1 Bộ giáo dục và đào tạo Trờng đại học s phạm hà nội 2 Nguyễn huy trí Phân tách bằng các phơng pháp sắc ký và nghiên cứu một số tính chất của ribonuclease từ nọc rắn hổ mang Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 Luận văn thạc sĩ sinh học Ngời hớng dẫn khoa học: NCVC. TS NGUYễN VĂN THIếT Hà nội, 2010 2 MỞ ĐẦU 1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Ribonuclease (RNase) là một trong những nhóm enzyme được quan tâm nghiên cứu nhiều. Đây là nhóm enzyme có phân bố rộng rãi, đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất của các acid nucleic, thực hiện chức năng tiêu hóa và tham gia vào phản ứng miễn dịch của cơ thể. Đặc biệt là trong những thập kỷ gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện nhiều tính chất (hay hoạt tính) sinh học mới quan trọng của các enzyme thuộc siêu họ RNase A (đây là nhóm RNase ngoại tiết ở các động vật có xương sống từ lưỡng cư đến lớp thú), trong đó có hoạt tính gây độc tế bào (hay hoạt tính cytotoxin),các hoạt tính kháng khuẩn và kháng virus và một số hoạt tính khác. Ví dụ như: RNase từ một số loài ếch (ếch đồng Nhật Bản Rana japonica, ếch bò Rana catesbeiana và ếch báo phương bắc Rana pipens) đều có hoạt tính chống ung thư, đặc biệt là RNase từ loài ếch báo phương bắc tác động rất đặc hiệu lên tế bào u mà không ảnh hưởng lên tế bào bình thường, do đó enzyme này được gọi là onconase (enzyme đặc hiệu với các tế bào ung thư). Ngoài ra enzyme này còn có hoạt tính chống HIV-1 cao. Các enzyme thuộc nhóm RNase ngoại tiết khác nhau như RNase từ tinh dịch bò và nhiều RNase ngoại tiết ở người (các enzyme này tạo thành siêu họ RNase A ở người) cũng có hoạt tính chống virus và chúng là một bộ phận cấu thành trong hệ thống chống virus ở người như 2 enzyme RNase 2 và RNase 3 do các bạch cầu ưa eosin (bạch cầu ưa acid) tiết ra. Những năm gần đây ngoài việc tìm ra một số RNase nguồn gốc tự nhiên có đặc điểm như onconase & BS-RNase, các nhà khoa học còn nghiên cứu tạo ra các chế phẩm RNase nhân tạo có hoạt tính chống ung thư, nhờ vận dụng các phương pháp sinh học phân tử và công nghệ gen. Dạng biến thể của RNase được tạo ra bằng cách thay thế một hoặc một vài gốc amino acid cần cho tương tác với protein ức chế (RI) hoặc tạo thêm liên kết disunfide làm tăng độ bền vững cấu trúc và giảm bớt sự nhạy cảm với protein trong tế bào. Các nghiên cứu này đã mở ra một hướng nghiên 3 cứu mới trong lĩnh vực hóa dược nhằm sản xuất ra những chế phẩm dược cao cấp trên cơ sở RNase để phòng chống ung thư. Nọc rắn là nguồn dược liệu cổ truyền quý, không phải ngẫu nhiên mà biểu tượng của toàn ngành Y trên thế giới là hình ảnh con rắn đang nhả nọc. Nọc rắn xử lý hết độc có tác dụng: - Chống đông, chống hình thành huyết khối, giảm fibrinogen, độ dính của máu, độ ngưng kết của tiểu cầu. - Có tác dụng giảm đau rõ rệt: Nọc độc rắn với liều 0,188 mg/kg có tác dụng giảm đau 3 - 4 lần morphin với liều 1mg/kg mà không gây nghiện. Có thể trị các loại đau thần kinh, ung thư. - Có tác dụng chống ung thư. (Theo kết quả nghiên cứu dược lý hiện đại). Đáng chú ý là những chất