1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Hiện nay tốc độ phát triển kinh tế ngày càng mạnh, đời sống vật chất và tinh thần ngày càng tăng cao, kéo theo đó là sự phát triển nhanh của một số loại bệnh có tác động xấu đến chất lượng cuộc sống của con người. Trong số đó có tình trạng thừa cân, BP và ĐTĐ. Béo phì là tình trạng tích lũy mỡ quá mức và không bình thường tại một vùng cơ thể hay toàn thân đến mức ảnh hưởng đến sức khỏe như: bệnh tim mạch, tăng huyết áp, rối loạn lipid máu, tiểu đường, đột quỵ, giảm khả năng sinh sản, giảm chức năng hô hấp, tăng viêm xương, khớp, ung thư, bệnh đường tiêu hóa, ….[16]. Đái tháo đường (Diabetes mellitus) là một trong những bệnh rối loạn chuyển hóa có mức tăng nhanh chóng trong thời gian gần đây cả về số lượng cũng như chi phí điều trị, ngày càng trở thành gánh nặng về kinh tế và xã hội đối với nhiều quốc gia trên thế giới. Đái tháo đường với biểu hiện chung nhất là tăng glucose huyết do tế bào β của đảo tụy Langerhan bị phá hủy mất khả năng sản xuất insulin (ĐTĐ typ I) hoặc do rối loạn trao đổi lipid-glucid dẫn đến đối kháng insulin (ĐTĐ typ II) [1]. Bệnh đái tháo đường và BP có quan hệ chặt chẽ, trong đó ĐTĐ là hậu quả của BP (Obesity) và thừa cân quá mức [24]. Y học hiện đại đã cho ra đời nhiều loại thuốc chữa ĐTĐ hiệu quả như insulin, biguanid… Tuy nhiên các loại thuốc này có nhiều tác dụng phụ và chi phí điều trị đắt đỏ. Chính vì thế, WHO khuyến cáo nghiên cứu phát triển các loại thuốc có nguồn gốc từ thảo dược, với ưu điểm là nguồn dược liệu sẵn có, dễ sử dụng, 2 giá thành rẻ, ít tác dụng phụ, dễ được cộng đồng chấp nhận, đặc biệt là các nước kém phát triển và đang phát triển. Thực tế có nhiều loại thảo dược có khả năng hỗ trợ điều trị bệnh BP và ĐTĐ. Trong đó cây rau muống, một thực phẩm quen thuộc ở nhiều quốc gia trên thế giới đã được nghiên cứu chứng tỏ về khả năng điều trị ĐTĐ rất tốt. Điển hình là các nghiên cứu ở Trung Hoa, Vienna (Áo), Viện Đại Học North Carolina State University [6]… Ở nước ta, những nghiên cứu về các dược liệu điều trị bệnh ĐTĐ và BP được bắt đầu từ khoảng 5 năm trở lại đây [15], [16], [18], đáng chú ý là ở 4 trung tâm lớn: Đại học Y Hà Nội, Đại học Dược Hà Nội, Đại học Quốc Gia Hà Nội và Viện Dược Liệu Trung Ương. Các nhà nghiên cứu Việt Nam đã chứng minh được tác dụng hạ đường huyết của nhiều dược liệu, trong đó có những vị thuốc cổ truyền lâu đời như Mướp đắng, Thổ phục linh, và những cây thuốc hoàn toàn mới phân bố rất nhiều tại Việt Nam. Không chỉ dừng ở những nghiên cứu sàng lọc tác dụng của chất hoạt tính từ thực vật trên động vật thí nghiệm, nhiều nghiên cứu đã bước đầu đi vào tách, tinh chế các thành phần hoạt chất từ những dược liệu có tác dụng chữa bệnh ĐTĐ. Gần đây, các nghiên cứu bước đầu đã cho thấy một số hoạt chất trong các phân đoạn dịch chiết của vài loài thực vật thuộc họ chua me (Oxali daceae), Tử vi (Lythra ceae), họ Cam chanh (Rutaceae) có chất lượng cao trong điều trị bệnh BP và ĐTĐ. Ở Việt Nam cây rau muống cũng được biết đến trong việc chữa một số bệnh giải nhiệt, giải độc, thông máu bổ máu, lợi tiểu, nhuận trường …trị các chứng đau dạ dày, xuất huyết, máu cam… [7]. Tuy nhiên việc nghiên cứu đặc tính hóa sinh, y dược của các hoạt chất thiên nhiên từ đối tượng này chưa được nghiên cứu một cách thỏa đáng. Chính 3 vì vậy chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu một số đặc tính sinh dược học của dịch chiết từ cây rau muống (Ipomoea aquatica Forsk.)” 