1 I HC THI NGUYấN TRNG I HC NễNG LM TRIU MINH HU Tờn ti: Nghiên cứu ảnh hởng của một số yếu tố đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá (Zingiber sp.) trong điều kiện in vitro KhóA LUậN TốT NGHIệP ĐạI HọC H o to : Chớnh quy Chuyờn ngnh : Cụng ngh sinh hc Lp : K42 - CNSH Khoa : CNSH - CNTP Khoỏ hc : 2010 - 2014 Ging viờn hng dn: ThS. Lõm Mai Tựng Trung tõm ng dng tin b Khoa hc v Cụng ngh tnh Lng Sn ThS. Lng Th Thu Hng Khoa CNSH-CNTP, trng i hc Nụng Lõm Thỏi Nguyờn Thỏi Nguyờn, nm 2014 2 LỜI CẢM ƠN Được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhịêm Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm trong thời gian thực tập tốt nghiệp em đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá (Zingiber sp.) trong điều kiện in vitro”. Qua 6 tháng thực tập tại phòng Kỹ thuật của Trung tâm Ứng dụng Tiến bộ Khoa học và Công nghệ tỉnh Lạng Sơn em đã hoàn thành đề tài. Để đạt được kết quả như ngày hôm nay em xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc trung tâm cùng các thành viên phòng Kỹ thuật đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ths. Lâm Mai Tùng, Ths. Lương Thị Thu Hường và KS. Vi Thị Minh Tâm đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài. Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ tạo điều kiện về vất chất và tinh thần cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu. Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên đề tài không thể tránh khỏi những sai sót. Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn ! Thái Nguyên, ngày 27 tháng 05 năm 2014 Sinh viên thực hiện Triệu Minh Huệ 3 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1. Thành phần hóa học trong tinh dầu gừng 6 Bảng 4.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl 2 0,1% đến hiệu quả khử trùng mẫu cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro. 26 Bảng 4.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của việc kết hợp khử trùng bằng HgCl2 0,1% và Ca(OCl)2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro. 28 Bảng 4.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4 -D đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng núi đá trong điều kiện in vitro. 30 Bảng 4.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và IAA đến khả năng hình thành mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro. 31 Bảng 4.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4 - D kết hợp với BA đến khả năng hình thành mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro. 33 Bảng 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến khả năng hình thành mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro. 35 4 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1. Một số hình ảnh mô tả đặc điểm hình thái cây gừng Núi đá 5 Hình 4.1. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl 2 0,1% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro. 27 Hình 4.1.2. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của việc kết hợp khử trùng bằng HgCl 2 0,1% với Ca(OCl) 2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro. 29 Hình 4.2.1. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ 2,4 - D đến khả năng hình thành mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro. 30 Hình 4.2.3. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ 2,4 - D kết hợp với BA đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro. 34 Hình 4.3. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro 36 5 DANH MỤC TỪ, CỤM TỪ VIẾT TẮT AND : Acid deoxyribonucleic B1 : Thiamin B3 : Nicotinic acid B6 : Pyridoxine BA : 6-Benzylaminopurine CT : Công thức CV : Coefficient of Variation Đ/C : Đối chứng IAA : Indol axetic acid Kinetin : 6-Furfurylaminopurine LSD : Least Significant Difference Test MS : Murashige and Skoog’s NAA : α - Naphlene axetic acid TN : Thí nghiệm 2,4-D : 2,4-dichlorophenoxy acetic acid 6 MỤC LỤC Trang Phần 1: MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích của đề tài 2 1.3. Yêu cầu của đề tài 2 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2 1.4.1. Ý nghĩa khoa học 2 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn 2 Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Tổng quan về gừng núi đá 3 2.1.1. Phân loại 3 2.1.2. Đặc điểm phân bố 3 2.1.3. Đặc tính sinh học 4 2.1.4. Thành phần hóa học 6 2.1.5. Tác dụng 8 2.2. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào 8 2.2.1. Tính toàn năng di truyền của tế bào 8 2.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa tế bào 9 2.2.3. Nuôi cấy mô sẹo 10 2.2.4. Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật 12 2.3. Tình hình nghiên cứu cây gừng trong nước và thế giới 17 2.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 17 2.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 18 Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 19 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu 19 3.1.2. Phạm vi nghiên cứu 19 3.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 19 3.2.1. Địa điểm nghiên cứu 19 3.2.2. Thời gian nghiên cứu 19 3.3. Điều kiện nuôi cấy 19 3.4. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 19 3.5. Nội dung nghiên cứu 19 7 3.6. Phương pháp nghiên cứu 20 3.6.1.Chuẩn bị vật liệu nghiên cứu 20 3.6.2. Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 20 3.6.3. Nuôi cấy mô sẹo 20 3.6.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm 20 3.7. Chỉ tiêu theo dõi 24 3.8. Xử lý số liệu 25 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp khử trùng thích hợp tạo vật liệu sạch phục vụ nuôi cấy cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro 26 4.1.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl 2 0.1% đến hiệu quả khử trùng mẫu cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro 26 4.1.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của việc kết hợp khử trùng bằng HgCl 2 0.1% và Ca(OCl) 2 15% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy cây gừng Núi đá. 28 4.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro 29 4.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4 - D đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng núi đá trong điều kiện in vitro. 29 4.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và IAA đến khả năng hình thành mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro. 31 4.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4 - D kết hợp với BA đến khả năng hình thành mô sẹo cây gừng núi đá trong điều kiện in vitro. 33 4.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến khả năng hình thành mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro. 35 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 5.1. Kết luận 37 5.2. Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Gừng (Zingiber officinable Roscoe.) là một loại cây thân thảo, lấy củ, sống lâu năm được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm và thảo dược [32]. Chúng được trồng phổ biến ở hầu hết các nước nhiệt đới như Ấn Độ, Bangladet, Jaiwan, Jamaica, Nigieria, Indonesia, Ceylon, Sierraleone, Australia, Trung Quốc và Nhật Bản [21], gồm hơn 1200 loài cây thuộc 53 chi. Chi Zingiber gồm 85 loài thảo mộc thơm từ Đông Á và vùng nhiệt đới Australia [19]. Bộ phận chính được sử dụng là củ gừng (thân rễ, rhizome) [17]. Gừng có vị cay, thơm rất giàu các hợp chất thứ cấp như nhựa dầu, dẫn xuất phenol, zingiberene, gingerol [33]. Trong các phương pháp chữa bệnh truyền thống thường được sử dụng để điều trị bệnh đau đầu, buồn nôn, cảm lạnh, viêm khớp, thấp khớp, nhức mỏi cơ bắp, và viêm [20]. Ở Ấn Độ và Trung Quốc thời cổ xưa đã sử dụng gừng điều trị bệnh trên người và gia súc [47]. Trong công nghiệp thực phẩm, gừng được sử dụng để tạo hương vị trong sản xuất một số sản phẩm như bánh kẹo, trà, mứt, nước giải khát,…[17] Gừng thường được nhân giống bằng củ, nhưng hệ số nhân rất thấp. Năng suất gừng không cao do nhiễm vi khuẩn gây héo (Pseudomonas solanacearum), thối rễ (Pythium aphanidermatum) và tuyến trùng (Meloidgyne spp.). Những bệnh này sẽ truyền qua củ giống vào năm sau, do vậy sản xuất những dòng sạch bệnh với tỷ lệ nhân giống cao là cần thiết để có được vụ mùa với năng suất cao [50]. Đã có khá nhiều nghiên cứu về cây gừng trên thế giới như vi nhân giống [31], nuôi cấy cơ quan [34], phát sinh phôi soma [41], phát sinh cơ quan [38], nuôi cấy tế bào trần, bảo tồn phôi và một số nghiên cứu khác. Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu về cây gừng Núi đá – một loại cây bản địa, quý và hiếm. Theo quyết định 80/2005/QĐ - BNN về danh mục các nguồn gen quý hiếm cần được bảo tồn do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành ngày 05/12 /2005, gừng Núi đá là một trong những loài cây quý hiếm cần bảo tồn. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá (Zingiber sp.) trong điều kiện in vitro”. 2 1.2. Mục đích của đề tài - Nghiên cứu phương pháp khử trùng thích hợp để tạo vật liệu sạch phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo. - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro. 1.3. Yêu cầu của đề tài - Xác định ảnh hưởng của phương pháp khử trùng (thời gian khử trùng, phương pháp khử trùng) đến khả năng tạo vật liệu sạch phục vụ cho tạo mô sẹo cây gừng Núi đá. - Xác định ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro. - Xác định ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro. 1.4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1.4.1. Ý nghĩa khoa học - Sự thành công của đề tài cùng với những nghiên cứu của các tác giả khác sẽ tạo ra được quy trình nhân giống phù hợp cho cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro và phục vụ các nghiên cứu chiết xuất các hợp chất hóa học quan trọng của gừng nói chung và gừng Núi đá nói riêng. - Là cơ sở cho các nghiên cứu khoa học khác. 1.4.2. Ý nghĩa thực tiễn - Cung cấp số lượng cây gừng Núi đá trong tự nhiên góp phần bảo tồn nguồn gen quý hiếm và khai thác triệt để những giá trị kinh tế và dược liệu của chúng. 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tổng quan về gừng núi đá 2.1.1. Phân loại Theo hệ thống thực vật học mới nhất cây gừng Núi đá được phân loại như sau [15]: Giới : Plantae Ngành : Magnoliophyta Lớp : Liliopsida Họ : Zingiberaceae Bộ : Zingiberales Chi : Zingiber Loài : Zingiber sp. Tên Việt Nam : Gừng Núi đá Tên khoa học : Zingiber sp. Tên khác : Gừng đá, gừng Núi đá. Tiếng Tày gọi là khing phia. 2.1.2. Đặc điểm phân bố Gừng là một trong những loài cây trồng phổ biến khắp thế giới, có nguồn gốc từ trung tâm Châu Á, được trồng ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Chúng đã trở thành cây trồng kinh tế cho nông dân ở Châu Mỹ La - tinh, Châu Phi và Đông Nam Á. Gần 50% sản lượng gừng thu hoạch xuất xứ từ Ấn Độ, một phần từ Châu Phi, Brazil, Jamica. Trong vùng Đông Nam Á, Trung Quốc là nước có diện tích trồng gừng cao nhất (50.000 đến 80.000 ha), kế đến là Thái Lan, Hàn Quốc và Việt Nam [47]. Ở Việt Nam, gừng được trồng từ rất lâu đời, ở khắp mọi nơi trên khắp các địa phương từ Bắc vào Nam [9]. Tuy nhiên, gừng chỉ được trồng rải rác ở trong các vườn hộ gia đình [2]. Gừng Núi đá phân bố ở một số tỉnh như Lạng Sơn, Nà Rì, Bắc Cạn, Cao Bằng, Hà Giang, Tây Bắc và miền Trung Tây Nguyên, Khánh Hòa, Gia Lai, Đắc Lắc, cây mọc tự nhiên trên các vùng núi đá, mọc xen trong đá, ở các bờ suối nơi ẩm mát - dưới tán rừng già , cây thường phát triển theo cụm (5,6 thân). Tên gừng Núi đá bắt nguồn từ nơi chúng có khả năng sống và phát triển tốt nhất. Loại gừng này thường mọc ở những dãy núi đá cao khoảng trên 1m, củ bằng đốt ngón tay, có mùi vị thơm rất lạ lùng giống mùi bọ xít. [...]... cấy, máy chụp ảnh, và một số thiết bị khác 3.5 Nội dung nghiên cứu - Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến hiệu quả tạo vật liệu sạch phục vụ cho tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro - Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng tới khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro - Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng... cấy 10 mẫu, mỗi bình cấy 1 mẫu + Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mô sẹo tạo thành, chất lượng mô sẹo 24 3.6.2.3 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro - Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro + Công thức thí nghiệm: Công thức Hàm lượng saccharose... trưởng đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro 4.2.