mới được phát hiện trong nọc rắn, nuôi dưỡng sự hình thành các tế bào thần kinh mới có ý nghĩa với các bệnh nhân mắc bệnh Alzheimer và những bệnh khác mà tế bào thần kinh trong não chết đi. Để góp phần tìm hiểu thêm về các RNase tự nhiên có khả năng có hoạt tính cytotoxin trong nguồn tài nguyên đa dạng và phong phú của Việt Nam. Chúng tôi chọn đề tài nghiên cứu RNase từ nọc rắn nhằm tìm hiểu tính chất của enzyme này. Luận văn của tôi có tiêu đề: “Phân tách bằng các phương pháp sắc kí và nghiên cứu một số tính chất của ribonuclease từ nọc rắn hổ mang”. 2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU - Đánh giá khả năng tách chiết và làm sạch enzyme RNase bằng các phương pháp sắc kí. - Nghiên cứu một số tính chất cơ bản của enzyme. 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Đối tượng: RNase từ nọc rắn hổ mang. - Phạm vi nghiên cứu: Sử dụng các phương pháp sắc kí để phân tách và làm sạch enzyme RNase từ nọc rắn hổ mang, và nghiên cứu một số tính chất của enzyme này. 4 4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thực nghiệm và áp dụng các biện pháp phân tách hiện đại (bằng máy sắc kí) và các phương pháp nghiên cứu động học xúc tác enzyme. 5. GIẢ THIẾT KHOA HỌC - RNase có một ý nghĩa hết sức to lớn đối với nhiều loại bệnh trong Y học. Ngoài chức năng tiêu hóa và tham gia (trực tiếp hay gián tiếp) các hoạt động sao mã, phiên mã, sinh tổng hợp protein, các RNase còn thực hiện nhiều vai trò trong phòng chống virus, vi khuẩn, kháng giun… Nồng độ và hoạt tính của RNase trong dịch bào và các dịch thể có liên quan đến trạng thái bệnh lý của nhiều loại bệnh khác nhau: Nồng độ enzyme tăng là kết quả của phản ứng cơ thể chống lại bệnh tật (ví dụ: Bệnh tăng bạch cầu tủy mãn tính, hội chứng mệt mỏi kinh niên đã phát hiện thấy lượng RNase tăng lên trong các tế bào ngoại vi). - Trong tương lai nhiều dạng RNase vẫn sẽ được nghiên cứu để tạo ra các loại thuốc tác động hiệu quả lên khối u. Nhiều bệnh hiểm nghèo được phòng chống và chữa trị hiệu quả. 5 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ NHÓM RNASE 1.1. Lịch sử nghiên cứu RNase (RNase) bắt đầu được nghiên cứu từ năm 1920 khi Walter Jones phát hiện ra một chất tác từ tuyến tụy có khả năng thủy phân acid nucleic của nấm men, mặc dù vào thời điểm này cấu trúc hóa học của acid nucleic nói chung và acid ribonucleic (ARN) nói riêng còn chưa được biết đến. Sau đó Dubos và Thompson khi tinh sạch ARN cũng phát hiện ra chất này và đặt tên là RNase vì chúng tham gia vào quá trình depolymer hóa ARN. Tới năm 1940, Kunitz đã kết tinh được RNase, tạo điều kiện thuận lợi cho các nghiên cứu sau này. Vào đầu những năm 1950, ba nhà khoa học Salganik (Liên Xô), Bernet (Úc), Leclerk (Bỉ) đã tiến hành những thử nghiệm đầu tiên về khả năng chữa bệnh virus bằng nuclease nói chung và RNase nói riêng [6461]. Kết quả bước đầu cho thấy các enzyme này có khả năng kìm hãm sự phát triển của một số loại virus gây bệnh như ospovaxin, herpes, adenovirus (chứa ADN) hay virus viêm não, viêm tủy, virus cúm (chứa ARN). Năm 1958, Sie Kevitz Palade đã xác định nơi khư