh các giống cây... Nông nghiệp Việt Nam và Viện Nghiên cứu Mía đường) Ngoài ra chúng ta đã bươc đầu chọn tạo giống mới bằng đột biến, dung hợp tế bào trần, chuyển gen (Đỗ Năng Vịnh, 2002) [12] 19 Phần 3 ĐỐI TƯỢNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Nghiên cứu thực hiện trên đối tượng là cây mía (Succharum officinarum), sử dụng giống mía BR7515, Br2 và Q 93-159 nhập nội Mẫu dùng để... đã áp dụng công nghệ nuôi cấy mô trong nhân nhanh một số giống mía Trong những năm qua nước ta đã nhập nội một số giống mía , chủ yếu là các giống mía ROC của Đài Loan Tuy nhiên do giá thành cao, hệ số nhân của các phương pháp nhân giống truyền thống lại thấp không đủ đáp ứng đủ nhu cầu về giống mía Gần đây một số Viện nghiên cứu đã tiến hành nhân giông mía in vitro (Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện... trưởng được sử dụng phổ biến nhất hiện nay Auxin cần bổ sung vào giai đoạn tạo callus, kéo dài chồi và nhân nhanh in vitro Cytokinin bổ sung vào môi trường nuôi cấy ở giai đoạn ra rễ và nhân chồi Tỷ lệ thích hợp giữa Auxin và Cytokinin phù hợp sẽ định hướng cho cây tạo rẽ hay tạo chồi: Auxin/Cytokinin >1 Mẫu nuôi cấy định hướng ưu tiên phát triển rễ Auxin/Cytokinin . đề tài: Nghiên cứu hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro các giống mía Br2, Br7515 và QĐ 93-159 nhập nội . 2 1.2. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định được ảnh hưởng của chồi đỉnh và chồi nách. ĐÌNH NHÂN Tên đề tài: NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN IN VITRO CÁC GIỐNG MÍA BR2, BR7515 VÀ QĐ 93-159 NHẬP NỘI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên. học tập và nghiên cứu khoa học Nghiên cứu quy trình nhân nhanh thích hợp nhất với một số giống mía mới nhập nội từ đó hoàn thiện công nghệ nhân nhanh các giống mía duy trì và nhân nhanh các nguồn