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 2,4 - D đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro Tái sinh mô sẹo là một bước cơ bản trong một số quá trình nuôi cấy mô như thiết lập hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù [36,37] và một số nghiên cứu khác Nồng độ chất điều hòa sinh trưởng khác nhau được sử dụng với... chất đậm đặc Dạng mô sẹo cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh cơ quan của khối mô Khả năng tái sinh chồi sớm mất đi ở mô sẹo xốp những vẫn duy trì ở mô sẹo cứng Nguyên nhân có thể do các tế bào mô sẹo sẽ mất đi khả năng sinh ra một số chất thiết yếu cho sự tái sinh của nó khi số lần cấy chuyển tăng lên Vì vậy, khi nuôi cấy mô sẹo nhằm mục đích tái sinh chồi, phải cố gắng tìm điều kiện nuôi cấy thích... hợp tạo vật liệu sạch phục vụ nuôi cấy cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro 4.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng mẫu cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro HgCl2 là một loại hóa chất khử trùng được báo cáo là rất hiệu quả trong khử trùng bề mặt mẫu của nhiều loài cây thuộc loài Zingiberaceae [24,43,44] Chính vì vậy, trong nghiên cứu. .. Tình hình nghiên cứu cây gừng trong nước và thế giới 2.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Gừng Núi đá là một loại cây mới mang tính địa phương do vậy hiện nay chưa có nhiều nghiên cứu về chúng Tuy nhiên, các nghiên cứu về gừng nói chung đã được rất nhiều tác giả trong và ngoài nước nghiên cứu K.Nirmal Babu và cs (1991) [47] đã nghiên cứu tái sinh cây gừng (Zingiber officinale Rose.) từ mô sẹo có nguồn... vi nghiên cứu 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu - Củ gừng Núi đá lấy từ vườn mẫu của Trung tâm UDTB Khoa học và Công nghệ tỉnh Lạng Sơn 3.1.2 Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu phương pháp khử trùng mẫu và tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro 3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu - Phòng Kỹ thuật của Trung tâm UDTB Khoa học và Công nghệ tỉnh Lạng Sơn 3.2.2 Thời gian nghiên. .. vào môi trường MS có bổ sung chất kích thích sinh trưởng với loại và nồng độ khác nhau Nuôi cấy trong điều kiện thích hợp và theo dõi kết quả hình thành mô sẹo sau 8 tuần nuôi cấy 3.6.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm 3.6.4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp khử trùng đến hiệu quả tạo vật liệu sạch phục vụ cho tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro - Thí nghiệm 1: Nghiên cứu. .. tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu sống không nhiễm, tỷ lệ mẫu sống nhiễm, tỷ lệ mẫu chết 3.6.2.4 Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro Mầm chồi gừng sạch sau khi khử trùng sẽ thái mỏng thành từng lát khoảng 1 2 mm Cấy vào môi trường MS + 7g agar + 100ml nước dừa/l với nồng độ các chất kích thích sinh trưởng được bổ sung... nhiên hoàn toàn gồm 6 công thức, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần cấy 10 mẫu, mỗi bình cấy 1 mẫu + Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ tạo mô sẹo, chất lượng mô sẹo - Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và IAA đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro 23 + Công thức thí nghiệm: Công thức Nồng độ (mg/l) NAA IAA 1 1 1 2 1 3 3 1 5 4 3 1 5 5 1 6 5 5 7 3 3 8 3 5 9 5 3 + Phương . năng tạo mô sẹo cây gừng núi đá trong điều kiện in vitro. 29 4.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA và IAA đến khả năng hình thành mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro. . BA đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro. 34 Hình 4.3. Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều. trùng) đến khả năng tạo vật liệu sạch phục vụ cho tạo mô sẹo cây gừng Núi đá. - Xác định ảnh hưởng của hàm lượng đường saccharose đến khả năng tạo mô sẹo cây gừng Núi đá trong điều kiện in vitro.