trú của enzyme này là tuyến tụy nhờ kỹ thuật kháng thể huỳnh quang. Những năm 1960-1970 nhờ ưu thế về nguồn vật liệu, khả năng tinh chế cũng như kích thước phân tử nhỏ (~ 14kDa), RNase tuyến tụy bò (RNase A, EC 3.1.27.5) trở thành mô hình mẫu trong các nghiên cứu về enzyme nói riêng và nghiên cứu về protein nói chung. RNase A là enzyme đầu tiên được xác định trình tự amino acid và là enzyme thứ 3 được xác định cấu trúc 3D (sau lysozyme và carboxy-peptidase A). Vào năm 1972 giải thưởng Nobel hóa học đã được trao cho Stanford Moor, William Stein và Christian Anfinsen với những công trình nghiên cứu của họ về RNase. Năm 1984 Bruce Merifield đã vinh dự nhận giải thưởng cao quý này với công trình nghiên cứu cũng liên quan đến RNase A [50, 51, 52]. Từ những năm cuối thập kỷ 80 tới nay, nhiều nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu theo hướng ứng 6 dụng của RNase đã được tiến hành song song và liên quan chặt chẽ với nhau, đặc biệt là những nghiên cứu về mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng sinh học của các RNase. Kết quả các nghiên cứu này đã mở ra triển vọng cho nghiên cứu nhằm sản xuất ra các dược phẩm mới trên cơ sở RNase có khả năng chữa trị các bệnh hiểm nghèo như ung thư và các bệnh do virus [13, 18, 28, 40, 41, 50]. 1.2. Tính đặc hiệu cơ chất và cơ sở phân loại RNase Tính đặc hiệu cơ chất là điểm khác biệt chủ yếu giữa enzyme với các chất xúc tác khác cũng như giữa enzyme này với enzyme khác. Nhóm nuclease tham gia trực tiếp vào quá trình trao đổi chất của acid nucleic. Chúng được đặc trưng bởi tính đặc hiệu cơ chất rộng và che phủ (chồng chéo) nhau. Việc phân loại các nuclease rất khó khăn và không thống nhất. Ngoài các phản ứng thủy phân, các enzyme thuộc nhóm này còn tham gia xúc tác các phản ứng chuyển nhóm: RNase tụy tạo thành 2’,3’-monophosphate vòng nhờ phản ứng chuyển vị nhanh hơn khoảng 1000 lần so với phản ứng thủy phân ở giai đoạn sau của phản ứng tạo thành 3’-monophosphate [26]. Trong hệ thống phân loại enzyme năm 1964, enzyme này cũng được xếp vào nhóm transferase (EC 2.7.7.16 và EC 2.7.7.17). Việc phân loại này không hợp lí vì deoxyRNase (DNase) có cùng chức năng sinh học với RNase là thủy phân acid nucleic lại được xếp vào nhóm hydrolase (EC 3.1.4.6) [25]. Những nghiên cứu tiếp theo chỉ ra rằng sự khác biệt này chỉ là tương đối, tùy thuộc vào từng enzyme cụ thể. Ví dụ ở một số vi khuẩn tốc độ chuyển nhóm và thủy phân của RNase là tương đương nhau nên các chất trung gian (nucleotide vòng) không được tích lũy trong quá trình phản ứng. Để đặc trưng cho tính đặc hiệu của một enzyme bất kỳ thuộc nhóm nuclease, Laskovski đã đưa ra các dấu hiệu (tương đối không phụ thuộc) khác nhau [20, 23, 24]. 1. Theo tính đặc hiệu của gốc đường cấu trúc nên nucleotide, nuclease được phân chia thành hai nhóm lớn: RNase và DNase. 2. Theo vị trí liên kết bị thủy phân, nuclease được phân chia thành exonuclease và endonuclease. 7 3. Theo sản phẩm thủy phân: Liên kết phosphodiester bị thủy phân từ phía nào của phân tử ARN, tạo thành sản phẩm 5’-phosphate hay 3’-phosphate. Một số exonuclease chỉ tác động vào phân tử polynucleotide từ phía đầu 3’, số khác lại chỉ tác động vào phía đầu 5’. 