2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu tách chiết một số đặc tính sinh dược học của dịch chiết từ cây rau muống (Ipomoea aquatica Forsk.) 3. Nội dung nghiên cứu - Tạo mô hình chuột BP và gây ĐTĐ. - Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của một số phân đoạn dịch chiết từ cây rau muống (Ipomoea aquatica Forsk.) trên mô hình chuột gây ĐTĐ bằng STZ. - Đánh giá khả năng ổn định rối loạn trao đổi glucid-lipid của một số phân đoạn dịch chiết từ cây rau muống (Ipomoea aquatica Forsk.) trên chuột ĐTĐ thực nghiệm. 4. Đóng góp mới của đề tài Cung cấp một số dẫn liệu khoa học về thành phần hóa học, hàm lượng các nhóm hợp chất hữu cơ, khả năng chống BP của phân đoạn dịch chiết từ cây rau muống (Ipomoea aquatica Forsk.) 4 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Hợp chất thứ sinh thực vật Ở thực vật, ngoài protein, saccarid, lipid, vitamin, còn có những chất khác có vai trò quan trọng trong trao đổi chất của cây được gọi là các chất thực vật thứ sinh (plant secondary metabolites). Căn cứ vào tính chất hóa học, các hợp chất thực vật thứ sinh được chia thành một số nhóm chính như: nhóm phenolic, nhóm terpen và nhóm alkaloid. 1.1.1. Hợp chất phenolic Dựa vào thành phần và cấu trúc người ta chia hợp chất phenolic thành 3 nhóm nhỏ [25]. Nhóm hợp chất phenolic đơn giản: Trong phân tử chỉ có một vòng benzene và một vài nhóm hydroxyl. Tùy thuộc vào số lượng nhóm OH mà chúng được gọi là các monophenol (phenol), diphenol (pyrocatechin, hydroquynone), triphenol (pyrogalol, oxyhydroquynol…). Nhóm hợp chất phenolic phức tạp: Trong thành phần cấu trúc phân tử của chúng ngoài vòng thơm benzene (C 6 ) chúng còn có dị vòng, mạch nhánh. Đại diện nhóm này có axid cyamic, axid ceramic. Nhóm hợp chất phenolic đa vòng: Là nhóm đa dạng nhất trong các hợp chất phenol, có cấu trúc phức tạp do sự liên kết hoặc trùng hợp của các đơn phân. Ngoài gốc phenol còn có các nhóm phụ dị vòng mạch nhánh hoặc đa vòng. Nhóm này có flavonoid, tannin và coumarin . 1.1.1.1. Flavonoid thực vật Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực vật, phần lớn có màu vàng. 5 Flavonoids là một chuỗi polyphenolic gồm có 15 nguyên tử cacbon và hai vòng benzen liên kết bởi một đường thẳng có 3 cacbon. Flavonoid gồm 2 vòng thơm và một vòng pyran *Hoạt tính sinh học của flavonoid Tác dụng chống oxy hóa (antioxidant): flavonoid có khả năng kìm hãm các quá trình oxy hóa dây truyền sinh ra bởi gốc tự do hoạt động. Những flavonoid có các nhóm hydroxyl sắp xếp ở vị trí octo dễ dàng bị oxy hóa dưới tác dụng của các enzyme polyphenoloxydase và peroxydase tạo thành dạng semiquinon hoặc quinon. 6 O 2 + Flavonoid (dạng khử) polyphenoloxydase Flavonoid (dạng oxy hóa) (dạng Hydroquinon) (Semiquinon hoặc Quinon) H 2 O 2 + Flavonoid (dạng khử) Peroxydaxe Flavonoid (dạng oxy hóa) (dạng Hydroquinon) (Semiquinon hoặc Quinon) +H 2 O - Flavonoid có khả năng điều hòa hoạt động enzyme do khả năng liên kết với nhóm amin trong phân tử protein, làm thay đổi cấu hình không gian của enzyme do đó tạo hiệu ứng điều hòa dị lập thể. - Flavonoid có tính kháng khuẩn, kháng virut, tăng khả năng đề kháng của cơ thể do kích thích lympho bào, tăng sản xuất interferon, ức chế hiện tựơng thoát bọng (digramilation). - Flavonoid có hoạt tính của vitamin pp, làm tăng tính bền và đàn hồi của thành mạch, giảm sức sống của mao mạch. - Flavonoid có tác dụng chống ung thư do kìm hãm các enzyme oxy hóa khử, quá trình đường phân và hô hấp, kìm hãm phân bào, phá vỡ cân bằng trong quá trình trao đổi