4. Theo tính đặc hiệu với bazơ trong đơn vị nucleotide liền kề với nucleotide bị thủy phân: Tính đặc hiệu này của nhiều enzyme là không đáng kể. Chẳng hạn các RNase thực vật và Escherichia coli (EC 3.1.27.1) thủy phân các liên kết theo vị trí 3’ của cả purine và pyrimidine nucleotide; RNase tuyến tụy (EC 3.1.27.5) chiếm vị trí trung gian: Thủy phân các liên kết theo vị trí 3’ của pyrimidine nucleotide bất kỳ. Trong khi đó, enzyme mã số EC 3.1.27.3 là endonuclease đích thực, thủy phân ARN ở vị trí 3’ của gốc Guanine nucleotide. 5. Tính đặc hiệu cấu trúc: mạch đơn hay mạch kép (đa số các nuclease thể hiện độ đặc hiệu cao theo dấu hiệu này). 6. Tính đặc hiệu trình tự nucleotide… Một số dấu hiệu trên được tính đến trong hệ thống phân loại enzyme vào năm 1978. Trong hệ thống phân loại mới này, 14 phân nhóm nuclease được đưa vào để phân loại nuclease tốt hơn. Chắc chắn trong thời gian tới hệ thống phân loại nuclease nói chung và RNase nói riêng còn thay đổi khi cấu trúc và chức năng của nhiều enzyme được phát hiện thêm [20]. Tuy vậy, trong mọi trường hợp một RNase (hay nuclease) bất kỳ mà ta quan tâm luôn nằm trong sơ đồ chung phân loại nuclease như sau: - Phân loại nuclease dựa trên tính đặc hiệu cơ chất, phân biệt: + DNase (thủy phân ADN). + RNase (thủy phân ARN). + Nuclease hỗn tạp hay không đặc hiệu (theo gốc) đường thủy phân cả ADN và ARN. - Phân loại nuclease dựa trên vị trí liên kết bị thủy phân, phân biệt: + Endonuclease. + Exonuclease 8 . 3’-exonuclease. . 5’-exonuclease. 1.3. Cơ chế xúc tác của RNase Phản ứng hóa học mà RNase xúc tác là phản ứng thủy phân liên kết phosphodiester trong phân tử acid nucleic. Quá trình thủy phân ARN do RNase xúc tác xảy ra qua 2 giai đoạn theo cơ chế xúc tác kiềm - acid chung với sự tham gia của 2 gốc His-12 và His-119 [20, 26, 37, 47, 51, 52]. - Giai đoạn 1: Phân cắt chuỗi polymer tạo ra sản phẩm trung gian là phosphate vòng mà không giải phóng nhóm acid. Trong giai đoạn này, His-12 đóng vai trò là chất xúc tác kiềm chung (nhận proton H + ở vị trí 2’) His-119 đóng vai trò là acid chung (proton hóa nhóm đi khỏi RNA-O-) diễn ra khá nhanh. - Giai đoạn 2: Giải phóng nhóm acid thứ hai thuộc gốc phosphate trong quá trình thủy phân dẫn xuất phosphate vòng. Giai đoạn này diễn ra chậm hơn trong đó vai trò của hai gốc His-12 và His-119 lại ngược lại. His-119 tương tác với H 2 O theo cơ chế xúc tác kiềm chung (nhận proton) còn His-12 đảm nhận việc proton hóa nhóm đi khỏi (sản phẩm) ở vị trí C-2’. 2. CẤU TRÚC PHÂN TỬ CỦA RNASE RNase A là một enzyme có khối lượng phân tử nhỏ (~ 14 kDa) được cấu tạo từ một mạch polypeptide từ 124 gốc amino acid, trong thành phần amino acid của nó có 19 trong tổng số 20 loại amino acid có trong protein (không có amino acid Trytophan). Công thức phân tử ở dạng không tích điện của RNase A là C 575 H 907 N 171 O 192 S 12 với khối lượng phân tử chính xác M r = 13686 Da [50, 51, 52]. Về hình dạng, RNase A giống như quả thận, các gốc amino