chất của tế bào ung thư. - Tác dụng giảm BP và lipid máu - Tác dụng hạ glucose huyết 1.1.1.2. Tannin thực vật Tannin (tannin , tannoid) là một chất làm se, có mặt trong cấu trúc tế bào thực vật. chúng có thể là một dạng polyphenolic đóng vai trò là hợp chất liên kết và kết tủa protein cũng như các hợp chất hữu cơ khác nhau bao gồm cả axit amin và alkaloids. Các hợp chất tannin được phân phối rộng rãi ở nhiều loài thực vật. Chúng đóng một vai trò quan trọng trong bảo vệ thực vật chống lại sự ăn thịt. Đồng thời góp phần quy định tăng trưởng thực vật. Tương tự như vậy, sự phá hủy hoặc sửa đổi của các tannin với thời gian đóng một vai trò quan trọng trong quá trình chín của trái cây. 7 Tannin được tìm thấy ở các loài trong thế giới thực vật. Tannin được tìm thấy trong lá, chồi, hạt, rễ, và các mô gốc. Trong tế bào gốc tannin thường được tìm thấy trong các giai đoạn tăng trưởng của cây, chẳng hạn như phloem và xylem thứ cấp và lớp giữa vỏ và lớp biểu bì. Tannin có thể giúp điều chỉnh sự phát triển của các mô. Các polyphenol có nhiều nhất là tannin cô đặc , được tìm thấy trong hầu như tất cả các cơ quan thực vật, chiếm 50% trọng lượng khô của lá.Tannin có trọng lượng phân tử khác nhau, từ 500 đến hơn 3.000 ( axit galic este ) và lên đến 20.000 (proanthocyanidins). Tannin là không tương thích với chất kiềm , gelatin , kim loại nặng, sắt , nước chanh , muối kim loại, chất oxy hóa mạnh và sulfat kẽm. Cơ sở Đơn vị: Gallic axit Flavone Phloroglucinol Các đơn vị cấu thành chính của tanin 1.1.1.3. Hợp chất coumarin Coumarin là chất của α-purone có cấu trúc C 6 - C 3 dị vòng chứa oxy. Coumarin kết tinh không màu hoặc màu vàng nhạt, vị đắng, cay, có mùi thơm [30]. Tính chất hóa học đặc trưng là dễ dàng kết hợp với đường glucose tạo thành glycosid dễ tan trong nước. 8 Coumarin Coumarin sử dụng trong đời sống hằng ngày như làm nước hoa, hương liệu, làm chất chống đông máu và chất diệt loài nhặm nhấm. Trong y học dẫn xuất của coumarin có tác dụng chống co thắt, giãn nở động mạch vành, làm bền và bảo vệ thành mạch, ngăn cản đột quỵ. Một số coumarin khác có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng khối u, trừ giun sán và giảm đau. 1.1.2. Alkaloid Alkaloid là hợp chất chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng và có tính kiềm, thường gặp ở thực vật và động vật. Đa số các alkaloid thành phần chứa oxy ở thể rắn (cafein), không có oxy thường ở thể lỏng dễ bay hơi (nicotin). Alkaloid thường không có màu, không mùi và vị đắng. Một số alkaloid có màu vàng như berberin, palmitin. Các alkaloid ở dạng base thường không tan trong nước [40]. N N N N CH 3 CH 3 CH 3 O O C affein O N H H OH OH M o rp h ine N N CH 3 Nicotin 9 Alkaloid có tính kiềm yếu, do các mạch cacbon chứa nitơ quyết định. Chúng phản ứng với một số thuốc thử đặc trưng như: Bouchardat (kết tủa nâu sẫm), Vans-Mayer (kết tủa trắng vàng) hay Dragendroff (cam). Có khoảng 20% loài thực vật có hoa có khả năng sinh alkaloid. Trong y học nhiều thuốc chữa bệnh có thành phần alkaloid như thuốc gây kích thích hoặc ức chế hệ thần kinh trung ương, thuốc điều hòa huyết áp, chữa rối loạn nhịp tim…. Một số nghiên cứu gần đây cho thấy các alkaloid chiết từ thực vật cũng có tác dụng hạ glucose huyết như: Berberin (Tinosporacordifolia, Coptis sinensis), Casuarine 6-O-α- glucoside (Syzygium malaccense). 1.1.3. Steroid Steroid là một loại hợp chất hữu cơ có chứa một sự sắp xếp đặc trưng của bốn vòng cycloalkane được nối với nhau. Ví dụ về các steroid bao gồm các chất béo ăn cholesterol, hormon sinh dục estradiol, testosterone, và thuốc chống viêm dexamethasone. Lõi của steroid bao gồm 20 nguyên tử cacbon liên kết với nhau mang hình thức của bốn vòng hợp nhất: ba vòng cyclohexane (được xem như là vòng A, B, và C) và một vòng cyclopentane (vòng D). Các steroid khác nhau đối với từng nhóm chức năng gắn liền với cốt lõi bốn vòng và oxi hóa của các vòng. Steroid là các hợp chất béo hữu cơ hòa tan có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp, có công thức từ 17 nguyên tử cacbon sắp xếp thành 4 vòng và bao gồm cả các sterol và axit mật, thượng thận, và kích thích tố giới tính. Một số steroid có nguồn gốc thiên nhiên như: hợp chất digitalis và các tiền chất của một số loại vitamin nhất định. Steroid rất đa dạng và phong phú, bao gồm các hình thức của một số loại vitamin D, digitalis, sterol (ví dụ: cholesterol) và các axit mật. Các sterol là các dạng đặc biệt của các steroid, với một nhóm hydroxyl tại vị trí 3 và một khung lấy từ cholestane. Hàng trăm steroid 10 riêng biệt được tìm thấy ở thực vật, động vật và nấm. Tất cả các steroid được sản xuất ở các tế bào từ các sterol lanosterol (động vật và nấm) hoặc từ cycloartenol (thực vật). Cả lanosterol và cycloartenol lấy từ cyclization của triterpene squalene. 1.1.4. Terpen thực vật Terpen là nhóm hydrocacbon thực vật lớn và đa dạng nhất ,được hình thành từ quá trình polymer hóa các tiểu đơn vị isopren 5C (C 5 H 8 ) ,có công thức cấu tạo chung là (C 5 H 8 ) n .Trong thực vật terpen được tổng hợp thông qua con đường trao đổi chất acetate)/mevalonate hoặc con đường glyceraldehydes 3-phosphate/pyruvate. Hầu hết các terpen đều thuộc nhóm hydrocarbon, tuy nhiên chúng có thể bị khử hoặc bị oxy hóa để hình thành các hợp chất terpenoid khác nhau như alcohol, ketone, acid và aldehyd. 1.2. Bệnh béo phì (Obesity) Bệnh BP (obesity) được tổ chức y tế thế giới WHO định nghĩa là: tình trạng tích lỹ mỡ quá mức và không bình thường tại một vùng cơ thể hay toàn thân tới mức ảnh hưởng tới sức khỏe. Tổ chức này dùng chỉ số khối cơ thể BMI (Body Mass Index) để đánh giá tình trạng dư thừa hay thiếu hụt mỡ của mỗi người. [...]... bằng cách lấy 20 µl để định lượng tương tự như đã làm với mẫu chuẩn aicd gallic 2.2.3 Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết các phân đoạn cây rau muống (Ipomoea aquatica Forsk.) lên trọng lượng và một số chỉ số hóa sinh máu của chuột BP thực nghiệm 2.2.3.1 Thử độc tính cấp ,xác định LD50 Xác định LD50 của dịch chiết cây rau muống theo phương pháp Lorke.[17] Chuột nhịn đói trước 16 giời thí nghiệm được phân... 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Mẫu thực vật + Cây rau muống ( Ipomoea aquatica Forsk.) + Bộ phận sử dụng: thân, lá, ngọn của cây rau muống + Địa điểm thu mẫu : Phương Khoan - Sông Lô - Vĩnh Phúc Sấy khô ở 60ºC sau đó được ngâm kiệt trong Ethanol 90º thu dịch cao phục vụ cho các bước nghiên cứu Hình 2.1 cây rau muống (Ipomoea aquatica Forsk.) 2.1.2 Mẫu động vật Chuột bạch chủng Swiss nặng từ 18 - 20g... thu được các cao phân đoạn dịch chiết tương ứng 2.2.2 Phương pháp khảo sát thành phần hóa học của cây rau muống (Ipomoea aquatica Forsk.) 