acid của trung tâm hoạt động nằm trong vùng “hốc” (cleff) - là vùng lõm của quả thận [51]. Cấu trúc bậc hai điển hình của RNase A gồm 4 phiến cấu trúc  nằm song song ngược chiều kề bên cạnh 3 chuỗi xoắn  ngắn. Trong phân tử có 4 cầu nối disulfide được tạo thành từ 8 gốc Cysteine ở các vị trí 26-84, 40-95, 58-110 và 65-72. Các cầu nối này có thể bị phá vỡ bởi lượng -mercaptoethanol dư thừa, tạo thành 8 nhóm SH tự do dẫn tới sự biến tính và làm mất hoạt tính của enzyme [26, 51]. 9 Hầu hết các RNase thuộc siêu họ RNase A đều có cấu trúc monomer, duy chỉ có RNase trong tinh dịch bò (BS-RNase) có cấu trúc bậc 4 (dimer) [15, 17]. BS- RNase được tách ra ở dạng dimer trong đó hai tiểu đơn vị thành phần nối với nhau bởi hai cầu disunfide [1917]. Enzyme này là một đồng đẳng của RNase A, ở trạng thái cân bằng một hỗn hợp gồm 2 cấu trúc bậc IV hoàn toàn khác nhau [36]. Trung tâm hoạt động của RNase A ngoài hai nhóm chức tham gia trực tiếp vào quá trình xúc tác là nhóm imidazol của các gốc His-12 và His-119 (trong đó một nhóm đóng vai trò như một acid, một nhóm đóng vai trò như một bazơ trong quá trình xúc tác) còn có mạch bên của các gốc Lys-7, Lys-41, Lys-66, Asp-121 và mạch carbon chính của gốc Phe và Gly-11 [13, 20, 28]. 3. TÍNH ĐA HÌNH PHÂN TỬ CỦA RNASE TRONG TẾ BÀO Nhiều công trình nghiên cứu về RNase tiến hành ở trên các nhóm sinh vật từ dạng có cấu tạo đơn giản như vi khuẩn đến các sinh vật bậc cao như con người đã cho thấy sự muôn hình muôn vẻ của các enzyme thuộc nhóm này. Trong một cá thể có tồn tại nhiều dạng RNase khác nhau, ví dụ ở vi khuẩn E.coli có tới 20 loại RNase [46]; trong nọc rắn hổ mang Ấn Độ chứa 2 dạng RNase liên hợp-phân li (phụ thuộc vào nồng độ NaCl) [42]; các kết quả nghiên cứu ban đầu ở Việt Nam cho thấy cũng tồn tại ít nhất 2 dạng RNase khác nhau trong nọc rắn hổ mang Việt Nam [5, 7]. Ở người, tới nay đã phát hiện được 8 enzyme khác nhau thuộc siêu họ RNase A. Chúng được đánh số từ 1 đến 8 để phân loại dựa trên sự khác biệt về cấu trúc và chức năng sinh học. Các gen mã hóa cho các protein này liên kết với nhau trên cánh tay dài của nhiễm sắc thể số 14 [61]. Dưới đây là những đặc điểm chính của nhóm RNase ở người thuộc siêu họ RNase A. 3.1. RNase 1 RNase này có nhiều ở các cơ quan khác nhau trong cơ thể nhưng có nhiều nhất ở tuyến tụy. Trình tự amino acid tương đồng tới 70% so với RNase A. Chức năng chính của RNase 1 là tiêu hóa - thủy phân ARN trong thức ăn [55, 61]. 3.2. RNase 2 (EDN - eosinophil derived neurotoxin) 10 RNase 2 đầu tiên được phát hiện là một độc tố thần kinh có nguồn gốc từ các tế bào bạch cầu ưa acid nên còn được gọi là EDN. Đây là 1 trong 2 protein của tế bào lympho có hoạt tính ribonucleolytic. Một số gốc amino acid như: Gly-2, Lys- 66, Lys-7, Arg-10, Phe-120, Asp-14 bị thay đổi không bảo thủ đóng vai trò quan trọng về chức năng; các gốc amino acid His-12, His-119, Lys-41 và nhiều gốc khác được giữ lại tạo nên trung tâm hoạt động (TTHĐ) của phân tử enzyme [55, 61]. 3.3. RNase 3 (ECP - eosinophil cationic protein) Cũng giống như RNase 2, RNase 3 đầu tiên được phát hiện là protein mang điện dương của tế bào bạch cầu ưa acid, điểm đẳng điện của protein này là pI = 10,8 (enzyme này là một protein rất kiềm) và tương đồng tới 70% với RNase 2. ECP là RNase người đầu tiên có hoạt tính kháng khuẩn, kháng côn trùng và độc với tế bào thần kinh. Hoạt tính nuclease của ECP thấp hơn nhiều so với RNase 2 nhưng các đặc tính xúc tác bình thường thì gần như không đổi so với RNase 2. Tuy vậy hoạt tính ribonucleolytic của ECP lại không cần thiết cho hoạt tính kháng khuẩn [22, 55, 61]. 3.4. RNase 4 RNase 4 có trình tự amino acid tương đồng 43% với RNase 1, 31% với RNase 2 và 30% với RNase 3. Enyme này cũng tương đồng với RNase gan bò và gan lợn tới 90%, điều này chứng tỏ tính bảo thủ của RNase là rất lớn [55, 61]. 3.5. RNase 5 (Angiogenin) Angiogenin có trọng lượng phân tử là 14 400 Da và giống RNase A tới 65% về trình tự amino acid, 3 trong 4 cầu disunfide và các gốc amino acid chức năng chủ yếu trong TTHĐ của RNase vẫn được bảo tồn ỏ angiogenin. So với RNase 1, 2 và 4 thì trình tự amino acid của angiogenin tương đồng lần lượt là 35%, 27% và 39%. Angiogenin có tính đặc hiệu yếu với cơ chất chuẩn của RNase nhưng bù lại, hoạt tính ribonucleolytic của angiogienin lại rất quan trọng trong việc hình thành mạch máu mới [61]. 3.6. RNase 6 (RNase K6) [...]... nghiên cứu một số tính chất hoá lý và xúc tác của RNase từ nọc rắn hổ mang ở Việt Nam 3.1 KẾT QUẢ PHÂN TÁCH RNASE NỌC RẮN BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ 3.1.1 Kết quả phân tách RNase nọc rắn bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion Như chúng ta biết rằng các protein khác nhau có điện tích tổng số khác nhau và sự khác biệt trong điện tích bề mặt là cơ sở để phân tách các protein khác nhau bằng phương pháp sắc. .. viêm… 5.2 Một vài đặc điểm và tính chất quan trọng của RNase tách từ nọc rắn Theo các nghiên cứu về RNase tách từ nọc của loài rắn hổ mang vùng Trung Á của Liên Xô trước đây và Ấn Độ thì hoạt tính RNase trong nọc của ba loài rắn ở vùng Trung Á và Liên Xô là Vipera, Leleetina, Naja oxiana và Echiscorinatus có thể khác biệt nhau tới 10 lần, trong đó RNase của Naja oxiana có hoạt tính cao nhất Các tác giả... ít được nghiên cứu Cho đến nay chỉ có RNase từ nọc rắn hổ mang của Ấn Độ là nhận được ở dạng có độ sạch cao Còn RNase từ nọc rắn của các loài hổ mang khác mới chỉ được làm sạch một phần RNase từ nọc rắn hổ mang ở nước ta vẫn chưa được nghiên cứu, ứng dụng vì vậy những đặc tính của enzyme này như pHopt, độ bền nhiệt, khả năng hấp thụ trên các loại gel như gel Ca-P, khả năng tương tác với chất mang trao... cho enzyme vào hỗn hợp phản ứng chứa cơ chất) [1] 20 2.2.2 Các phương pháp sắc kí phân tách RNase nọc rắn hổ mang 2.2.2.1 Phương pháp sắc ký trao đổi ion trên cột SP Sepharose 4 Fast Flow - Cơ sở: Phương pháp sắc kí trao đổi ion dựa trên cơ sở của phản ứng tương tác tĩnh điện ion - ion giữa protein-enzyme tan trong dung dịch đệm loãng với nhựa trao đổi ion (chất mang) , cụ thể là sự phân tách các protein... 