2.2.2.1 Định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên Cao các phân đoạn được hòa tan trong dung môi thích hợp với từng loại phản ứng định tính [21] Các nhóm phản ứng được trình bày tóm tắt trong bảng sau: Bảng 2.1 Bảng các phản ứng định tính đặc trưng Nhóm hợp chất Phản... phân tích một số chỉ số lipid máu Các số liệu được thu thập và tiến hành xử lý thống kê 2.2.4 Nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết cây rau muống chuột nhắt gây ĐTĐ bằng STZ Để tìm hiểu tác dụng hạ đường huyết của dịch chiết cây rau muống, trước tiên chúng tôi tiến hành gây mô hình chuột ĐTĐ mô phỏng type 2 dựa trên chế độ ăn giàu chất béo kết hợp với STZ liều đơn của Srinivasan [16, 19,... 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp tách chiết mẫu nghiên cứu Từ 3000g rau muống (Ipomoea aquatica Forsk.) Sấy khô được ngâm chiết với ethanol 90% ở nhiệt độ phòng 220c trong vòng 45 ngày (quá trình được lập lại 3 lần) Gộp các dịch chiết lại, lọc qua giấy lọc 3 lần và cất lại dung môi bằng cách chiếu đèn điện thu được cao tổng số ethanol được hòa tan 27 trong nước nóng và chiết lần lượt với... Hoạt động của nó trong tế bào làm tổn thương và alkyl hóa ADN và cuối cùng dẫn tới hoại tư tế bào Hoạt tính alkyl hóa của STZ do hoạt động của nhóm nitrosourea của nó, đặc biệt là ở vị trí 06 cuả guanine 1.6 Vài nét về cây rau muống (Ipomea aquatica Forssk.) 1.6.1 Giới thiệu Rau muống (Ipomoea aquatic) là một loài thực vật nhiệt đới bán thủy sinh thuộc họ Bìm bìm (Convolvulaceae), là loại rau ăn lá... của chuột ở các thời điểm khác nhau (2h, 4h, 8h, 10h) và tiến hành các xét nghiệm tiếp theo Sau đó tiếp tục điều trị cho chuột trong vòng 21 ngày (3 tuần) 2.2.4.2 Thử khả năng hạ glucose huyết của các phân đoạn dịch chiết từ cây rau muống trên mô hình chuột ĐTĐ type 2 Các lô chuột ĐTĐ type 2 (5 con/lô) được ăn thức ăn thường và điều trị hằng ngày bằng cách cho uống phân đoạn dịch chiết từ cây rau muống. .. đoạn dịch chiết từ cây rau muống với liều 2000mg/kg Đường huyết của các con chuột được đo vào cùng một thời điểm trong ngày và sau khi nhịn đói 12 giờ ở các ngày thứ 0 (trước khi điều trị), ngày thứ 5, 10, 15, 21 khi điều trị 32 Bảng 2.3 Mô hình nghiên cứu khả năng hạ glucose của các phân đoạn dịch chiết từ cây rau muống (Ipomoea aquatica Forsk.) Lô Chế độ ăn trước điều trị Tiêm Mục đích 1 Thức ăn chuẩn... dụng phương pháp hóa sinh - y dược Để định lượng đường huyết [38], [39] và một số chỉ số hóa sinh liên quan đến rối loạn trao đổi lipid [35] ở chuột trước và sau khi điều trị bằng các phân đoạn dịch chiết từ cây rau muống 2.2.5.1 Phương pháp định lượng glucose huyết * Nguyên tắc: Nguyên tắc hoạt động của phương pháp dựa trên chuỗi phản ứng tạo màu và được đo bằng phương pháp quang học để định lượng glucose... màu đỏ, mọng + Rau muống phao: Cấy xuống bùn, cho rau nổi trên mặt nước, cắt ăn quanh năm + Rau muống bè: Kết thành bè thả trên mặt nước ao, hồ, kênh, mương quanh năm, những tháng rét năng suất kém +Rau muống thúng: Trồng vào thúng có đất và phân, đặt lên giá cắm ở ao sâu để thúng nổi lên khoảng 1/4 chiều cao, cho rau bò kín mặt ao Các giống rau muống nước thường luộc ngon hơn xào hay ăn sống, giống trồng . đặc tính sinh dược học của dịch chiết từ cây rau muống (Ipomoea aquatica Forsk. ) 2. Mục đích nghiên cứu Nghiên cứu tách chiết một số đặc tính sinh dược học của dịch chiết từ cây rau muống (Ipomoea. (Ipomoea aquatica Forsk. ) 3. Nội dung nghiên cứu - Tạo mô hình chuột BP và gây ĐTĐ. - Đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của một số phân đoạn dịch chiết từ cây rau muống (Ipomoea aquatica Forsk. ). glucid-lipid của một số phân đoạn dịch chiết từ cây rau muống (Ipomoea aquatica Forsk. ) trên chuột ĐTĐ thực nghiệm. 4. Đóng góp mới của đề tài Cung cấp một số dẫn liệu khoa học về thành phần hóa học,