3.2 Sắc kí đồ phân tách RNase nọc rắn hổ mang trên cột SP Sepharose 4 Fast Flow ở giá trị pH = 4,0 (A là hoạt tính RNase /phân đoạn, U; Pr là protein, mAU/ml) Tổng hợp kết quả phân tách RNase nọc rắn hổ mang được tóm tắt trong bảng 3.3 32 Bảng 3.3 Kết quả phân tách RNase nọc rắn hổ mang ở pH 4,0 Từ sắc kí đồ trên hình 3.2 ta thấy hầu như cả 5 đỉnh RNase này đều trùng với các đỉnh protein trong các TT... phân tử đều chưa được biết đến Trong giới hạn khoá luận này, chúng tôi mới bước đầu nghiên cứu một số tính chất hoá lý và xúc tác cơ bản của enzyme và sử dụng một số phương pháp kỹ thuật thông thường được áp dụng để tinh chế và làm sạch protein nói chung và enzyme nói riêng nhằm tách RNase ra khỏi các protein khác của nọc rắn hổ mang với mục đích tìm quy trình sơ bộ để làm sạch enzyme này Sau đó nghiên. .. stearic và taurin Nọc rắn: glycoprotein thrombin, lipase và 3 loại chất chống đông Nọc rắn mới tiết ra là một chất lỏng trong, màu hơi vàng với tỉ trọng 1,01 1,03 và độ dính cao, hàm lượng nước lên tới 70-80% Sau 24h nọc rắn có thể bị biến chất Nếu làm khô, nọc rắn sẽ ở dạng tinh thể nhỏ, màu răng và giữ nguyên tính độc hàng chục năm Về thành phần, nọc rắn là hỗn hợp của nhiều chất có hoạt tính sinh... tổng số bề mặt của protein lại phụ thuộc rất mạnh vào pH của môi trường Do đó một trong các vấn đề đặt ra khi sử dụng phương pháp sắc kí trao đổi ion để phân tách một enzyme ra khỏi hỗn hợp protein phức tạp là tìm giá trị pH mà tại đó sự phân tách đạt hiệu quả tốt nhất Chính vì vậy mà một trong những nhiệm vụ quan trọng của luận văn là tối ưu hoá điều kiện phân tách enzyme RNase của nọc rắn hổ mang. .. của phân tử protein - enzyme Để nghiên cứu mối phụ thuộc hoạt 26 tính của enzyme vào pH (và cả tìm pHopt của các chế phẩm RNase nọc rắn hổ mang tương ứng với các đỉnh RNase đã nhận được), chúng tôi tiến hành đo hoạt tính của enzyme theo phương pháp đã mô tả ở trên trong hỗn hợp đệm Gly - Citrate Phosphate –Tris 40 mM tại các giá trị pH trong vùng pH = 1  9, với các giá trị pH khác nhau cách nhau từ. .. thấy được trên sắc kí đồ, thì chúng tôi cũng loại bỏ (thường loại bỏ những đỉnh có chiều cao không quá 1 mAU) 2.2.3 Các phương pháp nghiên cứu một số tính chất của RNase nọc rắn hổ mang 2.2.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH dung dịch đệm lên hoạt tính enzyme pH dung dịch đệm ảnh hưởng rất mạnh lên phản ứng enzyme nói chung và phản ứng thủy phân nói riêng, vì nó ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme . văn của tôi có tiêu đề: Phân tách bằng các phương pháp sắc kí và nghiên cứu một số tính chất của ribonuclease từ nọc rắn hổ mang . 2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU - Đánh giá khả năng tách chiết và. phương pháp sắc kí để phân tách và làm sạch enzyme RNase từ nọc rắn hổ mang, và nghiên cứu một số tính chất của enzyme này. 4 4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thực nghiệm và áp dụng các biện pháp. RNase bằng các phương pháp sắc kí. - Nghiên cứu một số tính chất cơ bản của enzyme. 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Đối tượng: RNase từ nọc rắn hổ mang. - Phạm vi nghiên cứu: Sử dụng các